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A 4 - CINÉTICA ENZIMÁTICA

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Vo por incrementos cada vez menores.
Vmax  [S]  Vo insignificantes.
Vmax é atingida  E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não  com  de [S].
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Victor Henri (1903): E + S  ES
1913 
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
E + S
K1
K-1
ES
Kp
E + P
Etapa rápida
Etapa lenta
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Cinética Enzimática
Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores;
Conhecer as condições ótimas da catálise;
Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;
Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota metabólica.
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
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ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Afinidade da enzima ao substrato.
 Km depende:
 aspectos específicos do mecanismo de reação;
 n° de passos da reação;
 velocidades relativas dos passos individuais.
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ENZIMAS – 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 Vmax:
Vmax = Kp[Et]
Vmax = K3[Et]
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Enzimas – 
ordem da reação
Quando a formação de P for proporcional à [S] 
 a velocidade da reação é de 1a ORDEM
Quando a velocidade da reação independe da [S] a reação é de ORDEM ZERO
 [S]  [S] <<Km
v = Vmax
v = K[S]
[S]  [S]>>Km
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ENZIMAS – 
MÉTODOS GRÁFICOS
Gráfico dos Recíprocos de Lineweaver-Burk
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
 Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO COMPETITIVA
 Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E livre.
 I  análogo não metabolizável, derivado de um S verdadeiro, S substituto da E ou um P da reação.
Km aparente 
da enzima
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO COMPETITIVA
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentração [I1] 
3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
 Inibidor não-competitivo se liga reversivelmente, aleatória e independentemente em um sítio que lhe é próprio. 
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
E + S 
ES
E + P
EI + S 
EIS
KS
KI
K2
KI
KS
Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentração [I1] 
3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO INCOMPETITIVA
 Inibidor incompetitivo se liga reversivelmente, em um sítio próprio, ao complexo ES. 
I não tem semelhança estrutural com o S
 
I favorece a formação do ES
Km e Vmax da enzima
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO INCOMPETITIVA
KI
Lineweaver-Burk
Michaelis-Menten
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO INCOMPETITIVA
1- sem inibidor.
2- com inibidor na concentração [I1] 
3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL
 I se combina com um grupo funcional, na molécula da E, que é essencial para sua atividade.
 Podem promover a destruição do grupo funcional
 Forma-se uma ligação COVALENTE entre o I e a E.
 Vmax   parte da E é completamente removida do sistema e Km permanece a mesma.
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ENZIMAS – 
INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL
 Graficando Vmax vs a quantidade total de E adicionada ao meio de reação em presença de I.
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ENZIMAS – 
ENZIMAS REGULATÓRIAS
 Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.
 Controlam a etapa limitante em uma cadeia de reações enzimáticas.
 Tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, moléculas sinalizadoras (pequenos metabólicos ou cofatores).
 Classes de enzimas reguladoras:
 Enzimas alostéricas;
 Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível.
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Enzima alostérica
 O termo alostérico deriva das palavras em grego allos “outros” e stereos “forma”. 
 Assim, enzimas alostéricas são aquelas que possuem outras formas após a união com os moduladores. 
 Os modulares das enzimas alostéricas podem ser inibidores ou estimuladores.
 As enzimas alostéricas possuem mais de uma subunidade. 
 Quando o modulador se liga em uma subunidade da enzima todas as outras subunidades também sofrem a mudança conformacional. 
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ENZIMAS – 
ENZIMAS REGULATÓRIAS
 Enzimas alostéricas
Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador;
Moduladores podem ser inibidores ou ativadores;
São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.
 Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível
Grupos químicos são ligados covalentemente e removidos da enzima reguladora por enzimas ≠, podem ser: fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc.
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ENZIMAS – 
ENZIMAS REGULATÓRIAS
1- Comportamento tipo Michaelis-Menten.
2- Comportamento Alostérico.
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 Enzimas Livres versus Enzimas Imobilizadas
Imobilizadas
Reutilização 
Maior estabilidade (faixas mais amplas de pH e temperatura)
Menor interferência de inibidores e/ou ativadores
Livres 
Instabilidade
Rápida perda da atividade catalítica
Não podem ser recuperadas
ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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A enzima livre é imobilizada em um suporte inerte como vidro poroso, bentonite, etc.
O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre. 
ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
 Propriedades de Enzimas Imobilizadas
Efeitos sobre a atividade enzimática:
Modificação da estrutura tridimensional;
Modificação do microambiente;
Fenômenos de difusão no interior do complexo.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Medida da atividade:
Atividade da enzima imobilizada é mais fraca que a das enzima nativa, mas a estabilidade é maior.
Influencia das condições operacionais:
pH e temperatura  desnaturação parcial ou total da proteína;
imobilizada  resistem melhor a variações de pH e tratamentos térmicos;
Obs: origem da enzima, suporte utilizado e método de fixação 
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
 Aplicações de Enzimas Imobilizadas
Aplicações analíticas:
Facilita automatização das cadeias de dosagem e simplifica as manipulações.
Biossensores: 
Imobilização de colinesterase e anticorpos sobre cristal piezelétrico utilizadas na detecção de pesticidas organofosforados;
Reatores para análise cromatográfica;
Kits para titulações e imunoensaios.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Indústria de alimentos:
Glicose isomerase fixada para a produção de xaropes com alto teor de frutose;
Celulase  Conversão de celulose em açúcares solúveis;
Imobilização de fermento de pão (Sacharomices cerevisae)  álcoois enantiomericamente puros.
Uso Industrial:
Fonte para produção de penicilinas sintéticas.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Lipases imobilizadas:
Imobilizadas em organo-gel utilizadas na esterificação do ácido oléico com n-pentanol;
Imobilizadas em carvão de coco, bauxita e gel de ágar utilizadas na transformação de óleo de soja em biodisel.
Aplicações na medicina:
Hidrogel contendo enzimas imobilizadas  Substrato presente - conversão enzimática - produto muda a conformação do hidrogel  liberação da droga.
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ENZIMAS - IMOBILIZADAS
Em desenvolvimento:
Estudos de filtros que utilizam enzimas imobilizadas na superfície do meio filtrante para o tratamento do ar dos ambientes. 
Recentes avanços na imobilização de enzimas por argilas, utilizadas em bioremediação.
Estudos em desenvolvimento: imobilização, estabilização e aplicação da enzima esterase, de rim de porco, na síntese de produtos de interesse farmacêutico. 
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ENZIMAS