Parasitologia - Exame de fezes

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INTRODUÇÃO	
No laboratório de análises clínicas é comum a realização de exames da função gastrointestinal, sendo os de maior importância clínica e mais solicitados, em ordem, o parasitológico de fezes, também chamado de protoparasitológico; a pesquisa de sangue oculto nas fezes, a pesquisa de oxiurus e a coprocultura. É dito como exame de função gastrointestinal porque refletirá alterações existentes e suas possíveis causas, auxiliando no diagnóstico e tratamento necessário para cessar esse estado do paciente.
Por ser um exame de rotina e pela grande incidência de parasitoses na população brasileira, o exame parasitológico de fezes é realizado com a utilização do método mais sensível, já que a hipótese diagnóstica, na maioria das vezes, não acompanha a solicitação médica para direcionar o diagnóstico através de um método mais específico. É capaz de detectar as diferentes formas parasitárias de protozoários e helmintos, sendo o método da Sedimentação Espontânea o mais utilizado (VALLADA, 1988; NEVES, 2004).
A pesquisa de sangue oculto nas fezes visa identificar
A realização da coprocultura é importante porque identifica a presença de bactérias patogênicas após a realização da cultura destes microrganismos, sendo que cada espécie ou gênero conhecido, possui uma característica nas provas bioquímicas realizadas posteriormente, sendo de suma importância para o direcionamento do diagnóstico adequado.
E. vermicularis são vermes presentes como parasitas humanos a milhares de anos, segundo estudos da área e, por não serem identificados pelo método parasitológico, é necessária a utilização de outro método chamado de pesquisa de Oxiúrus, simples e eficaz na detecção da presença do mesmo.
 
PROTOPARASITOLÓGICO DE FEZES
A parasitologia define como parasitismo “toda planta ou animal que vive dentro de, sobre ou com outro ser vivente, do qual obtém alimento, proteção ou outra vantagem”, porém nem sempre esse parasitismo gera algum dano ou beneficio ao hospedeiro (VALLADA, 1988). Pode ser classificado como mutualismo, simbiose, comensalismo, predatismo ou saprofitismo, mas os casos são tão variados que se torna difícil a classificação. No setor médico, só leva-se em consideração o parasitismo patológico, focando o diagnóstico aos parasitos diagnosticáveis nos exames de fezes.
A transmissão parasitária pode ocorrer através de artrópodes; por simples contaminação através de veículo mecânico; propagativa, quando ocorre multiplicação em uma passagem pelo meio no seu ciclo de vida; e por ciclo obrigatório, quando a passagem obrigatória pelo meio é vital para seu ciclo (NEVES, 2004). 
Por ser de execução rápida, o protoparasitológico de fezes (PPF), parasitológico de fezes ou coproparasitológico, é muito solicitado para a pesquisa de infestação por protozoários e helmintos, sendo que alguns métodos são mais sensíveis para detectar um grande número de formas parasitárias, mas outros podem ser mais específicos para outras, visto que não existe um método capaz de evidenciar todos os parasitas presentes por conta das características, da biologia do verme e densidade dos ovos ou cistos. Visando aumentar essa sensibilidade, é indicada a realização do exame em três amostras distintas, em dias alternados, levando em consideração os ciclos de vida dos parasitos e helmintos, já que a negatividade do resultado não significa a ausência de parasitismo (VALLADA, 1988; NEVES, 2004).
A hipótese diagnóstica, quando indicada na solicitação médica, pode direcionar a realização do exame, possibilitando a escolha do método mais eficaz para detecção do parasita em questão, ou incluir o método dentre os outros que são realizados rotineiramente no laboratório em questão. 
Tabela 1. Indicações clínicas para os diferentes métodos de exames parasitológicos de fezes.[1: Fonte: NEVES, D. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu. 11 ed. 494 p. 2004.]
Por fim, o objetivo do PPF é a detecção da presença de parasitas, ovos e cistos nas fezes, sendo necessária a quantidade mínima de 5g de amostra fecal colhida em recipientes limpos, de boca larga, normalmente entregue pelo laboratório, com a realização do fechamento eficaz e imediato após a coleta. A amostra pode ser mantida por 3 dias em temperatura de 2 a 8° C sem que ocorra degradação da mesma (VALLADA, 1988; NEVES, 2004).
