Resumo Biotecnologia

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BIOTECNOLOGIA - RESUMO
BIOPROSPECÇÃO
É um método ou uma forma de localizar, avaliar e explorar a diversidade de vida existente em determinado local legalmente. Seu objetivo principal é a busca de recursos genéticos e bioquímicos para fins comerciais tendo sempre como objetivo a conservação para que não se esgote o recurso almejado. Podemos destacar algumas de suas vantagens que seriam: propiciar conhecimento da biodiversidade, fornecer substâncias importantes ao homem, favorecer o crescimento econômico, gerar empregos, fazer um fundo para a conservação da área e melhorar o nível cientifico e o nível de vida do país com a utilização correta dos recursos naturais.
Não devemos confundir a bioprospecção com a biopirataria pois os recursos utilizados na forma econômica são legais enquanto na biopirataria os recursos são levados para outros países e patenteados sem o reconhecimento do governo.
BIOPIRATARIA
A biopirataria é a prática ilegal de exploração, manipulação, exportação e comercialização de recursos biológicos de um país a outro. Brasil, Indonésia, China e Índia sofrem com esse processo descontrolado. Temos o título de maior biodiversidade mundial, e por isso nossa fauna e flora estão na mira dos biopiratas e indústrias estrangeiras. Uma tentativa de resolver problemas dessa exploração foi a criação, em 1992, da Convenção da Diversidade Biológica, que busca regulamentar os recursos biológicos e a sua comercialização. Muitos contrabandistas se passam por turistas, cientistas bem intencionados e conseguem entrar em contato com integrantes de comunidades que passam todo o seu conhecimento aos interesseiros de plantão, perdendo o controle sobre os recursos gerados pelo seu conhecimento. Por aqui, a biopirataria se concentra, principalmente, na Amazônia e, ainda, na Caatinga, Pantanal e Mata Atlântica. A internet é um dos meios mais utilizados para a venda ilegal de animais silvestres. E a pena para os traficantes é de seis meses a um ano de prisão, além de multas de até R$ 5,5 mil por exemplar apreendido. De cada 10 animais traficados, nove morrem antes de chegar ao seu destino final. 
Essas áreas, além de outras ricas em fauna e flora, dão ao país o título de maior biodiversidade mundial, o que chama a atenção dos biopiratas e de indústrias estrangeiras camufladas por traz desse tráfico. Em 1992, no Rio de Janeiro, foi anunciada e assinada a Convenção da Diversidade Biológica que busca regulamentar os recursos biológicos bem como a comercialização desses. Dessa forma, como mostrado em exemplo na Eco-92, existem inúmeros movimentos que se esforçam para manter a boa funcionalidade do ecossistema.
Cálculos feitos, em 2006, pelo Ibama, mostram que o Brasil tinha um prejuízo diário de US$ 16 milhões graças à biopirataria internacional. As matérias primas e os produtos brasileiros saem daqui e são patenteados em outros países. Com isso, as empresas brasileiras não podem vender esses produtos no mercado internacional e, inclusive, são obrigas a pagar royalties para importá-los. Sem falar nas plantas nativas que saem ilegalmente do Brasil. São 20 mil extratos que saem por ano e que servem para fabricação de remédios. Como resolver o problema? Na prática, não há como proibir que pessoas e empresas patenteiem recursos biológicos e conhecimentos tradicionais sobre a fauna e a flora dos lugares. Mas existem normas que, regidas por leis internacionais, deveriam ser seguidas. Como aquela que orienta a repartição dos lucros gerados pela utilização de técnicas tradicionais e de recursos naturais por meio do pagamento de royalties às comunidades ou aos países de onde foram apropriados. Mas é claro que, na maioria das vezes, isso não acontece.
Existem casos emblemáticos de biopirataria no Brasil e em outros países do Terceiro Mundo, detentores das maiores riquezas naturais biológicas e não biológicas. Muitos autores comentam que a história da biopirataria, no Brasil, surgiu com a sua própria descoberta, quando os portugueses obtiveram o segredo da extração do pigmento vermelho do pau-brasil, subtraindo conhecimentos tradicionais dos povos indígenas nativos. Posteriormente, noticia-se o caso do inglês Henry Wickham, que levou, em 1876, sementes da árvore da seringueira para as colônias Britânicas na Malásia, que acabou se tornando o principal exportador de látex e dando fim à economia amazônica de exploração da borracha. Temos ainda o nacionalmente conhecido patenteamento do chocolate de cupuaçu, o cupulate, por uma empresa japonesa.
ENGENHARIA GENÉTICA
Um gene-repórter é um gene que codifica uma proteína, geralmente com atividade enzimática, e é facilmente detectado. Possibilita a identificação de células transformadas sem eliminar as não-transformadas. Na técnica de engenharia genética (como transgenia), é inserido conjuntamente com outros genes (ou sequências) de interesse. A atividade do gene repórter pode ser acompanhada mais facilmente - por exemplo, o gene da aquaporina produz uma proteína fluorescente verde (ela brilha no escuro e produz uma luz esverdeada), se esse gene é colocado junto com um outro gene A, se a célula (ou o organismo) apresentar um brilho esverdeado, então é quase certo que o gene A também estará presente. Então esse gene reporta - daí o nome - a presença de outro gene, que é o de interesse. (Não precisa ser exatamente um gene, pode ser uma sequência qualquer - por exemplo, uma que *iniba* a atividade de outro gene.)
Os genes repórter permitem visualizar o seu produto de expressão (produtos fluorescentes ou corados) e têm uma série de características que favorecem a sua função como ausência de produção endógena, proteína sintetizada sem interação fisiológica na célula hospedeira e atividade proteica medida simples, rápida e sensivelmente. Basicamente, o gene que se pretende estudar é substituído pelo gene repórter intencionalmente. Assim, se visualizar o produto de expressão do gene repórter, indica que a zona estudada é importante para a expressão do gene em estudo e vice-versa, sendo a quantidade de produto repórter diretamente proporcional à cor ou fluorescência emitida. Desta forma, os genes repórter são instrumentos muito importantes para o estudo de sequências reguladoras de transcrição, seja estudo de um promotor ou identificação de elementos cis. 
Organismos transgênicos como microrganismo, uma planta ou um animal, são seres que em cujo seu genoma foi inserido um gene de outro organismo. O gene introduzido contém a informação para determinada característica que é então transferida de um ser para outro. Isso ocorre porque o código genético é universal e a informação genética pode ser compartilhada entre os indivíduos. Assim apenas um pequeno fragmento de DNA é transferido para o genoma do indivíduo receptor.
 
Para que faça a transferência específica de genes de um organismo para outro se necessita de um gene marcador e um gene repórter. Os genes marcadores são utilizados na seleção, e são responsáveis por codificar uma proteína com atividade enzimática, ou para um produto, que irá conferir às células transformadas do organismo, esse gene marcador permite que apenas as células transformadas cresçam em detrimento às células não-transformadas.
  
Antes que chegassem as plantas e os animais transgênicos, os cientistas iniciaram seus experimentos com microrganismo por serem mais simples geneticamente. O primeiro organismo a receber em seu genoma uma molécula de DNA exógeno, ou seja, seu DNA modificado foi a bactéria Escherichia coli, que continha genes de sapo. Com base nesse experimento, muitos outros microrganismos transgênicos têm sido gerados para aplicações, em produção de fármacos até plásticos biodegradáveis.
TRANSFORMAÇÕES GENÉTICAS
A transformação genética existe para melhorar um gene, gerando um organismo com características fenotípicas de acordo com o desejo do transformador. Antes havia uma barreira para esse processo devido a incompatibilidade sexual, porém, após a técnica de DNA recombinante esse procedimento tornou-se possível. 
DNA recombinante:mecanismos de replicação, transcrição e tradução dependem da formação de pares de bases complementares. A técnica do DNA recombinante faz uso da complementaridade das bases (A-T, G-C). 
Tecnologias na Engenharia genética: enzimas de restrição, eletroforese em gel, introdução de um gene em um hospedeiro, uso de genes-repórteres. 
Enzimas para manipulação de ácidos nucléicos: 
- Nucleases: quebram as ligações fosfodiesters 
- Exonucleases: clivam as extremidades dos ácidos nucleicos
- Endonucleases (enzimas de restrição): cliva no interior da molécula de DNA, em regiões específicas
- Ligases: Reparam a “descontinuidade” do DNA
- Polimerases: sintetizam DNA. Fragmento de Klenow: preenche falhas durante a síntese
O objetivo do trabalho com DNA recombinante é produzir cópias (clones) de um gene particular para sua análise ou para produzir proteína. Para produzir proteína, é preciso que seja inserido em uma célula hospedeira (= transformação). 
O processo de transformação requer 3 etapas: identificação, isolamento e clonagem dos genes (transformação). Nessa primeira etapa é necessária uma série de modificações do gene antes que seja utilizado por um método de transformação. Nesse processo emprega-se métodos de engenharia genética nas quais enzimas de restrições e DNA ligases são amplamente empregadas como ferramentas para manipulação de DNA. Essas enzimas são capazes de cortar o DNA de diferentes origens, por meio da união dos fragmentos resultantes gerar moléculas novas, denominadas de DNA recombinante. Existe uma especifidade das enzimas de restrição pois o DNA sempre é cortado em locais precisos e reconhece o sítio de corte do DNA em qualquer espécie, tanto vírus, quanto plantas e animais. 
Geralmente, o gene assim obtido contém uma sequência promotora – o gene de interesse – uma sequência terminadora e um gene marcador de seleção. A sequência promotora é necessária para a correta expressão do gene, pois as enzimas responsáveis pela transcrição do gene reconhecem uma região e se acoplam a ela para que ocorra o processo. A sequência terminadora é importante para finalizar o processo de transcrição do gene. E, para seleção das células transformadas, é preciso um marcador de seleção, em geral, um gene de resistência a antibióticos ou herbicidas. 
GENE MARCADOR PROMOTOR GENE DE INTERESSE TERMINADOR 
Transformação direta e indireta: 
- Indireta: utilização de um vetor, ex. Agrobacterium rhizogenes para identificar a transferência de DNA. Uso de plasmídios, vírus e cromossomos artificiais. 
- Direta: uso de métodos físicos ou químicos, onde os principais métodos são biolística (gene gun) e eletroporação. 
Biolística = Consiste em bombear células ou tecidos com micropartículas carregando o DNA exógeno, lançadas a partir de um acelerador e por meio de uma câmara especial em condições de vácuo. O mecanismo visa penetrar na parede celular e na membrana plasmática, as duas principais barreiras à transferência direta de DNA. 
Eletroporação = consiste no emprego de impulsos elétricos curtos de alta voltagem que modificam, temporariamente, a estrutura da membrana plasmática, induzindo a formação de poros ao longo da sua superfície. Dessa maneira é possível aumentar a permeabilidade da membrana, possibilitando a entrada do gene exógeno. 
Microinjeção = processo preciso e específico para a introdução de macromoléculas dentro de uma célula ou compartimentos específicos dela, de maneira não letal. As células podem estar intactas ou desprovidas de parece celular. Para introdução do material exógeno usa-se microscópio, micromanipuladores, câmara asséptica que não sofra vibrações, com temperatura e umidade relativa controlada. É uma técnica trabalhosa, requer instrumentos caros e grande habilidade de manuseio. 
Através da técnica de transformação gênica muitos medicamentos vêm sido desenvolvidos ao longo do tempo, como por exemplo a insulina purificada injetável, e também plantas que produzem inseticidas e herbicidas utilizando bactérias tóxicas ou que degradam glifosato. Também é utilizado na agronomia e nutrição para melhoramento de grãos e mudas. 
Os riscos dos organismos modificados:
Resistência pelo uso intensivo da tecnologia – risco de desenvolvimento de “superpragas”. 
Resistência por fluxo gênico – se a infecção for cruzada, há potencial fluxo gênico para a mesma espécie ou até espécies selvagens compatíveis (taxas normais de transferências).
Para que o OGM não prejudique a saúde humana, uma série de testes devem ser feitos para saber a toxidade do produto, se vai gerar alguma alergia no consumidor, entre outros. 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Diagnóstico molecular é uma forma de prever o desenvolvimento futuro de doenças degenerativas hereditárias como o Alzheimer ou mesmo o câncer. É a utilização de ferramentas moleculares que indique ou demonstre a solução de uma questão. As técnicas mais utilizadas em um diagnóstico molecular são: eletroforese, uso de anticorpos (ELISA e Western Blot), e PCR. 
Eletroforese: separa as moléculas de DNA por tamanho e peso molecular. É uma técnica difundida e amplamente utilizada. 
ELISA: Reconhecimento antígeno-anticorpo; reconhece a presença da proteína e em que quantidade. 
Western blot: Detecção de proteínas. Informa o peso, a presença e em que quantidade ela está presente. 
PCR: Reação em cadeia da polimerase. É utilizado para detecção do DNA e multiplicação do gene. Ocorre em 3 etapas: 
Desnaturação – abertura da dupla fita tornando uma fita simples devido a um aquecimento a 95ºC por 30 segundos-; 
Anelamento ou hibridização - após a separação das fitas, um par de iniciadores (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Temperatura variável.
Extensão ou Polimerização - Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA.
O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até́ que o nível desejado de amplificação seja obtido. Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.
GENÔMICA FUNCIONAL
É um campo da biologia molecular que descreve a função de genes e proteínas. O dogma da Biologia molecular é ‘passar a informação genética”. DNA –> RNA –> proteínas.
O foco da genômica funcional é compreender as funções do DNA através dos genes, da transcrição, da tradução, e das interações proteína-proteína. As técnicas mais usadas nessa área são a análise da expressão diferenciada (Diferencial Display – DD), a análise serial da expressão gênica (Serial Analysis of Gene Expression - SAGE) e os microarranjos de DNA (Microarrays).
A células são capazes de corresponder e a enviar diversos tipos diferentes de sinais para outras células através de estímulos de moléculas do meio intra ou extracelular. A células alvo (que receberão o sinal) possuem proteínas receptoras que reconhecem o primeiro mensageiro e responde de forma específica. 
CEL SINALIZADORA –> MOLÉCULA SINAL (1º MENSAGEIRO) –> PROTEÍNAS RECEPTORAS (CEL ALVO) –> EMITE SINAL –> ALTERAÇÃO NO COMPORTAMENTO CELULAR
Transporte de proteínas: Mediado, transmembrana e vesicular. 
Proteínas que não transportadas para o núcleo são enoveladas, sua forma nativa. Jás as que serão transportadas para as organelas e vesículas estão na sua forma inativa. As proteínas que se movem do citoplasma para o núcleo são transportadas pelos poros nucleares que transpassam a membrana nuclear, e são transportadas em sua forma nativa, diferentes dos outros transportes. 
Genoma resume todos os dados transmitidos de uma geração de seres vivos para outra, armazenados em um organismo através de uma linguagem de códigos,mais precisamente no seu DNA. O genoma engloba tanto os genes, unidades essenciais no mecanismo da hereditariedade -, quanto as sequências não-codificadas, anteriormente consideradas como o monturo da estrutura genética, mas agora resgatadas por novas descobertas científicas, que revelaram sua atuação significante na regulamentação dos genes, entre outras tarefas por elas cumpridas.
O proteoma pode ser definido como o conjunto de todas as proteínas expressas em um tecido, célula ou sistema biológico em dado momento celular, ou como o perfil das proteínas celulares expressas pelo genoma de um organismo sob determinada situação fisiológica (Baracat-Pereira, 2006).
            Na prática, o estudo do proteoma pode ser classificado em proteômica estrutural, também dita proteômica da expressão, que avalia a expressão diferencial de proteínas quando se comparam células ou condições diferentes; a proteômica funcional visa caracterizar atividades biológicas dessas proteínas (Anderson et al., 2000; MacDonald e Borman, 2004; Monti et al., 2005, Baracat-Pereira, 2006).
No estudo proteômico, têm sido empregadas duas estratégias principais para separar o conjunto de proteínas presentes em uma organela, célula, tecido ou órgão em seu estado normal, assim como suas variações em diferentes situações fisiológicas e patológicas: de um lado a Eletroforese Bidimensional em Gel de Poliacrilamida (2D-PAGE), procedimento já bem conhecido e sedimentado; e de outro a cromatografia líquida multidimensional (MDLC), técnica mais recente e mais promissora para a análise de misturas complexas. Por meio dessa abordagem, identificaram um único gene (LRPPRC) dentre muitos candidatos, responsável pela Síndrome Leigh ou deficiência da citocromo oxidase c em humanos.
Transcriptoma ou Transcritoma refere-se ao conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. Portanto, ele é o reflexo direto da expressão dos genes.
O perfil do transcritoma pode variar segundo o momento (numa dada fase do ciclo celular, por exemplo), estado fisiológico, estímulos físicos, químicos, biológicos ou doenças. Como são os RNAm os codificadores das proteínas e, portanto, o centro dos interesses da pesquisa de genômica funcional; na prática ficou estabelecido que o transcritoma abrange o conjunto desta espécie de RNA. Entretanto, recentemente, os pesquisadores incluíram os microRNAs no conceito de transcritoma por representarem uma classe muito importante de pequenos RNAs (contendo aproximadamente 20 a 22 nucleotídeos) que controlam a expressão gênica ao nível pós-transcricional, impedindo a tradução dos RNAm em proteínas.
Para estudar o transcritoma os pesquisadores utilizam métodos de análise em grande escala como SAGE (serial analysis of gene expression) e os microarrays ou microarranjos (microarranjos de cDNA), os microarranjos de oligos e os DNA-chips). Recentemente o método de sequenciamento em grande escala chamado de "deep sequencing" foi introduzido no estudo do transcritoma, mas devido seu alto custo a as dificuldades de análise dos dados, esse método ainda não é rotina.
Metaboloma: presença e abundância de metabólitos.