Aula 10 Resumo Aula Desenho de primers Parte 01

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ 
CAMPUS DE PARNAÍBA 
CURSO DE BIOMEDICINA 
Disciplina: BIOINFORMÁTICA 
Prof. Jefferson Soares de Oliveira 
 
 
Resumo aula - Desenho de Primers 
 
 A PCR (polymerase chain reaction) é uma reação em cadeia da polimerase que permite 
a amplificação exponencial de segmentos de DNA in vitro. A reação se processa em diferentes 
etapas, cada uma em uma temperatura controlada por um aparelho denominado termociclador. 
A primeira é a etapa de desnaturação térmica do DNA (~95ºC). Nesta temperatura as fitas de 
DNA serão completamente separadas. Em seguida a etapa anelamento dos primers 
(50~60ºC). Nesta etapa ocorre o pareamento dos primers por complementariedade. A 
temperatura utilizada dependerá da composição de bases do primer. E a terceira etapa é a 
extensão do DNA. A extensão ocorre a 72ºC, temperatura em que a TaqPolimerase (uma DNA 
polimerase) apresenta melhor atividade. Estas três etapas compõem um ciclo da PCR e se 
repetem por várias vezes, permitindo a amplificação de uma região do DNA. A definição da 
região a ser amplificada é determinada pelo par de primers, que funcionam como iniciadores da 
polimerização, delimitando a região do DNA a ser copiada. Os primers são oligonucleotídeos 
que apresentam sequência complementar a região de anelamento. Cada um dos primers 
introduzidos na PCR irá parear com uma das fitas de DNA. Os primes precisam apresentar 
algumas características para que se obtenha sucesso na PCR. Dentre as características 
temos: 
 - Conteúdo CG deve estar por volta dos 50 %. Isso garante que o primer apresente uma 
maior especificidade de interação com a região de complementariedade. Lembre-se que a 
etapa de anelamento ocorre em uma temperatura menor que a de extensão. A elevação da 
temperatura faz com que a interação entre o primer e a região de complementariedade do DNA 
diminua. Se o conteúdo CG for muito menor que 50% eles irão se dissociar completamente. 
 - Não devem conter complementariedade entre suas bases: um primer não pode conter 
complementariedade com ele mesmo ou com o seu par. Se estes eventos ocorrerem, 
observaremos a formação de estruturas denominadas de auto-dímeros e dímeros. Caso 
ocorram em temperaturas próximas daquelas utilizadas nas etapas da PCR, ao invés do primer 
parear com a região do DNA de interesse ele estará pareando com outro primer, reduzindo a 
eficiência do processo. 
 - A temperatura de anelamento entre os primers não deve diferir mais do que 3ºC. Para 
se determinar a temperatura de anelamento dos primers, devemos partir da formula do cálculo 
da temperatura de melting (Tm = 2(A+T) + 4(G+C) ºC), onde A, T, G e C, devem ser 
substituídos pela quantidade de vezes que cada uma das bases aparece no primer. Após 
obtenção deste valor utilizaremos a seguinte fórmula para obtenção da temperatura de 
anelamento: Tanelamento = Tm(primer) – 4 ºC. A formula será utilizada para cada um dos dois 
primers. Ao final, a diferença entre os primes deverá ser < 3 [Tanelamento(primer esquerda) - 
Tanelamento(primer direita) < 3]. Isso garante que no momento de se determinar a temperatura 
de analemanento no termociclador, ambos os primers estarão pareando com o DNA o mais 
próximo o possível da sua temperatura ótima de anelamento. Existem outras maneiras de se 
calcular a temperatura de anelamento, mas esta será a utilizada em nossa disciplina. 
 Após análise das características básicas, iremos construir um par de primers, com o 
objetivo de amplificar uma determinada região de um gene humano de interesse. A primeira 
etapa a ser realizada é encontrar a região genômica que apresenta o gene de interesse. Para 
isso, iremos realizar uma busca no banco de dados do NCBI pelo gene de interesse utilizando 
um banco de dados de genes. Iremos acessar o gene correspondente em humanos e a partir 
desta busca acessar a sequência de nucleotídeos do gene clicando no link RefSeqGene 
presente na barra lateral direita do site. Ao acessar, clicando em GenBank, será apresentado a 
região do DNA que contém o gene de interesse. Nesta página iremos buscar pelo éxon que 
desejamos estudar, copiar sua sequência de nucleotídeos e colar em um arquivo do Microsoft 
Word. 
 A próxima etapa é procurar a mesma região do DNA em um segundo banco de dados, o 
Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html). Este banco de dados armazena sequências de 
nucleotídeos de vários organismos e possui uma ferramenta que permite que todos os 
polimorfismos genéticos já identificados em uma região do DNA sejam mostrados. Esta 
informação será de grande relevância na hora de se determinar as regiões de anelamento dos 
iniciadores, como veremos a seguir. Inicialmente, iremos acessar este banco de dados e na 
ferramenta de busca iremos restringir a consulta para humanos (human) e definir o gene que 
desejamos encontrar (o mesmo utilizado na consulta no banco de dados do NCBI). Geralmente 
o primeiro resultado mostrado se refere à consulta de interesse. Ao acessar este resultado 
serão apresentadas informações gerais sobre o gene. Como desejamos obter informações 
sobre a sequência de nucleotídeos, devermos clicar no link Sequence localizado na barra 
lateral esquerda. Ao clicar neste link será mostrada uma região do DNA que apresenta o gene 
de interesse. 
 Nesta página não há informações que mostrem quem é cada um dos éxon, como 
observamos no site do NCBI. Observamos apenas a presença de éxon e de íntrons pela 
mudança de coloração. Uma maneira fácil e rápida de se encontrar a localização de um éxon 
de interesse é realizar uma busca na página a partir de uma região do éxon obtida 
anteriormente pelo site do NCBI. Esta consulta deve ser realizada utilizando a ferramenta 
localizar do navegador. Uma vez encontrada, para termos certeza que esta corresponde à 
sequência presente no banco de dados do NCBI utilizaremos uma ferramenta de alinhamento 
de duas sequências presente no BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Na parte 
inferior da página, na guia “Specialized BLAST”, devemos acessar a ferramenta “Align two (or 
more) sequences using BLAST (bl2seq)”. Esta ferramenta irá comparar o grau de semelhança 
entre as sequências do NCBI e Ensemble. Observem que a ferramenta apresenta dois locais 
de consulta. Em um deles devemos colocar a sequência do NCBI e no outro a do Ensemble. 
Em seguida, clicamos em BLAST. O resultado que será mostrado é semelhante ao uso da 
ferramenta “blastn”. Se as sequências são similares, valor de score maior que 200, 
confirmamos que a sequência encontrada no banco de dados do Ensemble corresponde ao 
éxon de interesse. 
 Depois desta confirmação, contando a partir dele e de baixo para cima, conseguimos 
identificar sua posição dentre os outros éxons que são apresentados para o gene. Em seguida, 
no topo da página, na barra lateral direita, devemos clicar sobre a ferramenta “Configure this 
page”. Na janela que será aberta, iremos alterar a opção na linha “Show variation” de “no” para 
“yes”. Em seguida devemos clicar no botão presente no topo do lado esquerdo da janela para 
que esta seja fechada e as alterações sejam salvas. Ao se realizar estas alterações, serão 
apresentados todos os polimorfismos genéticos já identificados na região deste gene. Cada 
letra marcada corresponde a um polimorfismo que já foi identificado. A próxima etapa será 
encontrar o éxon de interesse. Como agora são apresentados polimorfismos genéticos, 
dificilmente conseguiremos encontra-lo utilizando a ferramenta de busca do navegador, como 
realizado anteriormente. Por isso é importante lembrarmos a posição do éxon de interesse para 
que possamos encontrá-lo. Depois de encontrado o éxon, agora apresentando os 
polimorfismos, iremos copiá-lo para o Microsoft Word, juntamentecom uma região flaqueadora. 
No Microsoft Word, iremos formatar a sequência obtida do banco de dados do Ensemble 
para que a mesma seja analisada pelo programa “Primer3” (http://bioinfo.ut.ee/primer3-
0.4.0/primer3/). O programa irá analisar a formatação realizada na sequência e propor um par 
de primes para amplificação do éxon de interesse. De acordo com as instruções do programa, 
deveremos colocar colchetes (Ex.: ...ATCT[CCCC]TCAT...) ao redor da região central. Esta 
marcação idicará a região que o par de primer irá flanquear. E com sinal menor que e maior 
que (Ex. ...ATCT<CCCC>TCAT...) marcar as regiões que são consideradas como indesejáveis, 
como por exemplo os polimorfismos. Após formatação, devemos colar a sequência formatada 
para o campo de consulta do programa Primer 3 e em seguida clicar em “Pick primers”. O 
programa irá apresentar o melhor par de primers gerado a partir da análise da sequência, 
respeitando as características que o primer deve apresentar como o conteúdo CG(%), 
temperatura de melting variando menos de 3ºC entre s primers e ausência de regiões com 
complementariedade. 
Observem que a sequência de DNA obtida do banco de dados do NCBI foi inicialmente 
utilizada somente para auxiliar nós encontrarmos a mesma região no banco de dados do 
Ensemble. No momento de se realizar a construção dos primes deveremos utilizar 
preferencialmente a sequência obtida a partir do banco de dados do Ensemble uma vez eu 
nela poderemos observar os polimorfismos genéticos já identificados na região que flanqueia a 
sequência que se deseja amplificar. Desta forma, estas podem ser evitadas na hora de se 
construir os primers. O anelamento de um primer em uma região que apresenta polimorfismo 
pode influenciar na eficiência da amplificação.