Introdução às Enzimas

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Profa. Dra. Daniela L. Ambrósio
ENZIMAS
- Alto poder catalítico, alta especificidade para seus substratos e funcionam
em soluções aquosas sob condições moderadas de temperatura e pH
Introdução às enzimas
- Fim de 1700: a catálise biológica foi conhecida – digestão da carne pelas
secreções do estômago
- 1800: conversão de amido em açúcar pela saliva e extratos de plantas
- 1850: Pasteur concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela
levedura era catalisada por “fermentos” (não separáveis de céls vivas)
- A vida depende da existência desses catalisadores, toda reação
bioquímica é catalisada
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- Somente em 1930 esse pensamento foi aceito, após a cristalização de
outras enzimas que eram proteínas (enzimas digestivas)
- 1897: Buchner observou que o extrato de levedura poderia fermentar
- Kuhne chamou essas moléculas de enzimas
- 1926: a urease foi isolada e cristalizada por Sumner – todas as enzimas
eram proteínas
Muitas enzimas são proteínas
- Com exceção dos RNAs catalíticos (ribozimas), todas as enzimas são
proteínas
- A atividade depende da conformação nativa
- As enzimas tem PM que variam de 12 kDa a 1.000 kDa
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- Algumas requerem componentes
químicos adicionais para o desempenho
da função, chamados de co-fator (íons
inorgânicos) e/ou coenzima (complexo
orgânico ou molécula metalorgânica)
- Grupo prostético: coenzima ou íon metálico ligado muito forte ou
covalentemente à proteína
- Holoenzima: enzima cataliticamente ativa completa, juntamente com sua
coenzima ligada e/ou íon metálico
- Apoenzima ou apoproteína: parte protéica da enzima
- Isoenzima: enzimas diferentes que catalisam a mesma reação
Denominações
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- Algumas enzimas apresentavam 2 nomes diferentes, por isso, foi criada
uma concordância internacional para a nomenclatura e classificação das
enzimas
Classificação das enzimas
- Muitas foram nomeadas pela adição do sufixo “ase” ao nome do substrato
ou nome que descreva a atividade. Ex: urease (hidrólise da uréia), DNA
polimerase (polimerização dos nts para formar o DNA)
- Outras foram nomeadas pelos descobridores para uma função ampla,
antes que a reação específica fosse determinada. Ex: pepsina, do grego
pepsis, que significa digestão, lisozima de lise de paredes bacterianas.
- 6 classes contendo subclasses, baseadas no tipo de reação catalisada
1) Oxidorredutases: transferência de elétrons (íons hidretos ou átomos de H)
2) Transferases: reações de transferência de grupos
3) Hidrolases: reações de hidrólise (transferência de grupos funcionais da
água)
4) Liases: adição de grupos a ligações duplas, ou formação de duplas
ligações pela remoção de grupos
5) Isomerases: transferência de grupos dentro de moléculas para produzir
formas isoméricas
6) Ligases: formação de ligações C – C, C – S, C – O e C – N pelas reações de
condensação acopladas à clivagem do ATP
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- A cada enzima é atribuído 4 números para classificação e um nome
sistemático que identifica a reação que catalisa
ATP glicose fosfotransferase (nome trivial – hexoquinase)
n. EC (comissão de enzimas): 2.7.1.1
2 – nome da classe – transferase
7 – subclasse – fosfotransferase
1 – fosfotransferase com um grupo hidroxila como receptor
1 – D-glicose como grupo receptor de fosfato
Lista completa da nomenclatura e classificação é mantida pelo Comitê de
Nomenclatura da União Internacional de Bioquímicos e Biologia Molecular
(www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme)
ATP + D-glicose → ADP + D-glicose 6-fosfato
Como as enzimas trabalham?
