IMUNOLOGIA BÁSICA - TESTES IMUNOLÓGICOS UTILIZADOS EM CLÍNICA E EM PESQUISA

Prévia do material em texto

FUNDAMENTO TEÓRICO DOS TESTES IMUNOLÓGICOS UTILIZADOS EM CLÍNICA E EM PESQUISA
Testes imunológicos utilizados em várias áreas: microbiologia, patologia (imunodiagnóstico), química orgânica (como anticorpos podem ser catalisadores). 
A imunologia é utilizada como ferramenta numa diversidade de áreas de conhecimento. 
Essa amplitude é devido à especificidade: interação específica permite rastreamento. 
Testes imunológicos são utilizados para: 
Pesquisar resposta imune feita por determinada antígeno. 
Pesquisar antígeno usando resposta imunes conhecidas (utilizar anticorpo para pesquisar antígeno).
Em quase tudo é utilizado Anticorpo: trabalhar com células que tenham receptores específicos é mais complicado e pesquisar resposta celular é mais difícil. A maioria dos testes é feita entre o antígeno e o anticorpo pronto. Teste in vitro mais utilizado do que teste in vivo.
Ligação Reversível entre anticorpo e antígeno: não existem ligações covalentes entre antígeno e anticorpo, são do iônicas, pontes de hidrogênio, hidrofóbicas, ligação de Wan Der Waals, sempre ligações que podem se fazer e se desfazer de acordo com as condições do meio. É preciso conservar as condições do meio para que se obtenha equilíbrio da reação.
Complementariedade entre o sítio combinatório e o antígeno dependente de uma especificidade. 
O anticorpo na membrana se combina com o antígeno que se encontra na membrana da bactéria. Várias interações entre grupamentos químicos do anticorpo e do antígeno, que vão fazer uma interação mais forte ou mais fraca, dependendo da especificidade desse anticorpo.
Anticorpos (moléculas solúveis) presentes no plasma (soro + fatores de coagulação): analisar de acordo com a especificidade dos anticorpos, a quantidade de cada um deles, aos isotipos presentes, a força com que se ligam aos antígenos (afinidade). Várias características que podemos estudar para definir como é a resposta feita pelo organismo através dos anticorpos circulantes.
Afinidade: força de ligação entre um epitopo e um sítio combinatório. Depende das cadeias laterais de aminoácidos, grupamentos lipídicos ou polissacarídeos presentes no antígeno. Forças de atração e repulsão definem alta e baixa afinidade. Alta afinidade: muitas interações entre o antígeno e o anticorpo. Baixa afinidade: pouca interação entre o antígeno e o anticorpo. Antígeno + Anticorpo = Complexo Antígeno/Anticorpo. Ligação reversível: constante de associação e dissociação. A constante de equilíbrio é uma razão entre a concentração dos produtos sobre o produto das concentrações dos reagentes. A força com que essas moléculas vão ficar unidas formando um complexo antígeno/anticorpo depende das forças individuais de cada grupamento químico que interage nessa reação.
Avidez: força geral de ligação entre um antígeno que tenha vários epitopos e anticorpos multivalentes. Considerar as interações de todos os epitopos com todos os sítios combinatórios. Avidez Desse anticorpo por aquele antígeno.
Especificidade: capacidade de um sítio combinatório de um anticorpo individual reagir apenas com um epitopo. Capacidade de uma população de moléculas de anticorpo reagirem apenas com um antígeno. Visão Qualitativa. Capacidade de distinguir um anticorpo específico. Quem é muito específico não confunde. Ser direto, não causar confusão nenhuma. Distinguir apenas uma molécula em relação às outras. Não obtemos na imunologia um resultado falso positivo -> fala que é positivo, mas não é (ex. de falso positivo: pesquisa de anticorpos contra HIV com baixa especificidade faz com que pegue HIV em outros vírus). Um teste muito específico é mais confiável para não confundirmos estruturas.
