1 Tecnicas de coloracao de Gram

Prévia do material em texto

Técnicas de coloração de Gram
- 1884 – Christian Gram
- Violeta de Metila
- álcool
- corante de fundo – safranina
 mais nítida a apresentação
Evolução dos corantes
- método diagnóstico – 80% - baixo custo bacterioscopia
- bico de busem
- microscópio
- p/garantir
Preparar seu próprio corante
- papel
- 2g de violeta de metila
Transfira p/o bequer de 500ml e adicione 100ml de álcool etílico + 100ml de álcool metílico.
Misture lentamente c/o auxílio do bastão de vidro, deixe descansar por alguns minutos, mexendo até a + completa dissolução.
Depois utilize o papel e pese 4g de oxalato de amônia, em um bequer de 1L adicione 200ml de água destilada, misture lenta e constantemente até completa dissolução sem deixar resíduos no fundo do bequer.
Junte as duas soluções e com a outra metade de água destilada (200ml), use para retirar os resíduos de violeta de metila, deixe descansar p/ 24 horas e filtre usando filtro de papel – acondicionando em vidro escuro (previamente lavado e seco) lugol concentrado.
- pese 4,5g de iodeto de potássio
- transfira p/um bequer contendo 450ml de água destilada
- c/o auxílio de um bastão de vidro, mexa até a completa dissolução
- em seguida pese 3g de iodo metálico e junte c/a solução de iodeto de potássio e continue mexendo até completa dissolução
- armazene em frasco de vidro escuro, devidamente identificado (lugol concentrado)
Na coloração usar lugol diluído, p/isso usar 2ml (concentrado) em 38ml de água destilada
Fórmulas Safranina
- pese 2,5g de safranina
- dissolva o pó em um bequer c/500ml de água destilada, misturando bem até a completa dissolução, guarde em frasco escuro devidamente identificado.
Coloração de Gram
Como é feita? Como funciona?
As modificações no método
Principais vantagens é q não precisa + fixar o esfregaço na chama, pq o corante principal, a violeta de metila, já foi preparada c/o fixador químico, o álcool metílico.
Outra grande vantagem é que a fixação química vai dar a você uma maior nitidez na visualização das estruturas coradas.
- atualmente vc começa a coloração cobrindo o esfregaço sobre uma lâmina c/uma pq qtde da violeta de metila.
- deixe o corante agir por +/- 15 segundos, depois utilize a mesma qde de água destilada para hidratar o corante (jogando a água sobre a lâmina).
- deixe agir por + 45 segundos, escorra o corante e lave a lâmina c/um fino fio d’agua.
Em seguida vc vai iniciar o processo de descoloração, vc só pode utilizar o álcool absoluto (99,5° GL), escorra o álcool até que não se desprenda mais corante, torne a lavar com água.
- cubra a lâmina c/safranina e deixe agir por +/- 30 segundos, lave novamente com descrito anteriormente.
- seque suavemente c/papel de filtro limpo ou deixe secar naturalmente, essa lâmina esta pronta p/leitura.
Você sabe o que acontece durante o processo de coloração, qdo vc utiliza a violeta de metila, todas as estruturas ficam coradas, em seguida ao utilizar o lugol a VM que é uma pararosa anilina reage c/o lugol formando um complexo chamado iodo pararosa anililina.
As bactérias que tem a parede célula composta por mureína, durante a descoloração c/álcool absoluto vão reter esse corante. (gram positiva).
Já as bactérias c/parede celular composta por ácido graxo perdem o complexo iodo pararosa anilina. Ao utilizar o corante fundo, a safranina, as bactérias q perderam corante primário vão ficar vermelhas q é a cor de fundo. (gram negativas).
Mas para que você consiga alcançar esses resultados é fundamental manter o controle de qualidade da sua coloração.
Veja como isso é feito na coloração de gram
Para manutenção do controle de qualidade no seu laboratório, vc precisa ter em estoques bactérias gram positivas e gram negativas.
Observe o modo de preparo das suas lâminas de controle de qualidade
Vc precisa de duas cepas bacterianas.
A gram positiva deverá ser um streptococcus pyogenes ATCC 19615.
A gram negativa deve ser a Escherichia Coli ATCC 25922.
Inicialmente vc precisa preparar uma suspensão bacteriana, em um tubo de ensaio c/aproximadamente 2ml de solução salina, coloque uma alçada do streptococcus pyogenes.
