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2 Princípios da Biologia Molecular do Gene

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31
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
CROMOSSOMOS, GENES E DNA
As atividades vitais da cØlula viva sªo coor-
denadas por entidades denominadas genes, que
codificam os caracteres hereditÆrios ou genØti-
cos do indivíduo, como, por exemplo, tipo de
sangue, altura, peso, cor de olho e cabelo, sensi-
bilidade a certas drogas, etc. O meio ambiente
pode ter influŒncia decisiva na expressªo dos
genes, de maneira que dizemos que a interaçªo
dos genes (genótipo) com o meio ambiente re-
sulta no fenótipo do indivíduo. Um fenótipo pode
ser resultante da expressªo de um par de genes
(por exemplo, grupo sangüíneo ABO) ou de vÆ-
rios genes (por exemplo, altura).
Os genes estªo presentes em todas as cØlulas
do organismo, com exceçªo daquelas que perde-
ram o nœcleo durante a diferenciaçªo celular, como
Ø o caso das hemÆcias. PorØm, nem todos os genes
sªo expressos igualmente em todas as cØlulas. Na
verdade, cada tipo celular caracteriza-se pela ex-
pressªo de determinados tipos de genes. Altera-
çıes nos genes podem levar a mudanças dramÆticas
na fisiologia celular, como, por exemplo, a trans-
formaçªo de uma cØlula normal em maligna.
Os genes estªo localizados em estruturas
filamentosas, longas, localizadas no interior
Princípios da Biologia
Molecular do Gene
do nœcleo celular denominadas cromossomos
(Fig. 2.1). No cromossomo, os genes estªo
dispostos linearmente, isto Ø, um ao lado do
outro, enfileirados tal como as contas de um
colar. Os dados disponíveis indicam que o
cromossomo corresponde a uma enorme
molØcula de DNA. As bactØrias e os vírus pos-
suem apenas um cromossomo que geralmente
Ø circular, isto Ø, as extremidades da molØcula
de DNA estªo ligadas entre si. Nos demais
organismos (protozoÆrios, fungos, metazoÆ-
rios), normalmente existem mais de um cro-
mossomo por nœcleo. As cØlulas humanas
possuem 23 cromossomos, os quais estªo dis-
tribuídos aos pares nas cØlulas germinativas e
somÆticas. Por este motivo, estas cØlulas sªo
conhecidas como cØlulas diplóides e designa-
das por 2n = 46. Por outro lado, os gametas
sªo haplóides (n = 23), isto Ø, o gameta possui
uma cópia de cada cromossomo. Com a fusªo
do óvulo (n = 23) e espermatozóide (n = 23) res-
taura-se o estado diplóide no zigoto (2n = 46).
Na divisªo celular, os cromossomos sªo du-
plicados e distribuídos às cØlulas-filhas. Na mi-
tose, as cØlulas parentais (cØlulas-mªes) e as
filhas apresentam o mesmo nœmero de cro-
JosØ Franco da Silveira
MÆrcia R. Machado dos Santos
32
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Fig. 2.1 — A relaçªo entre o cromossomo e a molØcula de DNA. Cromossomo metafÆsico mostrando a participaçªo da
molØcula de DNA na sua constituiçªo. Na figura estÆ representada apenas a molØcula de DNA constituinte de uma das
cromÆtides homólogas.
30nm
DNA
Proteínas
Histonas
200nm
30nm
mossomos, logo, a mitose Ø uma divisªo eqüita-
tiva. Na meiose, as cØlulas-filhas recebem ape-
nas uma cópia de cada cromossomo, logo, a
meiose Ø uma divisªo reducional. Ela ocorre nas
cØlulas germinativas gerando os gametas (óvulo
e espermatozóide). Na meiose ocorre a recom-
binaçªo genØtica (crossing-over ou permutaçªo),
evento fundamental para a manutençªo da va-
riabilidade genØtica das espØcies.
O conjunto de genes de um organismo cons-
titui o seu patrimônio hereditÆrio ou genØtico e
Ø denominado genoma. No caso da espØcie hu-
mana, o genoma corresponde ao conjunto com-
pleto de cromossomos haplóides que contØm
toda a informaçªo genØtica de um indivíduo.
ESTRUTURA DO DNA E REPLICA˙ˆO DO
DNA
Quimicamente, o gene Ø constituído pelo
Æcido desoxirribonuclØico (DNA). O DNA Ø um
polímero formado por monômeros denomina-
dos nucleotídeos (Fig. 2.2). O nucleotídeo apre-
senta na sua constituiçªo um grupamento
fosfórico (P~P~P), um açœcar do tipo pentose
(desoxirribose) e uma base nitrogenada. A base
nitrogenada pode ser uma purina (adenina ou
guanina) ou uma pirimidina (timina ou citosi-
na). As bases nitrogenadas sªo designadas abre-
viadamente por A (adenina), T (timina), C
(citosina) e G (guanina). Na molØcula de DNA,
P
P
P
P
P
P
P
P
A
A
O
O
C5’
3’
T
3’
O
5’C
C5’
3’ G
C
3’
O
5’C
C5’
O
3’
C
G
3’
O
5’C
C5’
O
3’
T
3’
O
5’C
33
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
Fig. 2.2 — Estrutura do nucleotídeo. Nucleotídeos componentes da molØcula de DNA. Abaixo estªo representadas as
bases nitrogenadas encontradas nos Æcidos nuclØicos. Notar que timina e uracila encontram-se no DNA e no RNA, respec-
tivamente.
os nucleotídeos estªo ligados entre si atravØs
da ligaçªo fosfodiØster (Fig. 2.3) que envolve o
grupo fosfórico situado no carbono 5’ da pen-
tose de um nucleotídeo com a hidroxila situada
no carbono 3’ da pentose do nucleotídeo vizi-
nho. Na cadeia do DNA, encontramos duas ex-
tremidades denominadas extremidades 5’ e 3’.
O nucleotídeo presente na extremidade 5’ ca-
racteriza-se pela presença de um grupo fosfó-
rico (P~P~P) livre, isto Ø, o grupo fosfórico
presente no carbono 5 nªo participa da ligaçªo
fosfodiØster. Na extremidade oposta ou extre-
midade 3’, a hidroxila (OH) do carbono 3 do
œltimo nucleotídeo estÆ livre, isto Ø, ela nªo
estÆ comprometida com a ligaçªo fosfodiØs-
ter, portanto, um novo nucleotídeo só pode
ser adicionado na posiçªo 3’. Durante a sínte-
se da cadeia de DNA, a enzima DNA polime-
rase sempre adiciona um novo nucleotídeo na
posiçªo 3’ (Fig. 2.4). Desta maneira, dizemos
que a síntese do DNA ocorre sempre no sentido
de 5’ para 3’ (5’ fi 3’).
O
C CH3
C
C
O
HN
CH
N
Base nitrogenada
OO
Desoxiribose
C 1
OCH2
5
Fosfato 4 C
3 C C 2
HOH
H
Uracila
HC
N
C
N
NH2
CH
C
C
N
N
HAdenina Guanina
H2N
HN
C
C
C
C
CH
N
N
H
Timina Citosina
CH3
O
N
NH2
N
H
CH
CHN
C
O
CH
HN
N
H
C
C
O
C
O
CH
CH
C
C
N
H
H N
O
O
C
O
O
O–
–O P
34
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
A molØcula de DNA consiste em duas ca-
deias (fitas) complementares do DNA, unidas
lado a lado pelas pontes de hidrogŒnio (ligaçıes
fracas direcionadas) entre as bases nitrogena-
das formando uma dupla hØlice (Fig. 2.5). De
maneira simplista, pode-se dizer que a molØ-
cula seria comparÆvel a uma escada, onde cada
degrau seria constituído por um par de bases
nitrogenadas (A-T ou G-C) e o corrimªo for-
mado por desoxirriboses (açœcar) e fosfatos.
Deve-se salientar que as cadeias sªo comple-
mentares (elas nªo sªo iguais), isto Ø, a adeni-
na de uma cadeia pareia com a timina da cadeia
complementar e a guanina com citosina. Na
interaçªo entre guanina e citosina participam
trŒs pontes de hidrogŒnio, enquanto entre ti-
mina e adenina existem duas pontes de hidro-
gŒnio. Pode-se tambØm notar que as cadeias
estªo dispostas em sentido antiparalelo, isto Ø,
uma cadeia corre no sentido de 5’ para 3’, en-
quanto a outra corre no sentido de 3’ para 5’.
As cadeias sªo mantidas unidas entre si por pon-
tes de hidrogŒnio entre as bases nitrogenadas.
Como mostrado na Fig. 2.5, as cadeias com-
plementares do DNA formam uma dupla hØli-
ce regular.
A duplicaçªo da molØcula de DNA Ø catali-
sada por uma enzima denominada DNA poli-
merase. Na síntese do DNA, ocorre a separaçªo
das duas cadeias da dupla hØlice (desnaturaçªo)
e cada uma das cadeias serve de molde para a
síntese das novas cadeias pela enzima DNA po-
limerase (Fig. 2.6). A cadeia recØm-sintetiza-
da serÆ complementar à cadeia molde. Este
modelo de replicaçªo foi demonstrado expe-
rimentalmente e Ø conhecido como replicaçªo
semiconservativa do DNA.
Para o início da replicaçªo Ø necessÆrio que
a fita molde contenha uma pequena regiªode
dupla fita conhecida como primer ou iniciador.
O primeiro nucleotídeo da cadeia a ser sinteti-
zada serÆ adicionado na posiçªo 3’ do primer
ocorrendo entªo a extensªo da cadeia de DNA
pela adiçªo de outros nucleotídeos. Como foi
discutido acima, a DNA polimerase adiciona um
novo nucleotídeo na posiçªo 3’ do nucleotídeo
da cadeia que estÆ sendo sintetizada (Fig. 2.4).
Desta maneira, voltamos a insistir no conceito
de que a cadeia de DNA Ø sintetizada no senti-
do 5’ fi 3’ de maneira que o ultimo nucleotídeo
adicionado à cadeia terÆ a hidroxila na posiçªo
3’ livre.
Fig. 2.3 — Ligaçªo fosfodiØster. Esquema mostrando a ligaçªo entre dois nucleotídeos atravØs da ligaçªo fosfodiØster. A
ligaçªo ocorre entre o grupo fosfórico (P~P~P) do carbono 5 da desoxirribose de um nucleotídeo com a hidroxila (OH) do
outro nucleotídeo.
Ligação
fosfodiéster
3’ OH
3’ OH
3’ OH
5’
P
O
A
T
O
P
O
+
5’
P P P
O C
5’
P
C
P P P
P
C
O
5’
O
3’
O T
O
O
P A
+
35
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
Fig. 2.4 — Síntese de DNA pela enzima DNA polimerase. Notar que a cadeia tem duas extremidades: a extremidade 5’
na qual encontra-se um grupamento fosfórico (P~P~P) e a extremidade 3’ onde hÆ uma hidroxila (OH).
É importante salientar que a DNA polime-
rase tambØm possui a capacidade de reconhecer
os seus próprios erros e corrigi-los. Quando um
nucleotídeo Ø adicionado na posiçªo errada (por
exemplo, um T onde deveria estar um G), ela
percebe o erro, remove o nucleotídeo e adiciona
o nucleotídeo correto. Desta maneira, a DNA
polimerase, alØm da atividade biossintØtica (po-
limerase), tem tambØm atividade de exonuclea-
se, isto Ø, que permite a remoçªo do nucleotídeo
incorreto na cadeia.
O FLUXO DA INFORMA˙ˆO GENÉTICA NA
CÉLULA: CÓDIGO GENÉTICO, RNAS E
PROTE˝NAS
A informaçªo genØtica estÆ contida nas se-
qüŒncias de nucleotídeos da molØcula de DNA,
o que significa dizer que cada gene possui uma
seqüŒncia de nucleotídeos própria e específica.
Desta maneira, dois genes diferentes apresen-
tam seqüŒncias de nucleotídeos diferentes. Em
uma família gŒnica, como, por exemplo, no caso
dos genes que codificam a globina, os diferentes
membros da família apresentam uma razoÆvel
homologia entre si no nível da seqüŒncia de nu-
cleotídeos.
A mensagem contida no gene (DNA) Ø trans-
mitida ao citoplasma da cØlula atravØs do RNA
mensageiro (RNAm) em um processo conheci-
do como transcriçªo. Nos ribossomos, a men-
sagem contida no RNAm Ø decodificada, ou seja,
traduzida, originando uma proteína específica.
Esta etapa Ø denominada traduçªo. Desta ma-
neira, o fluxo da informaçªo genØtica segue o
caminho indicado abaixo:
gene (DNA) fi RNAm fi Proteína
O RNAm Ø sintetizado por uma enzima de-
nominada RNA polimerase que utiliza como
molde uma das fitas do DNA em um processo
denominado transcriçªo gŒnica. Notar que ape-
nas uma das cadeias do DNA serve como molde
para a síntese do RNA (Fig. 2.7). Portanto, o
RNA Ø exatamente igual a uma das cadeias do
DNA, excetuando-se a timina que Ø substituída
por uracila no RNA. A cadeia ou fita de DNA
que contØm a informaçªo Ø denominada cadeia
ou fita codificadora (Fig. 2.7).
A seqüŒncia de nucleotídeos do DNA e
conseqüentemente do RNAm contØm a infor-
maçªo necessÆria para a síntese de uma proteí-
Base
Açúcar
DNA Polimerase
Ligação Fosfodiéster
Pirofosfato
Adição de um novo nucleotídeo
na extremidade 3’ da cadeia
5’
P
O
O
O
O
3’ OH
5’
5’
O
O
O
O
3’ OH
36
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Fig. 2.5 — Estrutura do DNA: a dupla hØlice. (A) A dupla hØlice, segundo o modelo de Watson & Crick. (B) Esquema
mostrando que os degraus sªo constituídos por bases nitrogenadas e os corrimıes por açœcar (desoxirribose) e fosfato. (C)
Pontes de hidrogŒnio entre as bases nitrogenadas.
na. As proteínas sªo constituídas por unidades
conhecidas como aminoÆcidos, existindo 20 ti-
pos diferentes de aminoÆcidos que podem ser
encontrados em uma proteína. A cadeia polipep-
tídica Ø formada por uma seqüŒncia linear de
aminoÆcidos. O RNAm contØm a informaçªo ge-
nØtica que determina a ordem e os tipos dos ami-
noÆcidos presentes em uma dada proteína. A
informaçªo genØtica estÆ contida no chamado
código genØtico (Tabela 2.1). O código genØtico
Ø o alfabeto usado pelos seres vivos para codifi-
car e transmitir as informaçıes contidas nos ge-
nes. O código genØtico Ø formado de quatro letras
compostas pelas bases nitrogenadas presentes no
DNA (A, T, G, C). No código genØtico as pala-
vras sªo formadas pela combinaçªo de trŒs bases
nitrogenadas, existindo, portanto, 16 combina-
çıes possíveis. Desta maneira, os aminoÆcidos
presentes nas proteínas sªo codificados por uma
combinaçªo de trŒs bases nitrogenadas. Cada
A) B)
C)
V
o
l
t
a
C
o
m
p
l
e
t
a
Cavidade
maior
Corrimão
Açúcar/Fosfato
Cavidade
menor
Eixo central
Citosina AdeninaGuanina Timina
Desoxi-
ribose
Desoxi-
ribose
Desoxi-
ribose
Desoxi-
ribose
20A
34A
H
N-H-----O
(+) (–)
(–) (+)
N-----H-N
(–) (+)
O-----H-N
H
NO
N
N
N O
(–)
(+)
O N
O
ON
N
N
(+)
(–)
N-H----N
CH3 O----H-N
H
3’
 OH
5’
 C
O
C GO
P
P
O
G CO
P
P
O3’
3’5’
5’
O T
T
A
A
P
T A
P
P
P
O
O
P
AT
O
P
O
O
O
P
CG
5’
 C
3’
 OH
3,4A
37
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
Fig. 2.6 — A replicaçªo do DNA. As cadeias da molØcu-
la-mªe (em cinza claro) se separam e serve de molde (tem-
plate) para a síntese da nova cadeia (em cinza escuro).
Notar que a fita recØm-sintetizada (em cinza escuro) Ø com-
plementar à fita molde.
Fig. 2.7 — Transcriçªo gŒnica (síntese de RNA). Notar que a fita superior do DNA Ø a fita codificadora. A composiçªo de
bases do RNA Ø exatamente igual a da fita superior do DNA, substituindo-se timina (T) por uracila (U) no RNA. À medida
que a síntese progride, a molØcula de RNA separa-se do DNA.
do. Existem alguns códons que nªo codificam
nenhum aminoÆcido, mas, pelo contrÆrio, indi-
cam o fim da mensagem. Eles sªo conhecidos
como códons de terminaçªo (stop codon). Em
todas as mensagens, o primeiro códon (ATG)
codifica o aminoÆcido metionina e Ø designado
como códon de iniciaçªo.
No RNAm maduro, podemos definir uma
regiªo denominada fase de leitura aberta (ORF=
open reading frame) que codifica um polipeptí-
deo específico. A ORF Ø definida pela presença
de um códon ATG no seu início, finalizando com
um códon de terminaçªo (Fig. 2.8). Deve-se no-
tar que o RNAm contØm regiıes que nªo sªo
codificadoras, ou seja, nªo sªo traduzidas. A
regiªo situada na porçªo 5’ do RNAm a mon-
tante (upstream) do códon de iniciaçªo e a re-
giªo situada na porçªo 3’ do RNAm a justante
(downstream) ao códon de terminaçªo nªo sªo
codificadoras. Estas regiıes sªo conhecidas
como regiıes nªo traduzidas (UTR = untrans-
lated region). AlØm disso, nos RNAm dos euca-
riotos existe a adiçªo de uma cauda de adenina
na porçªo 3’ do RNAm (cauda poli A).
O CONCEITO DE GENE
(GENOMA, PROJETO GENOMA)
De maneira geral, pode-se dizer que um
dado gene corresponde a um trecho de uma
molØcula de DNA que codifica uma proteína
ou um RNA (RNA ribossômico, transporta-
dor etc.). AlØm das regiıes UTR jÆ citadas,
muitos genes dos organismos eucarióticos sªo
Nova
MoldeMolde
Fitas complementares de DNA
Fita de RNA
uma destas combinaçıes Ø conhecida como có-
don. Por exemplo, o códon AGG codifica o ami-
noÆcido arginina. Pode ocorrer de um mesmo
aminoÆcido ser codificado por códons diferen-
tes, por isto, o código genØtico Ø dito degenera-
A--T
C--G
T--A
G-C
T--A
A--T
C-G
C--G
A
T
G
A--T
C---G
C
A
T
C-GA--TT--A
G-C
T--A
C--G
A--TC-G
C-G
A--TC-G
T--A
T--A
C-G
5’
5’
5’
3’
3’
T
G
C C A A
T G G
C T T A T T T
3’
C C C T A
A TG
U
C
C
U
A
A
GG C
UU A U U
C G A A T A A
A G G
G A T
T--A
38
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Tabela 2.1
O Código GenØtico. A Combinaçªo de TrŒs Nucleotídeos (Códon) Codifica um
AminoÆcido ou Sinaliza o Fim da Síntese de Cadeia Polipeptídica
 2a base
1a 3a
base U C A G base
UUU
Phe
UCU UAU
Tyr
UGU
Cys
U
U UUC UCC Ser UAC UGC CUUA
Leo
UCA UAA Fim UGA Fim A
UUG UCG UAG Fim UGG Trp G
CUU CCU CAU
His
CGU U
C CUC Leo CCC Pro CAC CGC Arg CCUA CCA CAA
Gin
CGA A
CUG CCG CAG CGG G
AUU ACU AAU
Asn
AGU
Ser
U
A `UC Ile ACC Thr AAC AGC CAUA ACA AAA
Lys
AGA
Arg
A
AUG Met ACG AAG AGG G
GUU GCU GAU
Asp
CGU U
G GUC Val GCC Ala GAC GGC Gly CGUA GCA GAA
Glu
GGA A
GUG GCG GAG GG G
interrompidos por seqüŒncias nªo codificado-
ras denominadas introns.
É importante salientar que existem no ge-
noma muitas seqüŒncias de DNA que nªo sªo
propriamente seqüŒncias codificadoras, como,
por exemplo, as regiıes intergŒnicas e as seqüŒn-
cias repetidas (micro- e minissatØlites, retro-
tranposons, retroposons etc.). No homem,
somente cerca de 8% do genoma Ø constituído
por genes tal como definido acima. O restante
do genoma humano Ø constituído por seqüŒn-
cias de DNA correspondentes aos introns, regi-
ıes intergŒnicas, cópias de retrovírus e
seqüŒncias repetidas de funçªo desconhecida.
Na realidade o conceito de gene nªo Ø defi-
nitivo, adaptando-se às novas informaçıes so-
bre a estrutura e organizaçªo do genoma. Mas
de toda maneira, o gene sempre corresponde a
um trecho de uma molØcula de DNA e ele Ø ca-
racterizado pela seqüŒncia de nucleotídeos des-
te trecho.
O tamanho de uma seqüŒncia de DNA ou
de um gene pode ser expresso em nœmero de
pares de bases (pb), pois, como foi visto, o DNA
Ø constituído por repetiçıes de bases nitrogena-
das (nucleotídeos). O tamanho de um gene estÆ
relacionado com o produto por ele codificado
(proteína ou RNA estrutural), como pode tam-
bØm estar relacionado com o tipo de processa-
mento ao qual o seu transcrito Ø submetido.
Assim, pode-se encontrar genes constituídos por
150pb ou genes com mais de 50.000pb.
O tamanho ou complexidade do genoma de
um organismo tambØm pode ser expresso em
nœmero de pares de bases. A bactØria Escherichia
coli possui um œnico cromossomo constituído por
4.639.221pb, um genoma relativamente peque-
no e simples quando comparado com o dos ma-
RNAm
5’ CAUGG...UCG AUG AAC AAA GAU AGU UUU AGG CUA UAA GGCA... AAA(n) 3’
Proteína Met Asn Lys Asp Ser Phe Arg Leu Fim
UTR UTR
Fig. 2.8 — Estrutura do RNAm. As regiıes 5’ e 3’ nªo-traduzidas (UTR = Untranslated Region), a fase de leitura aberta
(ORF = Open Reading Frame), os códons de iniciaçªo (ATG) e terminaçªo (TGA) e a cauda poli-A estªo indicados.
ORF
39
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
míferos. O genoma haplóide humano Ø constitu-
ído por 3 bilhıes pb que formam os 23 cromos-
somos. Por exemplo, os cromossomos 1 e 21 do
homem sªo constituídos por 300 milhıes pb e 50
milhıes pb, respectivamente. A seqüŒncia com-
pleta de nucleotídeos do genoma de alguns vírus
e microorganismos (vÆrias bactØrias, levedura) foi
determinada e estÆ à disposiçªo em banco de da-
dos (GenBank, National Center for Biotechnolo-
gy Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov),
assim como a maior parte dos genes seqüencia-
dos de diferentes organismos.
A seguir serªo discutidos as tØcnicas e os
procedimentos de clonagem gŒnica, ou seja, do
isolamento dos genes de um dado organismo. O
conjunto das tØcnicas de clonagem gŒnica e de
outros tipos de manipulaçªo do material genØti-
co tem sido denominado tecnologia do DNA re-
combinante ou tambØm de Engenharia GenØtica.
CLONAGEM G˚NICA: PRINC˝PIOS,
ESTRATÉGIAS E FERRAMENTAS
Princípios e EstratØgias
Entende-se por clonagem gŒnica, o isola-
mento, amplificaçªo e purificaçªo de um gene
ou de genes, a partir do material genØtico de um
dado organismo. Isolar um gene presente em
poucas cópias no genoma humano Ø, sem dœvi-
da alguma, uma tarefa colossal. Procura-se uma
seqüŒncia de DNA em um universo formado por
3 bilhıes pb. Uma gota de Ægua no oceano! Po-
rØm, esta tarefa foi simplificada e, atØ certo pon-
to, banalizada pelo advento da tecnologia do
DNA recombinante.
A clonagem gŒnica envolve basicamente trŒs
etapas distintas. A primeira etapa consiste na
escolha do DNA a ser usado no processo de
clonagem. O DNA pode ser isolado diretamen-
te dos cromossomos do organismo de interesse,
nesse caso, ele Ø designado como DNA genô-
mico. Outra possibilidade Ø utilizar molØculas
de DNA copiadas a partir molØculas de RNA
mensageiro, atravØs de uma enzima denomina-
da transcriptase reversa. As molØculas obtidas
desta maneira sªo conhecidas como cDNA
(DNA complementar).
A escolha do tipo de DNA a ser usado, genô-
mico ou cDNA, depende da finalidade do estudo.
Por exemplo, se o pesquisador estÆ interessado
em estudar a seqüŒncias de aminoÆcidos de uma
dada proteína ou obtŒ-la em quantidades sufi-
cientes para estudos imunológicos, clínicos etc.,
Ø recomendÆvel utilizar o cDNA. Por outro lado,
se o pesquisador estÆ interessado em estudar as
regiıes regulatórias de um dado gene ou mapea-
mento do mesmo no cromossomo, Ø recomendÆ-
vel o uso do DNA genômico.
A segunda etapa consiste na ligaçªo das
molØculas de DNA em um vetor apropriado e
introduçªo em uma cØlula hospedeira. Nesta fase
do processo, tem-se em mªos uma populaçªo
de molØculas de DNA, na qual supostamente
estÆ incluído o gene de interesse. Na maioria
dos casos, o gene de interesse estÆ presente em
quantidades diminutas, insuficientes para sua de-
tecçªo. Portanto, Ø necessÆrio que as molØculas
de DNA sejam amplificadas, para que o gene de
interesse possa ser identificado pelos mØtodos
disponíveis.
Em geral, o material a ser clonado Ø amplifi-
cado em bactØrias, as quais sªo organismos de
fÆcil cultivo e manipulaçªo, que se multiplicam a
cada 30 minutos. O artifício usado Ø fazer com
que a bactØria, ao duplicar seu próprio material
genØtico tambØm duplique o DNA introduzido.
Para tanto, os fragmentos de DNA a serem clo-
nados sªo inseridos nos chamados vetores, os
quais sªo molØculas de DNA capazes de invadir e
propagar-se dentro das bactØrias.
Como serÆ discutido mais adiante, os ve-
tores mais comuns sªo os plasmídeos e vírus
bacterianos (bacteriófagos). Nesta etapa do pro-
cesso, o pesquisador deve escolher o vetor mais
apropriado para as suas finalidades. Os fragmen-
tos de DNA sªo introduzidos e duplicados na
cØlula hospedeira pelo veículo de clonagem, ou
seja, o vetor. Ao final desta etapa tem-se uma
populaçªo de bactØrias recombinantes, cada uma
delas contendo um fragmento de DNA exóge-
no, oriundo do organismo em estudo. A essa
coleçªo de bactØrias recombinantes portadoras
de genes de um dado organismo dÆ-se a deno-
minaçªo genoteca ou biblioteca.
A terceira etapa consiste no isolamento do
gene de interesse atravØs de um arsenal de tØc-
nicas genØticas, bioquímicas e imunológicas.
Novamente, cabe ao pesquisador a escolha do
mØtodo de seleçªo mais adequado para o iso-
lamento do gene de interesse.
40
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
As etapas descritas aqui serªo discutidas com
mais detalhes nos itens a seguir.
Ferramentas do DNA Recombinante:
Enzimas Modificadoras do DNA, Vetores e
CØlulas Hospedeiras
Enzimas Modificadoras do DNA
Sabe-se atravØs de mensuraçıes físico-quí-
micas e figuras de microscopia eletrônica que a
molØcula de DNA Ø longa, fina e razoavelmen-
te retilínea, lembrandoum longo filamento. A
estrutura linear e filamentosa facilita a mani-
pulaçªo da molØcula de DNA, permitindo o iso-
lamento de fragmentos da molØcula atravØs do
uso de enzimas específicas ou quebra com agente
físico (ultra-som, luz ultravioleta etc.).
Atualmente, a disponibilidade de enzimas
modificadoras do DNA permite que as molØcu-
las de DNA sejam manipuladas e alteradas no
tubo ensaio, criando-se novas molØculas de
DNA. Fragmentos de DNA, de mesma ou dife-
rente origem, podem ser ligados entre si atravØs
enzimas específicas originando novas molØculas
de DNA, as quais sªo denominadas molØculas
recombinantes. A tecnologia que permite que
estas molØculas recombinantes sejam criadas,
modificadas, replicadas e expandidas, recebeu a
denominaçªo tecnologia do DNA recombinan-
te. O conjunto de tØcnicas e procedimentos que
permite essa manipulaçªo tambØm Ø conhecido
como Engenharia GenØtica.
No metabolismo do DNA (síntese e degra-
daçªo) estªo envolvidos um grande nœmero de
enzimas, com diferentes especificidades e fun-
çıes. Estas enzimas constituem ferramentas va-
liosas da tecnologia do DNA recombinante. Entre
as enzimas de uso corrente na clonagem gŒnica
pode-se citar as: a) nucleases (exonucleases e en-
donucleases de restriçªo), b) polimerases, c) li-
gases, d) quinases e fosfatases, e) metilases, etc.
O mecanismo de açªo destas enzimas estÆ es-
quematizado na Fig. 2.9.
Como foi discutido anteriormente, a síntese
do DNA Ø catalisada por uma enzima denomi-
nada DNA polimerase. Esta enzima sintetiza uma
nova fita de DNA utilizando como molde (tem-
plate) a fita complementar da molØcula existen-
te (Figs. 2.4 e 2.9). Para que ocorra a síntese, a
molØcula de DNA deve ser desnaturada, ou seja,
as fitas devem ser separadas atravØs do rompi-
mento das ligaçıes que mantŒm a dupla hØlice.
A desnaturaçªo Ø feita atravØs de aquecimento
(90oC) ou tratamento alcalino das molØculas de
DNA, originando assim uma preparaçªo de DNA
contendo molØculas simples fita.
Ambas as fitas podem servir de molde para
a síntese de novas molØculas. AlØm da fita mol-
de, Ø necessÆria a presença de um iniciador ou
primer, ou seja, um pequeno fragmento de DNA
simples fita complementar à fita molde. Nas
manipulaçıes in vitro, os iniciadores podem
ser criados pela açªo de uma dada enzima
(por exemplo, RNase H), ou produzidos em
mÆquinas de síntese de oligonucleotídeos e adi-
cionados ao tubo de reaçªo. A produçªo de ini-
ciadores por RNase H serÆ discutida na síntese
de cDNA e a dos iniciadores sintØticos no arti-
go sobre PCR.
O crescimento da cadeia de DNA sempre se
faz no sentido 5’ para 3’, ou seja, um novo nu-
cleotídeo Ø adicionado à cadeia atravØs da liga-
çªo do seu grupo fosfórico, presente no carbono
5’ da desoxirribose, com a hidroxila do carbono
3’da desoxirribose do ultimo nucleotídeo pre-
sente na cadeia em crescimento.
A transcriptase reversa Ø um tipo de DNA
polimerase capaz de sintetizar uma nova fita de
DNA utilizando como molde um RNA mensa-
geiro, portanto, trata-se de uma DNA polimera-
se RNA dependente (Fig. 2.14). Como qualquer
DNA polimerase, ela necessita de um iniciador
e adiciona nucleotídeos na posiçªo 3’ do nucle-
otídeo remanescente na cadeia. Como anterior-
mente citado, a cadeia de DNA simples fita
sintetizada a partir do molde de RNA Ø denomi-
nada cDNA (DNA complementar).
As endonucleases de restriçªo, tambØm co-
nhecidas como enzimas de restriçªo, tiveram um
papel fundamental no desenvolvimento da tec-
nologia do DNA recombinante. Estas enzimas
sªo nucleases que reconhecem seqüŒncias espe-
cíficas de nucleotídeos, cortando a molØcula de
DNA em regiıes específicas (Fig. 2.10, Tabela
2.2). A denominaçªo endonucleases de restri-
çªo origina-se do fato de a atividade da enzima
estar restrita apenas à regiªo da molØcula que
contØm a seqüŒncia de nucleotídeos por ela re-
conhecida. A maioria das enzimas de restriçªo
foi isolada de bactØrias e sªo denominadas com
as abreviaçıes das espØcies das quais foram
41
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
Fig. 2.9 — Enzimas modificadoras do DNA. Esquema mostrando o mecanismo de açªo de algumas enzimas modificado-
ras do DNA utilizadas em Engenharia GenØtica. Em negro estªo representadas as bases nitrogenadas; em verde estªo
representados a desoxirribose e o fosfato, unidos entre si pelas ligaçıes fosfodiØster.
isoladas, por exemplo, EcoRI (Escherichia coli),
HindIII (Haemophilus influenzae).
As enzimas de restriçªo disponíveis reconhe-
cem seqüŒncias de quatro, seis ou oito nucleotí-
deos. De maneira geral, em uma dada molØcula
de DNA a probabilidade de encontrar-se sítios
contendo uma dada seqüŒncia de quatro nucleo-
tídeos (um sítio a cada 256 nucleotídeos) Ø maior
do que a probabilidade de encontrar-se sítios con-
tendo uma seqüŒncia de seis nucleotídeos (um
sítio a cada 4.096 nucleotídeos) ou oito nucleotí-
deos. Desta maneira, o nœmero de fragmentos
obtidos após digestªo do DNA com HaeIII (sítio
de reconhecimento composto por quatro nucleo-
tídeos) serÆ bem maior daquele obtido na diges-
tªo com EcoRI (seis nucleotídeos).
Uma outra característica das enzimas de res-
triçªo Ø o fato de elas cortarem a molØcula de
DNA gerando extremidades coesivas ou extremi-
dades “cegas” (blunt ends) (Fig. 2.10). Fragmen-
tos de DNA contendo extremidades coesivas
compatíveis podem ser ligados entre si gerando
novos fragmentos. Fragmentos obtidos pela di-
gestªo com BamHI podem ser ligados a outros
fragmentos digeridos pela mesma enzima ou
com fragmentos obtidos com a enzima Sau3AI
Endonuclease
Exonuclease
Quinase
DNA polimerase
Ligase
Fosfatase
“primer”
Fita molde
5’ 3’
5’ 3’
P– –OH
–POH–
3’ 5’
OH– –OH
5’ 3’
OH– –OH
5’3’
p
p3’5’
OH–
OH–
–OH
–OH
5’
5’ 3’
–OH
5’3’
OH–
–P
42
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Fig. 2.10 — MolØculas de DNA recombinante. Diagrama esquemÆtico mostrando a geraçªo de molØculas de DNA recom-
binante in vitro, após digestªo com enzimas de restriçªo compatíveis e ligaçªo das molØculas resultantes com a enzima
DNA ligase. Notar que foi incluída no esquema a ligaçªo entre fragmentos de DNA digeridos com enzimas de restriçªo
(HaeIII, SmaI) que originam extremidades blunt-ends.
Tabela 2.2
 Enzimas de Restriçªo
Origem Enzima Sítio de Reconhecimento Extremidades
Escherichia coli Eco RI 5’-GAATTC - 3’ Coesivas
-CTTAAG-
Eco RV 5’-GATATC- 3’ Blunt ends
Bacillus Bam HI 5’ -GGATCC- 3’ Coesivas
anyloliquefaciens H -CGTAGG-
Haemophilus aegytius Hae III 5’ -ggcc- 3’ Blunt ends
Staphylococcus aureus Sau 3AI 5’ -GATC- 3’ Coesivas
Nocardia Not I 5’ -GCGGCCGC- 3’ Coesivas
otitids-caviarium -CGCCGGCG-
(Fig. 2.10). A figura mostra que Sau3AI reco-
nhece uma seqüŒncia de quatro nucleotídeos que
estÆ contida dentro da seqüŒncia de seis nucleotí-
deos reconhecida pela BamHI, logo, as extremi-
dades geradas com Sau3AI sªo compatíveis com
as de BamHI. As seqüŒncias reconhecidas pelas
enzimas BamHI e Sau3AI sªo isoesquizômeros.
Fragmentos com extremidades “cegas” po-
dem ser ligados entre si, mesmo que tenham sido
gerados por diferentes enzimas de restriçªo,
como, por exemplo, EcoRV e HaeIII. Assim, sªo
muitas as maneiras disponíveis de fragmen-
tar-se o DNA e reconstruir novas molØculas
(Fig. 2.10). A uniªo de dois fragmentos de DNA
Vetor Inserto Vetor Inserto Vetor Inserto
Ligase Ligase Ligase
Eco RI Eco RI Bam HI Sau 3AI Hae III Sma I
5’ 5’3’ 3’
C
G A A T
T
T C
T A A G
5’3’
G A A T T C
C T T A A G
3’ 5’
C T T A A
G
3’5’
3’ 5’
5’ 3’
A A T T C
G
3’ 5’
5’ 3’
A A T T CG
C T T A A G
3’ 5’
C G A T C C
3’5’
3’ 5’
G C T A G G
3’
5’3’
5’
G A T C
C T G G
5’
5’
3’
3’
C
G C T A G
G AT C
5’ 3’
5’ 3’
G A T CC
G C T A G
3’ 5’
G G C C
3’5’
CC G G
3’ 5’
5’ 3’
C C C G G G
G G G C C C
3’ 5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
G G
C C
C C C
G G G
5’ 3’
G G C C C
G G GC C
3’ 5’
43
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
ocorre atravØs da formaçªo de ligaçıes fosfodi-
Øster entre as extremidades dos mesmos, catali-
sadas por enzimas denominadas DNA ligases. A
T4 DNA ligase, codificada por um gene presen-
te no bacteriófago T4, Ø uma das ligases mais
utilizadas na rotina dos laboratórios.
Uma situaçªo muito comum na clonagem
de genes Ø aquela em que fragmentos de DNA
de um dado organismo, obtidos por digestªo com
uma enzima de restriçªo (por exemplo, EcoRI),
devem ser ligados ao DNA de um plasmídeo bac-
teriano, o qual tambØm foi digerido com EcoRI.
Como a ligase nªo distingue os fragmentos, ha-
verÆ sempre uma fraçªo considerÆvel de produ-
tos de reaçªo contendo fragmentos resultantes
da ligaçªo de plasmídeos entre si ou fragmentos
resultantes da ligaçªo de fragmentos de DNA
do organismo em questªo. A ligaçªo indesejÆvel
entre estes fragmentos pode ser evitada, tratan-
do-se previamente um dos fragmentos com uma
enzima denominada fosfatase, que remove es-
pecificamente os grupamentos fosfóricos das ex-
tremidades do DNA. Os fragmentos destituídos
de grupamentos fosfóricos (fragmentos defosfo-
rilados) sªo incapazes de ligar-se entre si, em-
bora sejam capazes de ligar-se aos fragmentos
fosforilados presentes na reaçªo. Este artifício Ø
largamente usado na clonagem de genes.
Como citado no início deste item existe uma
grande variedade de enzimas modificadoras do
DNA, que possuem diferentes especificidades e
mecanismos de açªo. Apesar da enorme utilida-
de destas enzimas na tecnologia do DNA recom-
binante, apenas foram abordadas as enzimas
comumente utilizadas na construçªo de biblio-
tecas ou genotecas.
Vetores e CØlulas Hospedeiras
Os vetores sªo os veículos de clonagem que
permitem que os fragmentos de DNA a serem
clonados sejam introduzidos e propagados em
uma cØlula hospedeira adequada. As cØlulas hos-
pedeiras ou receptoras devem permitir a entrada
e propagaçªo do vetor, sem causar alteraçıes
no DNA que estÆ sendo clonado. As cØlulas hos-
pedeiras devem ser cØlulas de fÆcil manipulaçªo,
crescimento rÆpido e constituiçªo genØtica bem
conhecida. Neste perfil enquadram-se determi-
nadas linhagens de bactØrias, leveduras, cØlulas
de cultura de tecido de mamíferos e insetos.
Deve-se salientar que muitos genes, inicialmen-
te, sªo clonados em bactØrias e, posteriormente,
transferidos para um outro hospedeiro.
Os vetores mais utilizados sªo os plasmídeos
e os vírus de bactØrias e de cØlulas eucarióticas.
O plasmídeo Ø uma molØcula de DNA, em geral
pequena (menos de 10.000 pb) e circular, por-
tadora de uma regiªo denominada origem de re-
plicaçªo, a qual permite sua replicaçªo dentro
da cØlula hospedeira (Fig. 2.11). Em um plas-
mídeo existem algumas regiıes que sªo impor-
tantes no processo de clonagem: origem de
replicaçªo, sítio de clonagem, marcas de resis-
tŒncia a antibióticos, regiıes homólogas aos pri-
mers de seqüenciamento etc.
Os plasmídeos de clonagem possuem uma
origem de replicaçªo que permite a sua replica-
çªo e propagaçªo em bactØrias. Existem plasmí-
deos que tŒm diferentes origens de replicaçªo,
podendo ser propagados tanto em bactØrias
como em um outro tipo celular, como, por exem-
plo, levedura, cØlulas de cultura de tecido de
mamíferos ou insetos, ou mesmo em tecidos de
mamíferos.
Os sítios de clonagem sªo as regiıes onde se
pode inserir os fragmentos de DNA exógeno. O
sítio de clonagem possui seqüŒncias reconheci-
das pelas enzimas de restriçªo mais usuais.
Quando se tem vÆrios sítios de restriçªo à dis-
posiçªo para a clonagem, diz-se que o vetor Ø
portador de um polylinker. Em muitos plasmí-
deos a inserçªo de um fragmento de DNA exó-
geno leva a uma alteraçªo do fenótipo da cØlula,
o qual pode ser facilmente detectado e Ø um in-
dicativo da inserçªo de um fragmento de DNA
no sítio de clonagem. Por exemplo, em alguns
plasmídeos o sítio de clonagem fica no interior
do gene que codifica uma enzima, de modo que
a inserçªo de DNA exógeno anula a atividade
enzimÆtica.
Os plasmídeos carregam genes que codifi-
cam resistŒncia a antibióticos, o que Ø funda-
mental para a manutençªo dos mesmos na cØlula
hospedeira. As marcas de resistŒncia a antibióti-
cos sªo extremamente œteis na identificaçªo, se-
leçªo e manipulaçªo em geral dos plasmídeos
recombinantes. De maneira geral, os plasmíde-
os acomodam com facilidade fragmentos com
menos de 10.000 pb. Cabe ao investigador es-
colher o plasmídeo mais adequado a sua finali-
dade.
44
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Fig. 2.11 — