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D I S C I P L I N A : B I O L O G I A M O L E C U L A R S E M E ST R E 2 0 1 7 / 2 Bibliotecas de DNA e Sequenciamento Profa. Mariana Dias Moreira maridias@ufsj.edu.br Construção e uso de bibliotecas de DNA Recombinante Vimos como os genes podem ser clonados em vetores com a utilização de enzimas de restrição e como eles podem ser transformados ou transferidos para vários tipos celulares. E quando o DNA de interesse constitui uma fração pequena do DNA total???? Como podemos selecionar e identificar apenas um gene???? Construção e uso de bibliotecas de DNA Recombinante Biblioteca Genômica O objetivo é produzir uma coleção de clones grande o suficiente para assegurar a existência de pelo menos um clone para cada gene do organismo. Purificação do DNA total da célula Processo parcial de restrição Fragmentos que podem ser clonados em vetor adequado Biblioteca Genômica Essa coleção de clones contendo diferentes fragmentos de DNA é chamada de biblioteca de genes; Cada “livro” é uma linhagem bacteriana ou de fago que contém um fragmento do genoma Essas bibliotecas são essenciais para a manutenção e a recuperação de clones; Podem até mesmo ser adquiridas comercialmente. Biblioteca Genômica • Tamanho da biblioteca determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. o Minimizar o número de clones necessários através da clonagem de fragmentos de maior tamanho possível. •Vetores utilizados •Fago λ •Cosmídeos: fragmentos maiores; bibliotecas mais difíceis de construir e manter •Cromossomos artificiais de levedura (YACs) •Cromossomos artificias de bactérias (BACs) Construção e uso de bibliotecas de DNA Recombinante BIBLIOTECAS GENÔMICAS • Para bactérias, leveduras e fungos, o número de clones necessário para uma biblioteca genômica completa não é tão grande que não possa ser manejado. E para plantas e animais???? BIBLIOTECAS DE cDNA Construção e uso de bibliotecas de DNA Recombinante Nem todos os genes são expressos no mesmo momento.... • Uma característica da maioria dos organismos multicelulares é a especialização de células individuais. • Cada célula contém o mesmo conteúdo de genes, mas, nos diferentes tipos celulares, grupos distintos de genes são ativados, enquanto outros são silenciados. Construção e uso de bibliotecas de DNA Recombinante Apenas poucos genes são manifestados em um tipo celular Clonagem do RNA mensageiro!!!! O mRNA não pode ser ligado a um vetor de clonagem. E agora???? Biblioteca cDNA Isolando mRNAs da célula Cromatografia Biblioteca cDNA Transformação de mRNA em cDNA mRNA convertido em DNA DNA complementar (cDNA) Transcriptase reversa Clones construídos a partir de DNA complementar cópia da mensagem obtida da população de mRNA isolada da célula ou do tecido de interesse. Em comparação com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas são enriquecidas com sequências gênicas. O cDNA não contém íntrons permite que cDNAs relativos a células de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactérias e em outros micro-organismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídeos. A ausência de íntrons também facilita a determinação direta da sequência da mensagem e subsequente dedução da sequência de aminoácidos da proteína por ela codificada. Biblioteca cDNA Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor Escolha do vetor plasmídeo ou fago Fago λ tem sido o vetor de escolha para a construção de bibliotecas de cDNA eficiência em comparação com plasmídeos requer 16x menos cDNA por µg do vetor para produzir número equivalente de clones recombinantes Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor Passos envolvidos na construção de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas Genômicas Biblioteca Metagenômica Genoma é o conteúdo total de um organismo Metagenoma são os genomas coletivos de um ambiente A biblioteca metagenômica compreende a “garimpagem” de genes úteis a partir do ambiente sem o cultivo dos organismos que o carreiam Biblioteca Metagenômica Etapas da construção de biblioteca metagenômica DNA e RNA (transcriptase reversa) são isolados diretamente do ambiente Organismos não cultiváveis Mortos (DNA) Genes transcritos (mRNA), ativos na amostra ambiental Clonados em vetores adequados (BAC) Detecção e Análise do Clone Recombinante Como encontrar o clone que contém o gene de interesse na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confecção da biblioteca genômica , de cDNA e biblioteca metagenômica ? Detecção de colônias que produzam pequenas quantidades da proteína expressa pelo gene de interesse Detecção de colônias que possuam o gene de interesse sem qualquer expressão proteica que o caracterize Detecção e Análise do Clone Recombinante Resistência a antibióticos Marcadores metabólicos: Linhagens auxotróficas Presença de inserto no plasmídio (X-gal) Seleção por bioluminescência Anticorpos para detecção de proteínas; Hibridização de colônias; Detecção e Análise do Clone Recombinante Quando o gene de interesse é expresso no hospedeiro Importante Para que a proteína seja expressa na célula hospedeira a biblioteca de cDNA terá de ser construída em um VETOR DE EXPRESSÃO cDNAs inseridos em promotores que possam ser regulados. Detecção e Análise do Clone Recombinante O Sequenciamento de moléculas de DNA >gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...) TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA Sequenciamento de DNA É uma série de métodos bioquímicos usados para determinar a ordem das bases nitrogenadas da molécula de DNA. 1977 • Frederick Sanger: Síntese de DNA in vitro por término didesóxi • Prêmio Nobel em 1977 1986-1995 • Semi-automatizado • Genoma de bactéria usando ddNTPs fluorescentes automatizados, robóticas e PCR 1999 • Perkins-Elmer Corp: Comercializado o sequenciamento totalmente automatizado HISTÓRICO Frederick Sanger Único vivo dentre os 4 indivíduos que já ganharam dois prêmios Nobel ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos da insulina Ganhou o Nobel de química em 1958 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido formil-metionina 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro de um organismo, o bacteriófago phi X 174 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“ Ganha o segundo Nobel de química em 1980 O método de Sanger, 1975 Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde) na presença de: DNA polimerase primer Tampão dNTPs (desóxinucleotídeo) ddNTPs (didesóxinucleotídeo) O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3’OH, tivesse uma extremidade 3’H? Como acontece a síntese de moléculas de DNA? http://www.youtube.com/watch?v=Mz 4LSfecM4&feature=related (dideóxi) Método de Sanger (Método de terminação da cadeia) Utiliza o mecanismo de síntese do DNA pela DNA polimerase, na presença ddNTP (didesoxirribonucleotídeos). Método de Sanger ddNTP interrompe a amplificação O didesóxinucleotídeo não tem a extremidade 3’OH livre (...) e, portanto, não permite a incorporação de novas bases a 3’ quando é adicionado, (...) interrompendo a formação da nova cadeia definitivamente Método de Sanger Interrupção controlada da replicação do DNA: utilização de didesoxinucleotídeos trifosfatados; Reação → comprimento dos fragmentos equivalem à posição do nucleotídeo no DNA. H OH P P T G H P T PP OH H H P P T G H P T PP OH ? deoxinucleotídeo dideoxinucleotídeo H OH PP P T G H P T PP OH H H PP P T G H P T PP OH ? deoxinucleotídeo dideoxinucleotídeo Método de Sanger Desoxinucleotídeos dCTPdATP dTTP DNA polimerase Primer Radioativo ou fluorescente dGTP Primer forward ou Primer reverse DNA molde (fita simples) Tampão Didesoxirribonucleotídeos ddCTP ddTTP ddGTPddATP ddATP – terminação em posições opostas a T Terminação nem sempre ocorre no primeiro T Razão dATP/ddATP Uma fita individual pode ser polimerizada por uma extensão considerável, antes que um ddATP seja incorporado Resultado: família de fitas nova, de comprimentos diferentes, cada uma terminando em um ddATP Método de Sanger • Redução do DNA em quatro grupos de fragmentos marcados. •A reação resulta em uma série de fitas marcadas de diferentes comprimentos que serão ordenadas em gel de poliacrilamida. •A análise da ordem das bandas, começando pelo final do gel, pode- se determinar a sequência do DNA sintetizado. Método de Sanger Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições controladas Necessário separar as fitas que diferem em extensão por apenas um nucleotídeo Géis desnaturantes (uréia e aquecimento a 60ºC) Separar as fitas recém sintetizadas da fita molde Leitura máxima de até 400 nucleotídeos. TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA ||||||| 5’3’ ATGCTTC 5’ 3’ A A A A A A A A A A T TT T T T T T T T T G G G G G G G G G C C C C C C C C C C C TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA ||||||||| 5’3’ ATGCTTC 5’ 3’ A A A A A A A A A A TTT T T T T T T T T G G G G G G G G G C C C C C C C C C C C TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA |||||||||| 3’ ATGCTTCTG 5’ 3’ A A A A A A A A A A T T T T T T T T T T T G G G G G G G G G C C C C C C C C C C C TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA ||||||||||||||||| 5’3’ ATGCTTCTGGCAGATCT 5’ 3’ A A A A A A A A A A T T T T T T T T T TT G G G G G G G G G C C C C C C C C C C C TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA ||||||||||||||| 5’3’ ATGCTTCTGGCAGAT 5’ 3’ A A A A A A A A A A T T T T T T TT T T T G G G G G G G G G C CC C C C C C C C C TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA ||||||||||||||| 5’3’ ATGCTTCTGGCAGAT 5’ 3’ A A A AA A A A A A T T T T T T TT T T T G G G G GG G G G C C C C C C C C C C C TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA ||||||||||||||| 5’3’ ATGCTTCTGGCAGAT 5’ 3’ A A A A A A A A A A T T T T T T T T T T T G G G G G G G G G C C C C C C C C C C C G A T C • molde • polimerase • dNTPs •ddGTPs •ddATPs •ddTTPs •ddCTPs ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA G A T C ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA https://www.youtube.com/watch?v=e3UOaIXukeQ Modelo original Marcação do primer 4 reações necessárias, uma para cada base Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos Leitura manual da sequência de baixo pra cima Etapa 1 Amplificação Tipo-PCr Etapa 2 Eletroforese Sanger e o fago Phi 174 De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas... Exercício Dê a sequência de DNA da canaleta apontada azul = Guanina amarelo = Timina vermelha = Adenina verde = Citosina http://www.youtube.com/watch?v=dUjMf2ZezIw&feature=related Montando a sequência... Modelo moderno Applied Byosystems, 1986 Marcação fluorescente do ddNTP 1 reação necessária, todas as bases lidas ao mesmo tempo Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos Leitura da automática sequência, de baixo pra cima, por um laser http://www.youtube.com/watch?v =ezAefHhvecM Leroy Hood, 1938 Sequenciamento automático Desoxinucleotídeos dCTPdATP dTTP DNA polimerase Taq polimerase Primer dGTP Primer forward ou Primer reverse DNA molde Tampão Didesoxinucleotídeos ddCTPddATP ddTTP ddGTP Kit Adaptação da PCR ao método da terminação da cadeia ddNTPs fluorescentes (fluorocromos) Leitura direta: sem uso de radioatividade Eletroforese em gel ou em capilar Fluorocromos são excitados por um feixe laser Sinais fluorescente detectados por detectores adequados (fotomultiplicadores ou câmaras CCD) Sequenciamento automático Cromatograma As máquinas necessárias para o sequenciamento Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e coloca-se na máquina de PCR para a reação de amplificação interrompida Diferenças com relação ao PCR Utilização de um só primer Utilização dos ddNTPs Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao sequenciador de DNA mais próximo O que faz um sequenciador de DNA? Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento de onda emitido pelo didesóxi Análises computacionais que identificam cada nucleotídeo pelo comprimento de onda de emissão específico de cada fluorocromo. As bases são identificadas de acordo com a forma do pico fluorescente e a distância entre os picos. Sequenciamento de até 750 nucleotídeos. Sequenciamento automático Sequenciamento automático Tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) NGS = Next Generation Sequencing começaram a ser comercializadas em 2005 e estão evoluindo rapidamente; promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida; grande economia de tempo e custo. Plataforma 454 FLX da Roche Solexa da Illumina SOLiD System da Applied Biosystems, http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a505cr1820.pdf Leitura complementar Sequenciamento de Genomas Por que sequenciar o genoma de um organismo ? • É importante conhecer o conteúdo completo de um genoma = conhecer todos os genes envolvidos em determinado processo = compreensão completa do processo. • Acesso a genes importantes = podem fornecer informações sobre sequências e mapear posições genes que foram identificados mas nunca clonados. (Versões recombinantes de proteínas importantes) • Identificação de genes para doenças humanas = estímulo original do Projeto Genoma Humano. - Identificação de genes responsáveis por doenças genéticas (terapias, tratamentos.) Sequenciamento do genoma humano em 2000 – $ 2 bilhões Francis Colins e Craig Venter (Celera) http://profissaobiotec.com.br/bioinformata-o-que-e-isso/ Leitura complementar Aulas 14: Tecnologia do DNA Recombinante
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