A 4 - CINÉTICA ENZIMÁTICA

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ENZIMAS
Prof. Fernando Borges Araújo
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ENZIMAS - HISTÓRICO
Catálise biológica  início séc. XIX
digestão da carne: estômago;
digestão do amido: saliva.
Década de 50
Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas.
Eduard Buchner (1897)
extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool;
enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva.
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ENZIMAS - HISTÓRICO
James Sumner (1926)
Isolou e cristalizou a urease;
Cristais eram de proteínas;
Postulou que “todas as enzimas são proteínas”.
John Northrop (década 30)
Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;
Década de 50 – séc. XX
75 enzimas  isoladas e cristalizadas;
Ficou evidenciado caráter protéico.
Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas.
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ENZIMAS 
Definição:
Catalisadores biológicos;
Longas cadeias de pequenas moléculas chamadas aminoácidos.
Função:
Viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar novos compostos.
Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA com propriedades catalíticas, chamadas de RIBOZIMAS, todas as enzimas são PROTEÍNAS.
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ENZIMAS – PROTEÍNA
		Classificação proteínas
Proteínas globulares Proteínas fibrosas
 Estrutura das proteínas
Primaria Secundaria Terciária Quaternária
		 ENZIMAS 
		Proteínas globulares
		 Estrutura terciária
Proteínas com alto peso molecular, maioria entre 15 a 1000 Kilo Daltons Unit (KD)
OBS: 1 Dalton = 1 unidade de peso molecular (AMU)
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ENZIMAS – ESTRUTURA
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ENZIMAS – CARACTERÍSTICAS GERAIS
Apresentam alto grau de especificidade;
São produtos naturais biológicos;
Reações baratas e seguras;
São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida);
São econômicas, reduzindo a energia de ativação;
Não são tóxicas;
Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica. 
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ENZIMAS 
Comparação das enzimas com catalisadores químicos.
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ENZIMAS – NOMENCLATURA
Século XIX - poucas enzimas identificadas
 
 - Adição do sufixo ”ASE” ao nome do substrato: 
	* gorduras (lipo - grego) – LIPASE
	* amido (amylon - grego) – AMILASE
 - Nomes arbitrários:
	* Tripsina e pepsina – proteases
 
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ENZIMAS – NOMENCLATURA
1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB)  nomear e classificar.
Cada enzima  código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:
1° dígito - classe
2° dígito - subclasse
3° dígito - sub-subclasse
4° dígito - indica o substrato
 
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ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO
Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.
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ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO
Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.
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ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO
 Subclasses
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ENZIMAS – NOMENCLATURA
ADP + D-Glicose-6-fosfato
ATP + D-Glicose
IUB - ATP:glicose fosfotransferase
E.C. 2.7.1.1
2 - classe - Transferase
7 - subclasse - Fosfotransferases 
1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor
1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato
Nome trivial: Hexoquinase
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ENZIMAS – CATALISADORES
Aceleram reações químicas
Ex: Decomposição do H2O2 
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ENZIMAS – CATALISADORES
Não são consumidos na reação
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ENZIMAS – CATALISADORES
Atuam em pequenas concentrações 
1 molécula de Catalase
 decompõe
5 000 000 de moléculas de H2O2
pH = 6,8 em 1 min
Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.
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ENZIMAS – CATALISADORES
Não alteram o estado de equilíbrio
Abaixam a energia de ativação;
Keq não é afetado pela enzima.
Não apresenta efeito termodinâmico global 
G não é afetada pela enzima.
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ENZIMAS – 
COMPONENTES DA REAÇÃO
Substrato se liga ao 
SÍTIO ATIVO
da enzima
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ENZIMAS – SÍTIO ATIVO
Região da molécula enzimática que participa da reação com o substrato.
Pode possuir componentes não protéicos:cofatores.
Possui aminoácidos auxiliares e de contato.
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ENZIMAS – COFATOR
 Algumas enzimas que contêm ou necessitam de elementos inorgânicos como cofatores
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ENZIMAS – COENZIMAS
 Maioria deriva de vitaminas hidrossolúveis 
 Classificam-se em:
	- transportadoras de hidrogênio
	- transportadoras de grupos químicos
 Transportadoras de hidrogênio
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ENZIMAS – COENZIMAS
 Transportadoras de grupos químicos
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ENZIMAS – 
LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO
Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou  Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato. 
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ENZIMAS – 
LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO
Koshland (1958): Encaixe Induzido , enzima e o o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição.
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ENZIMAS – 
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Enzyme Commission: “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micro mol de substrato ou a formação de 1 micro mol de produto por minuto”.
 Expressa: U = micro moles produto/minuto 
Atividade específica = U/mg de proteína
Enzima pura, condições que permita a velocidade da reação seja máxima  o substrato [S] de modo a permitir que toda a enzima [E]  [ES].
V = K[E] = K[ES] 
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ENZIMAS – 
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Fatores que alteram a velocidade de reações enzimáticas:
- pH;
	- temperatura;
	- concentração das enzimas;
	- concentração dos substratos;
	- presença de inibidores.
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ENZIMAS – 
INFLUÊNCIA DO PH
O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. 
Enzimas  grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.
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ENZIMAS – 
INFLUÊNCIA DO PH
A estabilidade de uma enzima ao pH depende: 
 - temperatura;
 - força iônica;
 - natureza química do tampão;
 - concentração de íons metálicos contaminantes;
 - concentração de substratos ou cofatores da enzima;
 - concentração da enzima.
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ENZIMAS – 
INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA
 temperatura dois efeitos ocorrem:
 a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas;
 a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.
 Enzima  temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte. por um período de tempo.
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ENZIMAS – 
INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA
O efeito da temperatura depende:
	- pH e a força iônica do meio;
	- a presença ou ausência de ligantes. 
Acima desta temperatura, o  velocidade de reação devido a temperatura é compensado pela perda de atividade catalítica devido a desnaturação térmica.
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ENZIMAS – 
INFLUÊNCIA DA [E]
 Velocidade de transformação do S em P  qtidade de E.
 Desvios da linearidade ocorrem:
 Presença de inibidores na solução de enzima;
 Presença de substâncias tóxicas;
 Presença de um ativador que dissocia a enzima;
 Limitações impostas pelo método de análise.
Recomenda-se:
 Enzimas com alto grau de pureza;
 Substratos puros;
 Métodos de análise confiável.
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ENZIMAS – 
INFLUÊNCIA DA [S]
 [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.
 Medir Vo = velocidade inicial da reação.
[E] = cte.
[S] pequenas  Vo linearmente.
[S] maiores 
Vo por incrementos cada vez menores.
Vmax  [S]  Vo insignificantes.
Vmax é atingida  E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não  com  de [S].
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Victor Henri (1903): E + S  ES
1913 
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
E + S
K1
K-1
ES
Kp
E + P
Etapa rápida
Etapa lenta
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Cinética Enzimática
Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores;
Conhecer as condições ótimas da catálise;
Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;
Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota metabólica.
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
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ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Afinidade da enzima ao substrato.
 Km depende:
 aspectos específicos do mecanismo de reação;
 n° de passos da reação;
 velocidades relativas dos passos individuais.
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Vmax:
Vmax = Kp[Et]
Vmax = K3[Et]
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Enzimas – 
ordem da reação
Quando a formação de P for proporcional à [S] 
 a velocidade da reação é de 1a ORDEM
Quando a velocidade da reação independe da [S] a reação é de ORDEM ZERO
 [S]  [S] <<Km
v = Vmax
v = K[S]
[S]  [S]>>Km
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ENZIMAS – 
MÉTODOS GRÁFICOS
Gráfico dos Recíprocos de Lineweaver-Burk
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
 Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO COMPETITIVA
 Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E livre.
 I  análogo não metabolizável, derivado de um S verdadeiro, S substituto da E ou um P da reação.
Km aparente 
da enzima
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO COMPETITIVA
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentração [I1] 
3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
 Inibidor não-competitivo se liga reversivelmente, aleatória e independentemente em um sítio que lhe é próprio. 
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
E + S 
ES
E + P
EI + S 
EIS
KS
KI
K2
KI
KS
Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentração [I1] 
3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO INCOMPETITIVA
 Inibidor incompetitivo se liga reversivelmente, em um sítio próprio, ao complexo ES. 
I não tem semelhança estrutural com o S
 
I favorece a formação do ES
Km e Vmax da enzima
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO INCOMPETITIVA
KI
Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO INCOMPETITIVA
1- sem inibidor.
2- com inibidor na concentração [I1] 
3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL
 I se combina com um grupo funcional, na molécula da E, que é essencial para sua atividade.
 Podem promover a destruição do grupo funcional
 Forma-se uma ligação COVALENTE entre o I e a E.
 Vmax   parte da E é completamente removida do sistema e Km permanece a mesma.
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL
 Graficando Vmax vs a quantidade total de E adicionada ao meio de reação em presença de I.
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ENZIMAS – 
ENZIMAS REGULATÓRIAS
 Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.
 Controlam a etapa limitante em uma cadeia de reações enzimáticas.
 Tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, moléculas sinalizadoras (pequenos metabólicos ou cofatores).
 Classes de enzimas reguladoras:
 Enzimas alostéricas;
 Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível.
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Enzima alostérica
 O termo alostérico deriva das palavras em grego allos “outros” e stereos “forma”. 
 Assim, enzimas alostéricas são aquelas que possuem outras formas após a união com os moduladores. 
 Os modulares das enzimas alostéricas podem ser inibidores ou estimuladores.
 As enzimas alostéricas possuem mais de uma subunidade. 
 Quando o modulador se liga em uma subunidade da enzima todas as outras subunidades também sofrem a mudança conformacional. 
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ENZIMAS – 
ENZIMAS REGULATÓRIAS
 Enzimas alostéricas
Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador;
Moduladores podem ser inibidores ou ativadores;
São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.
 Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível
Grupos químicos são ligados covalentemente e removidos da enzima reguladora por enzimas ≠, podem ser: fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc.
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ENZIMAS – 
ENZIMAS REGULATÓRIAS
1- Comportamento tipo Michaelis-Menten.
2- Comportamento Alostérico.
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 Enzimas Livres versus Enzimas Imobilizadas
Imobilizadas
Reutilização 
Maior estabilidade (faixas mais amplas de pH e temperatura)
Menor interferência de inibidores e/ou ativadores
Livres 
Instabilidade
Rápida perda da atividade catalítica
Não podem ser recuperadas
ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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A enzima livre é imobilizada em um suporte inerte como vidro poroso, bentonite, etc.
O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre. 
ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
 Propriedades de Enzimas Imobilizadas
Efeitos sobre a atividade enzimática:
Modificação da estrutura tridimensional;
Modificação do microambiente;
Fenômenos de difusão no interior do complexo.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Medida da atividade:
Atividade da enzima imobilizada é mais fraca que a das enzima nativa, mas a estabilidade é maior.
Influencia das condições operacionais:
pH e temperatura  desnaturação parcial ou total da proteína;
imobilizada  resistem melhor a variações de pH e tratamentos térmicos;
Obs: origem da enzima, suporte utilizado e método de fixação 
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
 Aplicações de Enzimas Imobilizadas
Aplicações analíticas:
Facilita automatização das cadeias de dosagem e simplifica as manipulações.
Biossensores: 
Imobilização de colinesterase e anticorpos sobre cristal piezelétrico utilizadas na detecção de pesticidas organofosforados;
Reatores para análise cromatográfica;
Kits para titulações e imunoensaios.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Indústria de alimentos:
Glicose isomerase fixada para a produção de xaropes com alto teor de frutose;
Celulase  Conversão de celulose em açúcares solúveis;
Imobilização de fermento de pão (Sacharomices cerevisae)  álcoois enantiomericamente puros.
Uso Industrial:
Fonte para produção de penicilinas sintéticas.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Lipases imobilizadas:
Imobilizadas em organo-gel utilizadas na esterificação do ácido oléico com n-pentanol;
Imobilizadas em carvão de coco, bauxita e gel de ágar utilizadas na transformação de óleo de soja em biodisel.
Aplicações na medicina:
Hidrogel contendo enzimas imobilizadas  Substrato presente - conversão enzimática - produto muda a conformação do hidrogel  liberação da droga.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Em desenvolvimento:
Estudos de filtros que utilizam enzimas imobilizadas na superfície do meio filtrante para o tratamento do ar dos ambientes. 
Recentes avanços na imobilização de enzimas por argilas, utilizadas em bioremediação.
Estudos em desenvolvimento: imobilização, estabilização e aplicação da enzima esterase, de rim de porco, na síntese de produtos de interesse farmacêutico. 
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ENZIMAS
– APLICAÇÕES
Permitem às indústrias usarem processos mais econômicos, diminuindo o consumo de energia e recursos; mais confiáveis e que poluem menos. 
São eficientes; 
Muito específicas;
Permite produção segura e ambientalmente amigável. 
Origem vegetal
Origem animal 
Origem microbiana
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
Proteases
Leite: na preparação do leite de soja.
Carnes e Peixes: recuperação de proteínas do osso ou espinha.
Vinhos: clarificação.
Queijo: coagulação da caseína. 
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
Lactase
Sorvete: prevenção da cristalização da lactose. 
Leite: estabilização das proteínas do leite em leites congelados por remoção da lactose. Hidrólise da lactose, permitindo o uso por adultos deficientes na lactase intestinal e em crianças com deficiência em lactase congênita.
Ração: conversão da galactose em lactose e glicose.
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
-amilase
Fermentados: conversão do amido a maltose por fermentação. Remoção da turbidez do amido
Cereais: conversão do amido a dextrinas e maltose. 
Chocolate/cacau: liquefação do amido
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
Peroxidase
Deterioração - Frutas: contribui na reação de escurecimento.
 Polifenoloxidase
 Chá/Café: desenvolvimento do escurecimento durante o amadurecimento e fermentação.
 Deterioração - Frutas e Vegetais: reação de escurecimento e perda de vitaminas.
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
 Enzimas utilizadas em rações para aves. 
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
Tratamento de efluentes
 Preocupação ambiental desencadeou uma procura por outras alternativas, as chamadas "tecnologias limpas“. 
 Enzimas  substituir muitos componentes químicos utilizados nos processos industriais atuais.
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
 Enzimas utilizadas em tratamento de efluentes. 
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ENZIMAS – APLICAÇÕES
Industria de álcool;
Industria de detergentes;
Industria têxtil;
Industria de papel e celulose;
Curtumes;
Produção de ácido cítrico, ácido glutâmico, insulina, vacinas, esteroídes, vitaminas e antibióticos;
Bioremediação: de polímeros, de hidrocarbonetos e clorados.
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Lição de Vida!!!
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OBRIGADO!!!