Reação cruzada: capacidade de um sítio combinatório interagir com mais de um epitopo, uma população de anticorpos reagir com mais de um antígeno. Compartilhamento de epitopo devido à uma similaridade. Há um falso positivo: fala que deu positivo, mas não é, é alguém parecido. Quanto maior a especificidade, menor a chance de termos reações cruzadas e menor a chance de falso positivo.
Sensibilidade: capacidade de um teste detectar quantidade mínimas de antígeno ou anticorpo. Alguém muito sensível detecta quantidades muito pequenas. Mais confiável em termos de concentração, um teste muito sensível não dá um resultado falso negativo -> existe, ele é que não conseguiu perceber, acontece quando o teste é muito grosseiro, pouco sensível. 
Melhor tipo de teste: aquele que responde ao que estamos perguntando. Avaliar para cada situação qual o nível de sensibilidade e especificidade que preciso. Muito mais específico e muito mais sensível -> mais caro, sofisticado.
Fatores que afetam a avaliação das reações antígeno/anticorpo: afinidade; avidez; quantidade relativa de cada um (antígeno e anticorpo); forma física do ag; temperatura; ph; força osmótica; presença de íons; viscosidade do meio... Reação biológico sujeita a várias mudanças.
Quantidade relativa de anticorpo e antígeno: Ag + Ac = Complexo Ag-Ac, se saturarmos o sistema, o complexo tende a dissociar-se, por exemplo. O equilíbrio de reação é afetado pelas quantidades. Para fazer complexo é preciso ter antígenos bivalentes. A ligação do complexo é reversível, pode se separar e pode se refazer.
Se eu tenho uma quantidade intermediária de antígeno e de anticorpo eu tendo a formar grandes complexos. Tínhamos dois grandes complexos, quebraram-se em pedaços grandes, esses pedaços grandes se juntaram formando dois novos complexos grandes através da troca de pedaços. 
Se em excesso de antígenos, quando o complexo se separou, tem tanto antígeno livre tem-se uma grande chance do antígeno se ligar às partes quebradas, formando complexos pequenos ao dividir os complexos grandes. Muito anticorpo ou muito antígeno tendo a redividir os complexos e fazer complexos pequenos. Excesso de anticorpo ou excesso de antígeno afeta o resultado de uma reação, porque podemos estar pesquisando um complexo grande, e ao dividir-se em complexos pequenos não detectamos mais.
Se o antígeno está solúvel pode mudar a interação com o anticorpo e a detecção pelo teste.
Tipos de Testes Imunológicos: 
Reação de Precipitação: reação onde o antígeno (bivalente, no mínimo, para formar uma rede que se precipita. Hapteno não funciona, fragmento “Fab” não funciona porque é monovalente) solúvel se combina com o anticorpo (bivalente) solúvel, levando à formação de uma rede/complexo insolúvel, ou seja, um precipitado. Sensibilidade baixa. Moléculas que se juntam.
Curva de precipitação: quantidade constante de Ac em cada frasco + adiciona-se Ag -> deixa reagir, tira o sobrenadante, pesa o precipitado, que são os complexos ag-ac que ficam pesados e caem. Tem-se a quantidade de precipitado a partir da quantidade de antígeno que foi acrescentado. À medida que coloca mais antígeno não se mantém constante, porque cada vez que o complexo grande se quebra entra antígeno formando complexos pequenos solúveis. Por que diminui? Porque quando adicionamos mais, divide-se em complexos pequenos. Tipo de comportamento comum a reações de antígeno e anticorpo. 
Identificar no gráfico: concentração máxima de precipitado na zona de equivalência (faixa roxa); formação de complexos pequenos solúveis (zona rosa, onde há excesso de antígeno); e área de excesso de anticorpo (faixa azul). Sobrenadante: quando há excesso de antígeno e anticorpo.
Equilíbrio dinâmico: na zona de equivalência há complexos quebrando-se e formando-se, mas parece que estaca parado.