Rotineiramente, o método utilizado é o Hoffmann, Pons e Janer (Sedimentação espontânea), sendo descrito a seguir:
Diluir aproximadamente 4 g de amostra em cerca de 50 mL de H2O, triturando bem com o auxilio de um bastão de vidro;
Filtrar a suspensão utilizando gaze cirúrgica dobrada em quatro ou através de uma tela metálica/de náilon com cerca de 80 a 100 malhas por cm², passando-a para uma taça de Hoffman;
Deixar sedimentar de 2 a 24 horas;
Recolher o sedimento com uma pipeta de Pasteur e passar para a lâmina, realizando a leitura com uma gota de Lugol entre lâmina e lamínula, no aumento de 10x ou 40x quando necessário.
Pode ocorrer a rejeição da amostra caso ocorra contaminação com urina ou com a água do vaso sanitário, além do uso de laxativos e potes inadequados para a coleta. O valor de referência para esse exame é negativo, sendo necessária a identificação do parasita quando positivado. 
Tabela 2. Principais Helmintos encontrados no Exame Parasitológico de Fezes, no Brasil, e os métodos mais indicados para seu diagnóstico. *Sedimentação espontânea; **MIFc, Ritchie, Coprotest, entre outros que envolvam centrifugação.[2: ; 3 Fonte: NEVES, D. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu. 11 ed. 494 p. 2004.]
Tabela 3. Principais protozoários encontrados no PPF, no Brasil, e os métodos mais indicados para o diagnóstico. *Sedimentação espontânea; **MIFc, Ritchie, Coprotest, entre outros que envolvam centrifugação.[3: ]
	Outros métodos mais usados estão descritos a seguir:
Flutuação espontânea
Também chamado de método de Willis, sendo indicado para a pesquisa de ovos mais leves, como de ancilostomídeos. Para a realização da metodologia em questão é necessário seguir os passos abaixo (NEVES, 2004):
Diluir 10 g de fezes em solução saturada de açúcar ou NaCl;
Completar o volume até a borda do frasco utilizado;
Colocar na boca do franco uma lãmina de vidro, que deverá estar em contato com o líquido;
Deixar repousar por 5 minutos;
Retirar rapidamente a lâmina, virando o lado molhado para cima;
Observar em microscópio com objetiva de 10x e/ou 40x, utilizando ou não a lamínula.
Centrífugo-flutuação
Também conhecido como método de Faust, é usado para a pesquisa de cistos e alguns oocistos de protozoários, além de detectar ovos leves. Para realiza-lo é necessário (NEVES, 2004):
Diluir 10 g de fezes em 20 mL de água filtrada, homogeneizando bem;
Filtrar utilizando uma gaze cirúrgica dobrada em quatro, em um copo de plástico e transferir para um tubo de Wasserman/ de hemólise;
Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto;
Desprezar sobrenadante e ressuspender o sedimento em água;
Repetir os dois últimos passos mais duas ou três vezes, até que o liquido sobrenadante fique claro;
Desprezar sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma solução de sulfato de zinco a 33%, densidade 1,18 g/mL;
Centrifugar novamente;
Recolher a película superficial, onde estarão os parasitas, com alça de platina, colocar em lâmina e acrescentar uma gota de Lugol e cobrir com lamínula, observando em objetiva de 10x e/ou 40x.
É importante realizar o exame imediatamente para que o sulfato de zinco não deforme as formas parasitárias.
Método de Baermann-Moraes e método de Rugai.
São indicados para a pesquisa de larvas, utilizando a concentração de larvas por migração ativa, por conta do termotropismo e hidrotropismo positivos.
Os dois métodos resumem-se em envolver as fezes em gaze, mantendo-a em contato com a água morna por uma hora, recolhendo uma porção da água para análise microscópica. A diferença entre eles é, basicamente, a utilização de centrifugação no método de Baermann-Moraes (VALLADA, 1988; NEVES, 2004).
