Aula 2- MICROSCOPIA

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Juliane Cabral Silva 
 Para estudar a célula dependemos de técnicas 
e instrumentos que foram e vem sendo 
desenvolvidos juntamente com as descobertas 
e o progresso da biologia celular. 
 Desde a antiguidade já havia tentativas de 
reforçar a visão com o auxílio de dispositivos 
ópticos, como pedaços de vidros usados como 
lentes; 
 
 No início do século XVII surgiu o microscópio 
composto, constituído de uma lente objetiva e de uma 
ocular e, no ano de 1625 Giovanni Faber cunhou o 
termo microscópio; 
 
 Em 1655, Hooke utiliza o microscópio composto para 
descrever pequenos poros e secções de rolhas, que 
chamou de “células”; 
 
◦ Tais observações lhe valeram o crédito de descobridor das 
células. 
 
 
 O uso do microscópio atingiu seu apogeu com 
Leewwnhoek, que é considerado o primeiro 
verdadeiro microscopista; 
 
 Ele usou microscópios de sua própria 
construção, dotados de uma única lente 
(microscópio simples), relatou formas e 
comportamentos de microorganismos, por isso 
ele é considerado o pai da Microbiologia. 
 
Microscópio utilizado por Anton van Leewenhoek 
Aumento de até 300x 
 Somente no início do século XIX, quando 
microscópios de boa qualidade tornaram-se 
disponíveis, pode-se descobrir que os tecidos 
animais e vegetais são agregados de células; 
 
 Isso foi proposto por Schleiden e Schwann em 
1838, marcando formalmente o início da 
Biologia Celular. 
 
* Iluminação atravessa o espécime, 
* Componentes ópticos: 
• Condensadores projeta um feixe de luz sobre o espécime, 
• Objetivas recebe a luz que atravessou o espécime e 
aumenta a imagem, 
• Oculares amplia a imagem vinda das objetivas. 
 
 
 PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA EXAME 
MICROSCÓPICO: 
* FIXAÇÃO: 
- Evita digestão celular, 
- Enrijece os fragmentos, 
- Preserva a estrutura e a composição molecular dos tecidos, 
- Realizada por métodos físicos (congelamento) ou químicos 
(imersos em soluções fixadoras – formaldeído 4%). 
* INCLUSÃO: 
- É a embebição em parafina, 
- Proporciona uma consistência rígida, 
- Realizada após duas etapas: desidratação (etanol) e 
clareamento. 
 Desidratação dos fragmentos em séries 
crescentes de etanol 
- Álcool 70% - 45 minutos 
- Álcool 80% - 45 minutos 
- Álcool 90% - 45 minutos 
- Álcool 95% - 45 minutos 
- Álcool Absoluto I - 45 minutos 
- Álcool Absoluto II - 45 minutos 
- Álcool Absoluto III - 45 minutos 
 
 Desidratação dos fragmentos em séries 
crescentes de etanol 
- Álcool absoluto (50%): xilol (50%) - 45 
minutos 
- Xilol I - 45 minutos 
- Xilol II - 45 minutos 
- Xilol III- 45 minutos 
 
 
 Parafina I – 1h a 60ºC 
 Parafina II – 1h a 60ºC 
 Parafina III – 1h a 60ºC 
 
PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO: 
 
* MICRÓTOMO 
HISTOLOGIA E SEUS MÉTODOS DE ESTUDO 
PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO: 
 
* COLORAÇÃO: 
-Evidenciam os vários componentes dos tecidos, 
-Básicos (azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina) – 
Basófilos, 
- Ácidos (orange G, eosina, fucsinia ácida) – Acidófilos. 
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE 
- Pequenas alterações no comprimento do trajeto óptico podem ser 
observadas como diferenças no contraste da imagem; 
- Aplicável a células vivas em cultura, microorganismos, fatias finas 
de tecido e partículas subcelulares (incluindo o núcleo e outros 
organelas); 
- Uma vantagem da microscopia de contraste de fase é que as 
células vivas podem ser vistas em detalhe sem a necessidade 
de colorir ou o uso de fluoróforos. 
 
 Fungo da espécie Morchella elata, visto através de 
um microscópio de contraste de fase. 
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE 
INTERFERÊNCIA 
- Gera uma “deformação” na imagem, permitindo o 
contraste interferencial, aumentando o relevo das 
superfícies do material analisado; 
- Permite a observação de materiais biológicos sem 
coloração, ex: monitoramento de cultura de célula, em 
parasitologia presta-se ao estudo da morfologia e 
taxonomia 
Cultura Celular: macrófago 
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO (filtros) 
- Apresenta dois prismas ou filtros, chamados de polarizador e 
analisador; 
- Os componentes macromoleculares birrefrigentes apresentam 
brilho colorido ou não sob o efeitodo plano da luz polarizada, 
promovendo um realce desses materiais; 
- Células musculares estriadas, espermatozóides, paredes 
celulares, colágeno, DNA. 
Corte longitudinal do Músculo estriado esquelético. 
Ampliação: 200x 
MICROSCOPIA CONFOCAL: 
• O componente de interesse do espécime deve ser marcado 
com uma molécula fluorescente, 
•A luz usada para formar uma imagem é aquela que é 
refletida pelo espécime, 
• A luz refletida é capturada por um detector, onde o sinal é 
ampliado, para ser visto em um monitor. 
MICROSCOPIA CONFOCAL 
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA: 
* Luz ultravioleta muito intensa, 
* Filtros especiais que selecionam o comprimento de onda, 
* Os corantes utilizados são substâncias que têm 
afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz 
extracelular (alaranjado de acridina – DNA e RNA). 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA: 
* Interação entre elétrons e componentes dos tecidos, 
* VARREDURA: 
-Imagens pseudotridimensionais das superfícies de células, 
tecidos e órgãos, 
-Feixes de elétrons de diâmetro muito pequeno é focalizado 
sobre o espécime varrendo sua superfície (metalizada). 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA: 
* TRANSMISSÃO: 
- Imagem proveniente do balanço da quantidade de elétrons 
que atingiram o detector e elétrons que foram retidos no tubo 
do microscópio, 
- Utiliza cortes muito mais delgados que a microscopia de luz. 
HISTOLOGIA E SEUS MÉTODOS DE ESTUDO 
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS 
* Células e tecidos são cultivados em soluções de 
composição conhecida, 
* Primeiramente as células são isoladas mecanicamente 
ou por meio de tratamento enzimático, 
* São colocadas em Placa de Petri ou lâmina (cultura 
primária). 
FRACIONAMENTO CELULAR 
 
* Isolamento e purificação de 
organelas e outros componentes 
celulares, 
* Procedimento físico realizado 
por força centrífuga (coeficiente 
de sedimentação), 
* A composição química e funções 
das organelas e moléculas podem, 
então, ser estudadas in vitro. 
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA 
* Identificam e localizam substâncias em cortes histológicas 
ou em células cultivadas, 
* Baseada em reações químicas específicas ou em interações 
de alta afinidade entre moléculas, 
* Originam substâncias insolúveis coloridas ou elétron densas 
que permitem a localização das moléculas por microscopia. 
HISTOLOGIA E SEUS MÉTODOS DE ESTUDO 
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA 
* Íons (cálcio, ferro, fosfato), 
* Ácidos nucléicos (DNA, RNA), 
* Proteínas (específicas por imunocitoquímica), enzimas 
(histoenzimático): fosfatases, desidrogenases, 
peroxidases, 
* Polissacarídeo e oligossacarídeo (glicoproteínas e 
glicosaminoglicanas), 
* Lipídios. 
DETECÇÃO DE MOLÉCULAS EM CORTES HISTOLÓGICOS POR 
MEIO DE INTERAÇÕES MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE 
* Utiliza composto específico com marcador, 
* Marcadores mais usados: substâncias fluorescentes, 
átomos radioativos, moléculas de enzimas, metais, 
* Imunocitoquímica técnicas direta e indireta (anticorpos 
monoclonais e policlonais), 
* Hibridização (in situ). 
HISTOLOGIA E SEUS MÉTODOS DE ESTUDO 
PROBLEMAS NA INTERPRETAÇÃO DE 
CORTES 
* Distorções e artefatos causados 
pelo processamento do tecido,* Visualização da totalidade do 
tecido, 
* Duas ou três dimensões.