Imunodifusão Radial Simples: o antígeno difunde-se radialmente do centro do ágar às demais regiões, de forma que próximo ao anel, há maior concentração e mais longe há diluição. À medida que vai migrando pela placa, o antígeno encontra anticorpo. Forma pequenos complexos solúveis quando está muito próximo ao ágar inicial e, portanto encontra-se em excesso se comparado ao anticorpo. Mais longe ao difundir-se e chegar à zona de equivalência, forma um anel de precipitação, onde irá formar os complexos antígeno-anticorpo. A distância do anel de equivalênciadepende das concentrações iniciais aplicadas do antígeno. 
Teste utilizado para testar IgA, IgG e IgM. Fazer dosagem de proteínas.
Imunodifusão Radial Dupla: formação de uma banda de precipitação de acordo se é mais perto ou mais longe das concentrações.
Imunodifusão Radial: Método de Mancini: anéis de diâmetros diferentes. A concentração do antígeno é proporcional ao quadrado do diâmetro. Curva padrão com o controle. É um método Quantitativo: é possível fazer dosagem com ele.
Imunoeletroforese: separar de acordo com a migração no Campo Elétrico, isto é, de acordo com as cargas elétricas. Mistura de antígenos de um lado do canalículo + antissoro do outro lado do canalículo -> deixa migrar até encontrar o anticorpo e onde se encontrarem forma uma banda de precipitação. Faz com qualquer proteína, mas é utilizado para análise de proteínas do plasma. Não é quantitativa, mas é possível calcular a quantidade de imunoglobulina. Método qualitativo e dá uma concentração relativa. 
Reações de Aglutinação: quando temos um antígeno na superfície de uma partícula e não é solúvel. Há formação de um gromo, aglutinação. Feita com partículas. Método muito mais sensível. É visível mais facilmente. Partículas que se juntam. Células ou partículas insolúveis + anticorpos solúveis = aglutinação. Já caem sozinhas. Utilizado para tipagem sanguínea ABO, testes para sífilis. Qualitativo ou semiquantitativo.
Hemaglutinação (aglutinação de hemácias): as hemácias escorregam pela parede e formam um “botãozinho” chamado aglutinação negativa, se as hemácias forem aglutinadas por alguma coisa forma um “tapete” chamado aglutinação positiva. Aglutinar ou não aglutinar não significa que o teste deu positivo ou negativo. 
Teste de aglutinação quantitativa: quantidade do soro para a quantidade de solução, diluição do soro -> ½ (um para dois): uma parte do soro para uma parte da solução: exemplo tem que colocar 1 de soro e acrescentar 1 de salina. ¼ (um para quatro): 1 de soro para 3 de salina. Quero 1 mL de solução com a diluição 1/8: 1mL de soro + 7mL de salina, e depois tira 1 mL da solução. Quero 1 mL de solução com a diluição 1/100: 0,01 ml de soro + 0,99ml de salina. Métodos de diluição seriada:
1 ml de solução do soro ½: 0,5ml de soro + 0,5ml de salina (1/4: ½ x ½)
1 ml de solução do soro 1/10: 0,1ml de soro + 0,9ml de salina
1 ml de solução do soro 1/100: 0,01ml de soro + 0,99ml de salina (1/10 x 1/10)
1 ml de solução de soro 1/10.000: 1/100 x 1/100
Título: inverso da maior diluição que ainda deu positivo.
Paciente 1: aglutinou até a solução 1/64 (último que deu reação). Título= 64
Paciente 2: aglutinou até a solução 1/8 (último que deu reação). Título= 8
O que tem mais anticorpo é o 1 porque mesmo com maior diluição o soro continuou aglutinando/reagindo, o que significa que tem mais anticorpo. Quanto maior o título, maior a quantidade de anticorpos.
Paciente 3: a quantidade de anticorpo é tão grande que até a última solução continuou reagindo.
Paciente 4: deram todos negativos, mas começou de ½, pode ser que se fizesse com o soro não diluído tivesse aglutinado.
Paciente 5: título= 32
Paciente 6: quando há muito anticorpo para antígeno, há formação de complexos individuais ao invés de formar uma rede. Fenômeno Prozona. Depende da classe de anticorpo. 
Aglutinação ativa: em que o antígeno que estamos testando faz parte da partícula. Detecção de antígeno Rh na hemácia. 
Aglutinação passiva: quando transformamos uma reação de precipitação em reação de aglutinação pela adição de uma partícula, como partícula de látex, fazendo ter uma sensibilidade maior. 
Aglutinação Indireta: quando é necessário o reagente/soro de Coombs (facilita a aglutinação). Se misturarmos anticorpos anti-Rh com hemácias Rh+, os anticorpos se prendem em volta da hemácia, mas não formam gromos, não enxergamos que a reação aconteceu. Para sabermos que a reação aconteceu utilizamos um anticorpo antiglobulina (reagente de Coombs), é um anticorpo anti-IgG: faz uma ponte que promove a aglutinação. Aplicações (percepção se há ou não aglutinação): detecção de Ac anti-Rh (saber se a mãe tem anticorpo anti-Rh no plasma); anemia hemolítica autoimune.
Aglutinação Direta: não precisa do reagente de Coombs.
Teste de HCG na urina: utiliza-se uma partícula de látex e um anticorpo com alta afinidade. Pega a amostra da urina e mistura com o Anticorpo. Ou a amostra da urina contém HCG (doadora está grávida) ou não contém (doadora não está grávida). Se tinha hormônio na urina, o anticorpo gruda no hormônio, mas não enxergamos nada. Coloca-se um indicador (conjugado da bolinha de látex com o hormônio) e vê se aglutina ou não. O sistema indicador (HCG + látex) atua no teste da inibição da aglutinação. Se ocorre a aglutinação é porque não tinha hormônio na urina, sendo assim a doadora não está grávida. Se não der aglutinação, significa que tinha hormônio na urina, uma vez que o anticorpo está todo bloqueado com o hormônio, e não aparece aglutinação porque o conjugado/indicador não combina com o anticorpo. Se não tivesse o hormônio na urina: na hora que colocamos o conjugado o anticorpo que colocamos está todo lá, o que provocará aglutinação do conjugado, significando que não há gravidez, teste negativo para gravidez quando ocorre aglutinação. 
Pesquisa de antígeno solúvel: transforma-o em partícula. 
Imunofluorescência: propriedade das substâncias de absorção de luz no comprimento de onda ultravioleta e liberação como luz visível. Tecido fixado/congelado + anticorpo marcado com fluorocromo contra antígenos em alguns pontos do corte histológico -> vemos onde estava o antígeno/anticorpo. Observação de onde há imunofluorescência. Prende o anticorpo fluorescente na região Fc. Visualizar onde o anticorpo se fixou. Onde fica o anticorpo, significa que ali se encontrava o antígeno. Teste qualitativo. Põe o olho e conta quantas células têm.
Análise de cortes histológicos. 
Imunofluorescência direta: onde o anticorpo é chamado anticorpo primário, e coloca ele já marcado com fluorocromo. Ex.: anticorpo IgG anti-C3b.
Imunofluorescência indireta: faz-se dois andares -> onde fica o anticorpo fluorescente é porque tinha ficado o anticorpo primário e, onde ficou o anticorpo primário é porque tinha o antígeno. Vantagens da iimunofluorescência indireta: Fluorescência muito mais intensa -> em cada molécula de IgG ligam-se várias moléculas do anticorpo fluorescente; Método muito mais barato -> não precisa ter no laboratório um anticorpo fluorescente marcado para cada coisa; É possível pesquisar anticorpo solúvel ao invés de pesquisar antígeno -> usa o antígeno conhecido e coloca o soro do paciente que estamos pesquisando; Descobrir qual a classe do anticorpo que o paciente tem -> coloca o anticorpo fluorescente e, se ficar fluorescente, significa que o paciente tem o anticorpo, se tiver muita IgG o paciente encontra-se na fase crônica. A imunofluorescência indireta utiliza de mecanismos como: antígeno suporte (ex.: Trypanossoma), soro do paciente, anticorpo anti-imunoglobulina marcado por fluorocromo, estes ficam fluorescentes. Aplicações: identificar subpopulações de linfócitos, identificar espécias de bactérias, localização de hormônios, detecção de complexos ag-ac em doenças auto-imunes, detecção de anticorpos anti-DNA. 
Citometria de Fluxo: evolução do teste imunofluorescente, jeito automático através do FAX (aparelho), separa e/ou identificar as células que têm fluorescências diferentes, usar anticorpos contra moléculas CD, principalmente, e cada uma delas será marcada por um ionocromo. Consegue que cada comprimento de onda ative um laser, que vai desviar o feixe de laser devido ao comprimento de onda, podendo cair em tubos diferentes. Método Quantitativo. Uso do histograma. Determinar o número de células. Distribui as células de acordo com a densidade do antígeno, tamanho celular, granulosidade (tamanho, granulosidade e fluorescência) ... Aplicações: determinar o nº de células sanguíneas brancas, isolar populações celulares, distribuição de células de acordo coma densidade de antígenos, isolar populações celulares com base no tamanho celular. Usado para HIV e Leucemias.
Ensaio de Imunoadsorção ligado à Enzima – ELISA: conjugamos uma enzima no anticorpo e colocamos um substrato da enzima, dando um produto colorido. Sensibilidade enorme: identifica quantitades mínimas. Substrato transparente convertido em colorido. Aplicações: testes de rotina em laboratórios clínicos e em pesquisa. Vantagens: teste de alta sensibilidade; permite quantificar Ag ou Ac das amostras; Seguros e de baixo custo.
Competitivo
Indireto
Direto ou Sanduíche
Imunohistoquímica: corte de tecidos quando pesquisamos os antígenos: coloca-se o anticorpo marcado com enzima, coloca-se o substrato diaminobenzidina (peroxidase), dando um precipitado colorido no local, assim sabemos que o antígeno estava localizado nesse tecido. Quando colocamos o substrato dá um produto/precipitado colorido. Percepção de tirosinas em axônios. Uso de anticorpos com especificidade e afinidade muito alta -> anticorpos monoclonais: permitem a padronização do teste imunológico (caro).
Radioimunoensaio (RIA): marca o segundo anticorpo com radioisótipo. Usado para sensibilidade muito alta, dosar hormônios, medicamentos, vitaminas. Utiliza-se Elisa atualmente para substituí-lo. Competição com um antígeno marcado (antígeno quente) e antígeno não marcado (antígeno frio). Usa o anticorpo preso na placa e acrescenta os antígenos acima citados, que se distribuem homogeneamente. Faz-se uma curva a partir da proporção de ligação. Método quantitativo, muito sensível, caro, vida do radioisótipo curta, necessidade de proteção.
Western Blotting: eletroforese -> separação das proteínas passa para o western blotting, provoca a separação dos componentes e sabe-se em qual banda tem o anticorpo. Usado para a confirmação de outros testes. Se aparecer a banda em determinado “nível” de certa proteínas temos a confirmação ou não de um teste anteriormente realizado. Exemplo: usado para a confirmação da AIDS. Caro. Exame de rotina -> ELISA.
Teste para a resposta alérgica: hipersensibilidade imediata, forma edemas. Reação tipo I.
Teste de Tuberculina: hipersensibilidade tardia, forma “pápilas duras”. Injeta o antígeno na pele e espera de 24h-72h. Reação tipo IV.
Fixação de Complemento: adição de antígeno no meio + acrescento soro do paciente => se forma o complexo ag-ac é capaz de ativar o Complemento. Indicador: hemácia de carneiro revestida com anticorpos anti-hemácia -> se sobrar complemento é capaz de lisar a hemácia, se não sobrou o complemento (foi consumido) -> a hemácia fica inteirinha.
Comparação da Sensibilidade de vários testes: