IMUNO CLÍNICA AV2 citometria e elisa

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CITOMETRIA DE FLUXO
Essa técnica de citometria de fluxo é excelente pq através dela conseguimos avaliar vários parâmetros de uma célula.
ELISA – é basicamente ver o que a célula está secretando;
ELISA: temos uma cultura de célula em vários “poços”. Com esse teste vamos ver o que a célula está secretando. Pegamos o sobrenadante e passamos no ELISA para vermos o que a célula produziu, ou seja, o que ela jogou no meio. Ou então podemos pegar o soro do paciente e fazer um ELISA. 
A diferença que tem é que se nós quisermos, por exemplo se tivermos uma população de célula heterogênea (linfócito TCD4, linfócito TCD8, macrófago), podemos tirar o sangue e fazer uma cultura de células para avaliarmos o perfil de citocina. 
Pelo ELISA nós não vamos saber qual é a célula que está produzindo determinada citocina. Com a citocimetria, podemos detectar qual é o percentual de células positivas para determinada citocina, vamos utilizar o IFNy como exemplo. Vamos ver qual célula estará produzindo o IFNy. Para isso, vamos separar as populações celulares que produzem IFNy utilizando anticorpos marcados. 
EXEMPLO: Queremos saber se é o TCD4 que está produzindo o IFNy. O TCD4 expressa proteína CD4. Para podermos separar o TCD4 da população de células, basta comprarmos um anticorpo ANTI CD4. Para sabermos a porcentagem de INFy que a célula está produzindo, pingamos um anticorpo ANTI IFNy. 
Hoje em dia podemos comprar diversos anticorpos e estes vem marcados com o fluorocromo.
Fluorocromo é uma molécula que quando recebe luz emite fluorescência. E então o aparelho vai captar essa fluorescência.
O citômetro de fluxo capta a fluorescência. A absorbância será diferente. 
Citometria de Fluxo: é uma técnica para separar, contar, examinar e classificar partículas microscópicas (ex: células, cromossomos e microvesículas) suspensas em meio líquido.
CITO – CÉLULA
METRIA – MEDIDA
FLUXO – MOVIMENTO 
A principal vantagem é que esta tecnologia permite estudar várias características de uma célula de forma rápida e por vários parâmetros (multiparamétrica).
PARÂMETROS QUE O CITÔMETRO DÁ: TAMANHO E GRANULOSIDADE.
Além de ler células, o citômetro pode também ler bactérias.
O citômetro é chamado de sistema ótico eletrônico. Ótico pq ele funciona totalmente em um sistema ótico e eletrônico pq esses sinais óticos de captação de luz são transformados em valores numéricos, fazendo com que consigamos ver pelo computador. Todo citômetro tem que funcionar ao lado de um computador. 
O citômetro é bom pq de primeira ele já nos dá 2 parâmetros, que são tamanho e granulosidade, e depois ele nos mostra quantos parâmetros ele puder. Existem citômetros que possuem 4 cores. Se ele lê 4 cores, quer dizer que ele pode ler 4 parâmetros, além do tamanho e granulosidade.
Podemos estudar morte celular por apoptose através do citômetro de fluxo. Existe um reagente chamado de 7AAD, que não é um anticorpo com fluorocromo, mas em sua composição existe o fluorocromo. A 7AAD só entra na célula se ela estiver em apoptose, pois esta célula perde a viabilidade de sua membrana plasmática e permite que o 7AAD grude em seu DNA;
Hoje em dia existem citômetros que leem 24 cores;
PERGUNTA DE PROVA: Quais são os parâmetros que o citômetro de fluxo pode dar?
R: Tamano, granulosidade e outros parâmetros que vão depender do citômetro de fluxo (se ele lê 4 parâmetros).
VANTAGEM: 
O citômetro pode analisar vários parâmetros de um único experimento/grupo celular;
Rapidez com que a leitura é realizada;
O citômetro funciona como um sistema fluido, ótico e eletrônico. O fluído é pq tem que estar diluído em uma solução salina. O sedimento que fica no fundo do tubo tem que ser levado diluído em uma solução salina, pq se não o citômetro não faz a leitura.
IMPORTANTE:
- NUNCA DEVE SER FEITA A LEITURA DE CITOMETRIA DE FLUXO EM PARAFORMALDEÍDO, PQ ENTOPE O APARELHO.
- INICIAR SEMPRE COM A VELOCIDADE BAIXA.
- DEPOIS QUE PASSAMOS TODAS AS AMOSTRAS, É NECESSÁRIO FAZER UMA LAVAGEM NO CITÔMETRO COM HIPOCLORETO OU SOLUÇÃO SALINA. 
DESVANTAGEM:
O aparelho é muito caro.
O resultado/gráfico das análises citometria de fluxo aparecem no computador. Existem dois tipos de gráfico: DOT PLOT e HISTOGRAMA.
 Quanto mais chega para o lado direito, aumenta o tamanho.
Quanto mais para cima, aumenta a granulosidade
FSC = TAMANHO
SSC = GRANULOSIDADE
Depois que a amostra passa no aparelho de citometria de fluxo, isso é o que aparece no computador. Cada “pontinho” é uma célula que passou pelo filete. Então, o primeiro gráfico que o citômetro nos dá é um gráfico de tamanho e granulosidade pq é sem marcação/fluorescência nenhuma. 
Esse perfil de “pontinhos” é só se for sangue. Então, de pegamos o sangue de algum indivíduo e passamos no citômetro, o resultado vai ser igual o da imagem. Se passarmos uma cultura de bactérias não vai sair assim.
O que está embaixo e bem miúdo vão ser CÉLULAS MORTAS (Debris – resto celular).
LINFÓCITO: pq é uma célula pequena, com o núcleo quase do tamanho do citoplasma, não possui grânulos. Então ela fica geralmente nessa posição pq aumentou um pouco e é um pouco mais pesada;
Depois do linfócito, a célula que é maior e mais pesada é o MACRÓFAGO/MONÓCITO e CÉLULA DENTRÍTICA (foi demonstrado que ela fica um pouco acima).
O grupo de cima vão ser os GRANULÓCITOS (neutrófilo, basófilo), pq eles serão maiores e mais pesados.
GRÁFICO DOT PLOT
Seguindo o exemplo do IFNy:
O perfil DUPLO POSITIVO é aquela célula que é CD4+ e que está expressando IFNy.
Toda vez que pegarmos o gráfico de DOT PLOT, o 5% são as células que não são CD4 e que não expressam INFy (DUPLO NEGATIVO); 15% são só as CD4 que não tinham IFNy dentro; 30% são aquelas células positivas para IFNy mas que não são CD4 (pode ser CD8); 50% vai ser DUPLO POSITIVO (CD4+ e IFN+).
QUAL O PERCENTUAL DE CD4- e INFy +?
R: 30%
GRAFICO DE HISTOGRAMA: geralmente é utilizado quando queremos avaliar um único parâmetro.
EXEMPLO: queremos avaliar, através do histograma, o quadro de um paciente que tem HIV. 
Toda vez que vamos avaliar, devemos passar primeiro o PADRÃO (branco) do experimento, que é o CÉLULA PURA. O célula pura vai emitir um fluorescência natural própria, porém ele não vai emitir CD4 pq não colocamos anticorpo CD4 marcado. Então, o célula pura geralmente dá um gráfico entre 100 e 1010. O célula pura é o nosso negativo, tudo o que passar depois dele será o positivo;
Pegamos a nossa amostra de CD4 (célula marcada com anticorpo CD4) e vemos que ela formou um “morrinho” maior. 
QUAL A PORCENTAGEM QUE ESTÁ CORRETA? 70% OU 50%?
R: 50% sempre contamos depois do negativo.
EXERCÍCIOS:
Qual a população celular representada por “B” e C”?
% CD4+ e IFNy +?
% CD4 – e IFNY +?
% CD4+?
Qual o percentual de macrófagos infectados pela bactéria da tuberculose?
% CD8+?