- A enzima fornece um ambiente específico dentro do qual uma reação
possa ocorrer mais rapidamente
- Ligação do substrato à enzima no sítio ativo
- A superfície do sítio ativo está
revestida com resíduos de aas com
grupos que ligam o substrato e
catalisam a sua transformação
química
- O complexo enzima-substrato foi
proposto em 1880 por Wurtz
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- As enzimas afetam a velocidade da reação e não o seu equilíbrio
- A energia livre do estado basal de P é menor do que de S, então o Go é
negativo e o equilíbrio favorece a formação de P
- Barreira energética: energia requerida para alinhamento dos grupos que
reagem, a formação de cargas transitórias instáveis, os rearranjos de
ligações e outras transformações requeridas para que a reação prossiga
- Energia de ativação (G): diferença entre os níveis de energia do estado
basal e do estado de transição. Alta energia de ativação corresponde a uma
reação mais lenta
- Estado de transição: nível energético mais alto
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- A velocidade da reação pode ser aumentada pela elevação da temperatura
ou pela adição dos catalisadores que diminuem a energia de ativação, sem
afetar o equilíbrio da reação
Conversão da sacarose em CO2 e H2O
- Go é grande e negativo
- Sacarose é estável e a barreira de energia de ativação é elevada
- Nas céls a sacarose precisar ser degradada rapidamente em CO2 e H2O
para a obtenção de energia - enzimas
- Intermediários de reação: formação e decaimento de espécies químicas
transitórias – ES e EP
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Poder catalítico e especificidade
- As enzimas são catalisadores 
poderosos – velocidade 5-17x
Como a velocidade de reação é aumentada?
- Durante a reação, os grupos funcionais catalíticos podem formar uma
ligação covalente transitória com o substrato ou um grupo pode ser
transferido transitoriamente – menor energia de ativação
- A formação de ligações fracas no complexo ES específico libera energia
livre (energia de ligação)
1894: Fischer – enzima complementar ao substrato como uma chave e
fechadura
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- Polanyi (1921) e Haldane (1930) propuseram a moderna noção de catálise 
enzimática, que foi proposta por Linus Pauling em 1946
- Para catalisar uma reação, a enzima deve ser complementar ao estado de 
transição da reação
- Nas enzimas então, algumas interações fracas são formadas no ES, mas a 
complementariedade total se dá quando o substrato alcança o estado de 
transição
- Enzimas são grandes - interações suficientes para ligação e catálise do 
substrato
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- habilidade de discriminar entre o substrato e outra molécula competidora
- Grupos funcionais na enzima fazem interações fracas com o substrato no
estado de transição, uma outra molécula é incapaz de interagir no mesmo
grau. Ex: OH no substrato interage com o Glu
Especificidade
- As enzimas são estereoespecíficas, 
conseguem distinguir isômeros
- A energia de ligação é importante para a catálise:
Rearranjo dos grupos nos C1 e 2, mas 80% da aceleração da reação se deve 
à interação do C3 com a enzima
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Fatores que contribuem para barreira da reação ES
1) Redução da entropia
- Decréscimo da liberdade de movimentação das moléculas na solução, o
substrato pode ser alinhado na enzima com interações fracas (energia de
ligação)
2) Dessolvatação
- O substrato faz ligações de H com a água. Essas ligações são
substituídas pelas ligações fracas entre E e S
3) Distorção do substrato
- A energia de ligação formada somente no estado de transição
compensa termodinamicamente qualquer distorção do substrato
4) Alinhamento dos grupos funcionais catalíticos
- Ajuste induzido – a enzima sofre alteração na conformação quando o
substrato se liga, trazendo grupos funcionais específicos da enzima
para a posição apropriada de catálise e também permite a formação de
ligações fracas adicionais ao estado de transição
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Grupos catalíticos específicos
- Mecanismos que envolvem a interação covalente transitória com o S ou a 
um grupo de transferência para ou de um S
A) Catálise ácido-base geral
- Intermediários carregados instáveis tendem a se degradar rapidamente às
suas espécies reagentes constituintes- No sítio ativo da enzima, várias cadeias laterais podem atuar como
doadores e receptores de prótons, reduzindo a energia livre. Essa
transferência de prótons podem aumentar a velocidade de 102 a 105x