Junte a essa suspensão uma alcada de Escherichia coli.
Prepare a lâmina c/uma gota da suspensão bacteriana e deixe secar naturalmente.
É interessante preparar pelo menos 30 lâminas q deverão ser utilizadas durante um mês, estas lâminas devem ser estocadas em um porta lâminas em temperatura ambiente.
O controle de qualidade deverá ser sempre realizado ao término da preparação dos corantes, mesmo que sejam uma simples diluição, como no caso do lugol, e todas as vezes que o procedimento de coloração for realizado.
Com estas lâminas execute o método de coloração de gram.
Oléo de imersão examine ao microscópio utilizando objetiva de imersão.
*observação de lâmina no vídeo:
Aqui você pode notar q os cocos gram positivos ficaram roxos e os bacilos gram negativos vermelhos e bem corados.
Observe alguns resultados que podem ser obtidos utilizando esse método de coloração no diagnóstico de algumas das doenças sexualmente transmissíveis.
Diplococo gram negativo – Neisseria gononhoeae
- leveduras
- trichomonas vaginalis
- haemophilis ducreyr
Recomendações importantes sobre biossegurança
- para cuidar da sua segurança e de seus colegas de trabalho, observe os seguintes procedimentos básicos de biossegurança em laboratórios
- use sempre equipamento de proteção individual, avental longo de manga comprida, luvas descartáveis, óculos de proteção e pegadores manuais ou automáticos e qdo for o caso protetor facial.
Todo cuidado é pouco na manipulação de materiais biológicos, tais como soro, sangue, secreções redobre suas precauções por que esses materiais são potencialmente infectantes e muitas vezes estão contaminados com agente etiológicos diferentes do que se esta pesquisando.
Nunca pipete com a boca e jamais cheire plascas de cultura.
Evite a formação e propagação de aerossóis. A pipetagem, a centrifugação, a agitação de amostras, a flambagem de alças, abertura de frascos e ampolas e a manipulação de seringas c/material contaminado são as principais práticas que sem o devido cuidado levam a formação e propagação de aerossóis.
Esses vapores contém micro partículas que podem em suspenção em um ambiente ou propagar-se a distância contaminando gde número de profissionais.
Jamais re-encape a agulha, esse procedimento é a principal causa da contaminação de profissionais de saúde pelo HIV e pela hepatite em laboratórios, reduza ao máximo o manuseio de resíduos, descarte todo o resíduo, em especial os perfurocortantes diretamente em recipiente de paredes rígidas c/tampa contendo hipoclorito de sódio a 2% por mínimo 24h.
Em seguida faça a autoclavação do seu material seguindo as instruções do fabricante da autoclave. Lembre-se a manutenção periódica desse equipamento conforme as orientações técnicas é a garantia do seu bom funcionamento. Terminando o processo trate os resíduos como lixo hospitalar.
Verifique sempre as condições de operação dos equipamentos de proteção coletivo, extintores de incêndio; chuveiros de segurança; lava olhos; pia p/lavagem de mãos; caixas de areia e cabines de segurança biológica.
Identifique e sinalize os principais riscos presentes em seu laboratório, produtos e áreas que oferecem risco devem ser marcados com os devidos símbolos internacionais em etiquetas auto adesivas padrão.
Lembre-se q todos recipientes de laboratório devem estar devidamente etiquetados, tenha muito cuidado na manipulação e estocagem de subst. químicas.
Leia com atenção as informações contidas nos rótulos.
Para descontaminação pessoal, de equipamentos e superfícies fixas utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos registrados no ministério da saúde.
Seja sempre consciente da importância de suas ações na preservação da biossegurança em seu local de trabalho.
Lave as mãos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial, nunca pipete c/a boca, jamais cheire placas de cultura.
Dentro do laboratório, não fume, nãocoma, não beba, não prepare refeições.
Qdo estiver usando luvas, não manuseie objetos de uso comum: como telefone, maçanetas de porta e janelas, jornais, revistas, etc.
Não guarde alimentos e bebidas em geladeiras e freezers de armazenagem de material biológico.
Seguindo essas recomendações, você vai estar contribuindo para diminuição de acidentes.
Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratório, notifique imediatamente sua chefia, lembre-se que todo profissional de saúde, deve ser vacinado contra hepatite B.