Método de Kato-Katz
É um método que concentra ovosde helmintos, sem a necessidade de diluição da amostra. Para realiza-lo, deve-se preparar a solução de verde malaquita com antecedência ou utilizar uma solução pronta para uso, com a finalidade de preservar e clarificar as formas parasitárias. Cortar papel celofane semipermeável em pedaços de 24 x 30mm e deixá-los mergulhados na solução por 24 horas, mantendo-os assim até que seja necessária a utilização (VALLADA, 1988). Após a preparação, dá-se inicio ao método:
Depositar uma porção das fezes sobre um papel;
Comprimir as fezes com uma tela metálica, retirando a porção que passou pelos poros com uma espátula;
Em uma lâmina, colocar um retângulo de papelão com um orifício de 6 mm de diâmetro, onde será depositada a porção de fezes retirada com a espátula;
Retirar o retângulo deixando as fezes na lâmina;
Colocar um pedaço de celofane embedecido na solução verde malaquita sobre as fezes e pressionar invertidamente em um papel filtro;
Aguardar de 30 a 60 minutos para que a clarificação seja feita;
Realizar a leitura da lâmina e a contagem de ovos na amostra, multiplicando o número encontrado por 23, para que o valor de ovos por grama de fezes seja encontrado.
Se a intenção for apenas qualitativa, dispensa-se o uso do retângulo com orifício e o método não evidencia cistos de protozoários.
PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES
 
COPROCULTURA
É um exame de fezes que identifica se há presença de sangue ou bactérias, permitindo fazer a cultura de microorganismos enteropatogênicos de forma que possam ser identificados. Os mais frequentes são Escherichia coli, Salmonella e Shigella. (OLIVEIRA, 2009)
Na colheita as fezes devem ser recentes e armazenadas em pote estéril ou por swab anal em ambiente apropriado limpo e seco.
Instruções:
Colher fezes recém excretadas antes da administração de antimicrobianos.
A positividade dos resultados é maior quando a amostra é colhida nos primeiros dias da doença.
Fezes coletadas em casa devem ser mantidas em temperatura ambiente e a entrega no laboratório deve ser no máximo de 2 horas.
Para transporte as unidades devem colocar a amostra em meio Cary-Blair antes de encaminhar ao setor. (PARDINI, 2016)
A cultura de fezes identifica microorganismos enteropatogênicos em casos de diarreia aguda ou crônica. Geralmente a coprocultura é realizada em casos de diarreia sanguinolenta, febre, sintomas severos e persistentes, presença de leucócitos fecais e exposição a agentes bacterianos. (PARDINI, 2016)
O crescimento bacteriano em meio de cultura enriquece o desenvolvimento de patógenos de interesse gastrointestinal. A partir do mesmo é possível fazer a seleção de bactérias enteropatogênicas. (BARRA, 2009)
Meios utilizados:
• Ágar MacConkey (MC): Isola bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verifica a fermentação ou não da lactose.
• Ágar Salmonella-Shigella (SS): Seleciona e isola espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água. (ANVISA, 2004)
Semeadura:
Semear uma alçada de fezes em um meio diferencial, em um meio seletivo e 3 a 4 alçadas em um caldo de enriquecimento.
Incubar as placas de MC E SS a 35°C por 18 a 24 horas e o caldo de enriquecimento por 35 °C por 12 a 18 horas.
Após 12 a 18 horas de incubação, semear uma amostra na superfície do caldo de enriquecimento em uma placa de meio seletivo (SS). (BARRA, 2009)
Após o isolamento das enterobactérias em placa de Petri, realiza-se a sua identificação através de provas bioquímicas. Algumas dessas provas podem ser feitas em tubo de ensaio onde se verifica a presença de determinadas enzimas, emissão de gás, motilidade e gênero bacteriano analisado. (NICÉSIO, 2011)
O meio IAL / Rugai foi elaborado para triagem de enterobactérias e consiste de nove provas em apenas um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentação da sacarose, fermentação da glicose, produção de gás, fenilalanina, uréia, H₂S, lisina e motilidade. Pelas limitações de diferenciação de gêneros e espécies de enterobactérias não se recomenda este meio como um exame definitivo pode-se utilizar os resultados obtidos como triagem e adicionar os testes complementares, como a fermentação da lactose verificada no crescimento em ágar Mac Conkey (NICÉSIO, 2011).
PESQUISA DE OXIÚRUS
Enterobius vermicularis é um tipo de verme que ocorre no ser humano, e ao longo da história seu nome sofreu alterações diversas vezes. Primeiramente, foi descrito por Linneu, em 1758, como Ascaris vermicularis. Em 1803, Rodolphi criou o gênero Oxyuris, e Lamarck, em 1816, passou a denomina-lo Oxyuris vermicularis. Em 1853, Leach estava reestudando esse helminto, e verificou que ele pertencia a um gênero distinto, o Enterobius, e então, seguindo as regras internacionais de nomenclatura, o correto nome desse verme é Enterobius vermicularis. Porém, devido ao nome Oxyuris vermiculares ter sido muito difundido na época, esse helminto é popularmente conhecido como oxiúros (NEVES, 2004).
Estudos sobre a paleoparasitologia indicaram através de exames de coprólitos (fezes petrificadas) que o E. vermicularis e outros helmintos parasitam o ser humano há milhares de anos, e nos EUA foram encontratos ovos em coprólitos humanos datados de 10.000 anos (NEVES, 2004).
A morfologia do E. vermicularis varia se acordo com o sexo. As fêmeas medem cerca de 1cm de comprimento por 0,4mm de diâmetro, possuem cauda pontiaguda e longa. Os machos medem cerca de 5mm de comprimento por 0,2mm de diâmetro, possuem cauda fortemente recurvada em sentido ventral, com espículo presente e apresenta um único testículo. Os ovos postos pela fêmea medem cerca de 50 µm de comprimento por 20µm de largura, apresenta aspecto de uma letra D, pois um lado é sensivelmente achatado e o outro é convexo, possui uma membrana dupla, lisa e transparente (NEVES, 2004).
Figura 1. Enterobius vermiculares. A) Macho; B) Fêmea repleta de ovos; C) ovo característico.[4: Fonte: NEVES, D. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu. 11ª ed. 494 p. 2004.]
O ciclo biológico deste parasita é monoxênico. Após a cópula, os machos são eliminados nas fezes, e as fêmeas, repletas de ovos se desprendem do ceco em direção ao ânus, principalmente no período noturno. Os ovos são depositados nessa região, embrionados, se tornam infectantes em poucas horas (NEVES, 2004).
O exame laboratorial para detecção de oxiúros não funciona no método de fezes, e por isso, é realizado o método da fita gomada (adesiva), que consiste na descrição a seguir:
Corta-se um pedaço da fita adesiva transparente em aproximadamente 8 a 10 cm; 
Coloca-se a mesma com a parte adesiva (gomada) para fora, sobre um tubo de ensaio;
Pressionar algumas vezes na região perianal com a parte colante da fita;
Coloca-se a fita como se fosse uma lamínula sobre uma lâmina de vidro;
Análise em microscopia com aumento de 10x e 40x (NEVES, 2004).
Lembrando que a coleta da amostra deve ser feita ao amanhecer, antes do banho, antes de evacuar, sem uso de pomadas, talco ou qualquer medicação tópica na região perianal.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANVISA. Descrição dos meios de cultura empregados nos exames microbiológicos. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf> Acesso em: 15 mai. 2017.
BARRA, Renato. Coprocultura. Disponível em: <http://laudos.labclim.com.br/intranet/documentos/micro/PROMIC-0006-1.pdf> Acesso em: 18 mai. 2017.
FERREIRA, A. W. Diagnóstico laboratorial. Avaliação de métodos de diagnóstico das principais doenças infecciosas, parasitárias e autoimunes. Correlação clínico-laboratorial. Rev. Inst. Med. trop. São Paulo, São Paulo, v. 38, n. 4, p. 264, Agosto 1996.
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HERMES PARDINI. Coprocultura. Disponível em: <http://www.labhpardini.com.br/scripts/mgwms32.dll?MGWLPN=HPHOSTBS&App=HELPE&EXAME=F%7C%7CCTF> Acesso em: 15mai. 2017.
NEVES, D. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu. 11ª ed. 494 p. 2004
NICÉSIO, Raphael. Meio IAL / Rugai. Disponível em: <www.biomedicinabrasil.com/2011/04/meio-ial-rugai.html>
OLIVEIRA, Maria. Coprocultura. Disponível em: <https://www.conhecersaude.com/exames/c/3224-coprocultura.html> Acesso em: 15 mai. 2017.
VALLADA, E. P. Manual de Exames de Fezes: coprologia e parasitologia. São Paulo: Atheneu. 1988.