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B) Catálise covalente
- Ligação covalente transitória é formada entre E e S, se considerarmos X
como o grupo nucleofílico da enzima:
C) Catálise por íons metálicos
- Os metais ligados às enzimas podem ajudar o orientar o substrato para a 
reação ou estabilizar estados de transição e podem também mediar 
reações de oxido-redução
- Quase 1/3 das enzimas requerem íons metálicos para a atividade
- Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ e Co2+
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- A maioria das enzimas utiliza uma combinação de várias estratégias
catalíticas para o aumento da velocidade de reação. Ex: quimotripsina
(catálise covalente e ácido-base geral)
Cinética Enzimática
- Determinação da velocidade de catálise de uma enzima e estudo de como ela 
se altera em resposta a modificações dos parâmetros experimentais
- A concentração do substrato altera a velocidade das reações
- Estudar o efeito da [S] é complicado pois a sua concentração se altera com o 
curso da reação in vitro a medida que o S é convertido em P
Vo = velocidade inicial
Vmáx = velocidade máxima (região do platô)
saturação
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- 1913: Michaelis & Menten – a enzima primeiro se combina reversivelmente 
ao S numa etapa rápida e depois a quebra para produzir E + P é mais lenta
- Estado estacionário: quando a [ES] permanece aproximadamente
constante com o tempo
Km = constante de Michaelis: (k2+k-1)/ k1
Quando Vo é ½ Vmáx:
Diagrama de Lineaweaver-Burk ou 
duplo recíproco
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- A regra prática de que Km = [S] quando Vo = ½ Vmáx vale para todas as
enzimas que seguem a cinética de Michaelis-Menten (a exceção são as
enzimas reguladoras)
- O Km pode variar grandemente de uma enzima para outra e para diferentes
substratos para uma mesma enzima
- O Km não pode ser considerada uma simples medida de afinidade do
substrato, somente pode ser uma medida se afinidade se k2 < k-1
- Quanto menor o valor de Km, a eficiência catalítica máxima será atingida
em baixas concentrações de S
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Enzimas que catalisam reações com 2 ou mais substratos
Ex: hexoquinase
- Reações com 2 substratos usualmente envolvem a transferência de um
átomo ou um grupo funcional de um substrato para o outro
- Os diferentes substratos podem se ligar simultaneamente à enzima ou não
ATP + D-glicose → ADP + D-glicose 6-fosfato
Mecanismos de ligação de 2 substratos
A) Reação enzimática envolvendo um complexo ternário 
a) Ordem ao acaso
b) Ordenado
B) Reação enzimática sem a formação de complexo ternário
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Como o mecanismo enzimático pode ser determinado?
- Um diagrama duplo recíproco é feito utilizando-se variações de [S1]
enquanto [S2] é mantida constante
Forma complexo ternário Não forma complexo ternário
Inibição da atividade enzimática
- Inibidores enzimáticos: diminuem ou param as reações enzimáticas
- Muitos inibidores enzimáticos estão entre os compostos utilizados com
fins farmacêuticos. Ex: aspirina inibe a enzima da primeira etapa da
produção de prostaglandinas, que estão envolvidas com a dor
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1) Inibição reversível
a) Competitiva
- O inibidor compete com o substrato para a ligação no sítio ativo da
enzima
- O inibidor se assemelha ao substrato
- A competição pode favorecer o S se adicionarmos mais S
Inibição competitiva na terapia: tratamento na ingestão de metanol (gases
anticongelantes)
- O etanol compete com o metanol pelo sítio ativo da álcool desidrogenase
do fígado
metanol formaldeído
Álcool
desidrogenase
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b) Não-competitiva
- Enzimas com sítios ativos para 2 ou + substratos
- O inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio do S
c) Mista
- Se liga a um sítio diferente do S, mas se liga tanto em E quanto em ES
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2) Inibição irreversível
- Se ligam de forma covalente ou destroem o grupo funcional da enzima ou
se ligam de forma não-covalente, mas extremamente estável
- Ferramenta útil para estudos de mecanismo de reação. Ex: quimiotripsina
é inibida pelo diisopropilfluorofosfato (DIFP)
- Inativadores suicidas: não são reativos até se ligarem ao sítio ativo de
uma enzima específica. Ele sofre uma reação química e ao invés de ser
convertido em um produto, é convertido em um composto que se liga
irreversivelmente à enzima
- Esses inativadores são importantes no planejamento racional de
fármacos – específico para uma única enzima e que tenha ação somente
no sítio ativo da mesma
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Atividade enzimática dependente de pH
- Enzimas possuem um pH, ou um intervalo de pH, ideal para a máxima
atividade
- Relacionado com a presença das cadeias laterais do sítio ativo que
podem funcionar como ácidos ou bases fracos (estado de ionização)
Enzimas Reguladoras
- Vias metabólicas: reações múltiplas de degradação ou síntese em vias
seqüenciais, onde o produto de uma reação é o substrato para a outra
- Enzimas reguladoras: aumento ou diminuição da atividade catalítica em
resposta a certos sinais – ajuste às necessidades da célula
- Em geral, a primeira enzima da via é a enzima reguladora
- Tendem a ser proteínas com multisubunidades
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Modulação da atividade
1) Moduladores alostéricos
- Geralmente metabólitos pequenos ou co-
fatores que atuam por interação não-
covalente reversível
- Enzimas moduladas por este mecanismo 
são chamadas de enzimas alostéricas e 
sofrem uma mudança de conformação ao 
ligar o modulador
- Os moduladores podem ser inibitórios ou estimuladores
- Frequentemente o modulador é o próprio substrato – enzimas homotrópicas
- A enzima alostérica geralmente possui 1 ou mais sítios reguladores para a 
ligação específica do modulador
- As enzimas alostéricas são geralmente maiores e mais complexas que as 
não-alostéricas
Ex: aspartato transcarbamilase – reação 
inicial na biossíntese de nt de pirimidina
- Possui 12 subunidades, as subunidades 
reguladoras estão em vermelho e bege
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Inibição por retroalimentação
- A enzima reguladora é inibida pelo produto
final da via toda vez que a quantidade de
produto excede as necessidades da célula
- Quando a atividade da enzima reguladora é
diminuída, as outras enzimas também
diminuem a velocidade de catálise pela
diminuição de substrato
- Ex: conversão de L-treonina em L-
isoleucina pela treonina desidratase -
inibição alostérica heterotrópica
Divergência da cinética de Michaelis-Menten
Michaelis-Menten: curva hiperbólica Enzima alostérica: curva sigmóide
[S]0,5 = K0,5 = [S] qdo Vo = ½ Vmáx
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2) Modificação covalente reversível
- Grupos são removidos ou ligados a enzimas reguladoras por ação de
outras enzimas
- A modificação mais comum é a fosforilação (1/3 a ½ das proteínas
eucarióticas)
Fosforilação protéica
- Adição de grupos fosfato é catalisada por proteínas quinases e a remoção
por proteínas fosfatases
- Se a cadeia lateral modificada estiver localizada em uma região crítica
para a conformação, a modificação pode ter efeitos na ligação do substrato
e catálise
- A estrutura tridimensional determina se uma quinase terá acesso a um
certo resíduo e reconhecê-lo como substrato
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Clivagem proteolítica de precursor enzimático
- O precursor inativo, chamado de zimogênio (ou proenzima), é clivado para
formar a enzima ativa (reação irreversível) – várias proteases são reguladas
dessa forma
Ativação de uma proenzima (zimogênio) A pela retirada de um segmento D
pela enzima C, permitindo a conexão com o substrato B e sua hidrólise nos
segmentos E.
Ex: quimotripsina e tripsina
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Doenças relacionadas à enzimas
- fenilcetonúria: mutação na fenilalanina hidroxilase, enzima da primeira
etapa da conversão de fenilalanina em tirosina. O acúmulo de fenilalanina
leva ao atraso mental – teste do pezinho
- Xerodermia pigmentosa: mutações em enzimas envolvidas no reparo de
DNA, podendo levar à formação de cancros
Enzimas na Clínica
- As enzimas podem ser utilizadas como reagentes altamente específicos e
sensíveis em ensaios colorimétricos quantitativos
Glicose + 2H2O + O2 ác glicônico + 2 H2O2
H2O2 + o-dianisidina d-dianisidina oxidase (corado) + H2O
glicose
oxidase
peroxidase
- Podem ser indicadores de lesões celulares e teciduais (Ex: infarto agudo
do miocárdio, hepatite, etc)
- Métodos que analisam o consumo do substrato
Amido glicose + maltose + dextrinas
Amido não hidrolisado + iodo complexo azul
amilase
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- Métodos que analisam o produto formado
p-nitrofenilfosfato p-nitrofenol (amarelo) + PiFosfatasealcalina
timolftaleína monofosfato timolftaleína + Pi
timolftaleína + tampão alcalino coloração azul
Fosfatase
alcalina
- Métodos de absorção da coenzima (NADH absorve luz UV)
Ác láctico + NAD+ ác pirúvico + NADH + H+desidrogenaseláctica (LDH)