AULA CONT CITOMETRIA

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AULA - CONTINUAÇÃO DE CITOMETRIA DE FLUXO 
É o aparelho óptico eletrônico, onde tudo vai acontecer ali dentro. Tudo que passar dentro do aparelho de citometria de fluxo, vai aparecer no computador. Sinais ópticos de captação de luz são transformados em valores numéricos, fazendo com que consigamos ver pelo computador. Esse aparelho vem com 2 garrafas: uma para o seu conteúdo (do seu experimento) e a outra, para a solução de limpeza. No filete de metal, é que vou colocar meu tubinho (amostra) para ser analisada pelo citômetro. A amostra passa nesse filete e o resultado é transmitido pelo computador. 
Quando pensamos no ELISA, ele serve para detectar proteína. Na citometria também conseguimos. Qual a diferença? No ELISA vemos o que a célula está secretando. No citômetro há a separação das populações celulares. Ou seja:
C.F: é uma técnica para separar, contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido. 
CITRO – CÉLULA
METRIA – MEDIDA
FLUXO – MOVIMENTO
Quando você faz uma cultura de célula, não vai ser coletado o sobrenadante, mas as células que estão em cultura. Tiro essas células da cultura, coloco no tubinho e centrifugo. Quando centrifugo, forma-se o pelet. Não posso levar isso seco ao citômetro. Então diluo na solução salina. Levo para passar no filete de metal (bem fininho), coloco no tubinho, aperto o botão e o aparelho vai sugar as minhas células. Quando suga, vai ocorrer a incidência de um feixe luminoso. É passada uma célula por vez. A incidência frontal vai me dar o tamanho do componente biológico, e a incidência lateral, vai me dar a granulosidade. Ou seja:
O citômetro me dá 2 parâmetros: TAMANHO E GRANULOSIDADE. 
A principal vantagem é que esta tecnologia permite estudar várias características de uma célula de forma rápida e por vários parâmetros (multiparamétrica).
Ele dá outros parâmetros também, mas vai depender da sua leitura (de cores). Tem uns que lê 4 cores, 18 cores. Isso quer dizer que além de ter tamanho e granulosidade, posso avaliar outros fatores da célula, como por exemplo, produção de proteína. 
• Morfologia celular: 
Mede o tamanho relativo da célula - FSC (Forward Scatter) 
Mede a granulosidade ou complexidade da célula – SSC (Side Scatter)
• Intensidade de fluorescência (outros parâmetros)
FL (vários canais: FL1, FL2, FL3, FL4, FL5...)
Somente com esses parâmetros, já são possíveis a diferenciação celular e a classificação em linfócitos, monócitos e granulócitos em uma única amostra.
Através de parâmetros como tamanho e granulosidade, é possível a distinção de populações celulares.
*SABER O GRÁFICO – CAI NA PROVA Gráfico da avaliação de células do sangue na citometria de fluxo (vertical – granulosidade; horizontal – tamanho). Ou seja, o primeiro gráfico da nossa análise “sai com essa cara”. 
Os primeiros pontinhos embaixo são os Debris Celulares (células mortas). Os segundos são os Linfócitos (são pequenos e não possui grânulos). Os terceiros são os Monócitos/Macrófagos (fica maior e mais pesada). E por último, os Granulóticos (Neutrófilos; Basófilos. Maiores e mais pesados – mais grânulos no citoplasma).
Essas células são puras, sem nenhum anticorpo marcado. 
O primeiro a ser passado é sempre o tubo branco, de células puras. 
Pra cultura de bactéria o gráfico já sai diferente deste. 
Este gráfico é chamado Dot Plot. E cada pontinho é uma célula que passou e a luz incidiu e deu este resultado. 
E se quisermos distinguir outras células? Ex: Linfócito T helper (CD4), linfócito T citotóxico (CD8), linfócito T reg, linfócito B? Teremos que pingar anticorpos específicos pros marcadores celulares dessas células. O ideal é que seja um anticorpo monoclonal, porque, este é mais específico. 
Importante lembrar que num experimento, devemos usar fluorocromo (Depois de excitados por um comprimento de onda específico, emitem fluorescência em um comprimento de onda maior) de cores diferentes. 
Quando você compra um anticorpo, vem na bula dele a fluorescência que ele está carregando. 
FLUORESCÊNCIAS 
• O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de 530 nm, que corresponde àcomprimento de onda luz verde.
 • O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de 570 nm, o que correspondecomprimento de onda à luz laranja. 
• O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de 650 nm, o que correspondecomprimento de onda à luz vermelha. 
Hoje há citômetros que lê 18 cores. Ou seja, lê do FL-1 ao FL-18.
O que fazer para não ter vazamentos? Fazer a compensação de fluorocromos!
Passar as amostras puras (sem fluorocromos) 
Passar as amostras marcadas separadas (Quando pingamos o anticorpo verde e passamos no fluorocromo, quando olho no computador o gráfico tem que ter o pico verde)
Passar as amostras do seu experimento.
Por que fazer a compensação? Para evitar vazamentos de fluorocromos que apresentam comprimentos de onda muito próximos. Como fazemos? Seguindo os 3 passos. 
A fluorescência emitida por cada fluorocromo ligado à célula em análise é detectada por fotodetectores e convertida em sinais que são processados, quantificados e analisados por um computador.
AS CÉLULAS OU PARTÍCULAS BIOLÓGICAS PASSAM NUM FILETE ÚNICO. 
Esta técnica permite a análise de vários parâmetros simultaneamente. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula.
Que partículas podem ser analisadas no citômetro? 
• célula; 
• organelas citoplasmáticas; 
• cromossomos; 
• células agregadas; 
• bactérias; 
• fungos; 
• Protozoários
Parâmetros que podem ser analisados: 
• Tamanho e a forma das células; 
• Granulosidade; 
• Conteúdo de DNA e RNA; 
• Açúcares de superfície; 
• Integridade e permeabilidade da membrana celular; 
• Receptores de superfície celular; 
• Morte celular programada (Anexina e PI ou 7AAD): Tenho uma amostra de célula, pinguei 7AAD, passei no citômetro. Se eu conseguir detectar fluorescência, quer dizer que a célula está morrendo por apoptose. Se não emitir, a célula está viável. 
Conjunto de Sistemas:
• Sistema Fluído- Introduz e alinha as partículas em um fluxo contínuo para análise. (Não posso levar ao citômetro o pelet seco, precisa jogar uma solução salina).
• Sistema óptico- Gera e coleta os sinais de luz. (Tudo que acontece dentro do aparelho). 
• Sistema eletrônico- Converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos. Isto permite a análise posterior pelo computador (software). 
Tenho a amostra passando pelo filete. Quando o citômetro suga a amostra, ela passa uma de cada vez. Importante será a pressão que você vai dar ao aparelho. O citômetro tem 6 botões, e um deles é a velocidade (pressão – baixa, média, alta). A mais baixa, suga 12ul/min (1° foto). A mais alta 60ul/min (2° foto). Você deve começar pela velocidade mais baixa, porque se colocamos “de cara” numa velocidade alta e temos uma concentração muito grande de células, o aparelho pode entupir ou você não terá uma análise minuciosa de cada célula. 
O reagente que entope o aparelho é o paraformoldeído. Quando preparamos a amostra na bancada, usamos paraformoldeído para fixar a célula. O problema que você prepara a amostra, mas não lê no mesmo dia no citômetro. Então guardamos na geladeira. O paraformoldeído fica preso no metal, e isso acaba entupindo o aparelho. O ruim é que esse filete é muito fino (pra ter idéia, o que consegue passar nesse filete é uma agulha). Se você não conseguiu desentupir com a agulha, é necessário chamar um técnico para isso, porém, é muito caro. 
Se você estiver com pouca quantidade de célula no seu experimento, pode iniciar na velocidade alta. Você vai saber se é muita ou pouca célula quando o citômetro começar a contar quantas células tem. 
Há também um protocolo de lavagem do filete. Colocar um tubinho limpo com hipoclorito (água sanitária) e deixo por 5 min, e depois faço com água. Isso já é suficiente para limpar após cada experimento. Isso tudo porque o citômetro não é barato. 
Sistema óptico: No filete,vai passar uma célula por vez no feixe luminoso, e esse feixe vai me dar o parâmetro tamanho e granulosidade. O resto vai depender de quantos parâmetros o citômetro é capaz de ler. 
SISTEMA COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E A LINHAR O FEIXE DO LASER.
Sistema eletrônico: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
Gráficos Dot Plot.
 
Gráfico de Histograma: 
 O pico vermelho é o negativo. Passo primeiro no experimento o célula pura, sem fluorocromo nenhum e então vejo onde está meu negativo. Depois, passo o tubinho marcado com FL-3 (marcação azul). O cálculo será o final do meu negativo. 
Avaliação de 2 parâmetros na mesma célula, no caso aqui, uma célula que expressa CD3 e CD4. Quero confirmar quanto de células positivas tem para CD3 e CD4. Como analisar? Cada pontinho desses é uma célula. No quadrante da esquerda abaixo, é negativo (não expressa CD3 e CD4). O quadrante da direita abaixo é positivo só pra CD3. No quadrante da esquerda acima, é positivo pra CD4. No quadrante da direita acima é o duplo positivo (CD3 e CD4). 
Aplicações
Imunofenotipagem: Diferenciação de populações celulares - Marcação de moléculas de superfície que são utilizados na fenotipagem como marcadores.
Estudo da viabilidade celular: PI marca viabilidade celular (marca dentro) e Anexina marca a superfície da célula. Numa célula viável, nem anexina e nem PI entra na célula, então quando passamos no citômetro dá negativo pros dois. Se começa entrar anexina e não entra PI, a célula está começando a morrer por apoptose. Se os dois passam a marcar, quer dizer que a célula já morreu (PI entrou e degradou o DNA). Assim ocorre também com o reagente 7AAD, que se intercala com o DNA (só marca células mortas). 
Marcação intracelular: por exemplo, quero saber qual é a quantidade de célula CD4 está produzindo IFNy. Então compro anticorpo Anti-CD4 e Anti-IFNy. Lembrar de marcar com fluorocromos diferentes. 
VANTAGENS 
Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
Grande número de células com rapidez;
Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;
Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares.
Para que serve a técnica de citometria de fluxo?
R: É uma técnica para separar, contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido. 
Podemos fazer um experimento e levar o pelet de células após a centrifugação, para ler no citômetro? Exlique.
R: Não, porque ele está diluído com a solução salina. 
É correto afirmar que várias células passam através de um fluxo de solução salina para serem encontradas pelo laser?
R: Errado. Não são várias células, e sim uma de cada vez. 
Em um experimento para detectar o percentual de linfócitos TCD4 que estavam produzindo IFNγ, foi realizada a seguinte marcação: antiCD4-FITC (cor verde), antiCD3-PE (cor laranja) e antiIFNγ-FITC (cor verde). Está correta a marcação realizada? Explique.
R: Não está certa, porque ele está dentro do mesmo sistema avaliando parâmetros diferentes (CD3, CD4 e IFN-y) com cores iguais. A solução pra ele fazer esse experimento mudar o anticorpo (não pode ter 2 FITC). Ou ele compra um anticorpo antiIFNy de outra cor, ou antiCD4 com outra cor. 
O que significa compensar as amostras no citômetro de fluxo e qual a sua importância?
R: É calibrar o aparelho para que não haja vazamento entre os flourocromos com cumprimento de ondas muito próximos. É feita da seguinte forma: Passar as amostras puras (sem fluorocromos); Passar as amostras marcadas separadas (Quando pingamos o anticorpo verde e passamos no fluorocromo, quando olho no computador o gráfico tem que ter o pico verde); Passar as amostras do seu experimento.
Quais são as vantagens do uso desta técnica?
R: Mede múltiplos parâmetros em células individuais; Grande número de células com rapidez; Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares.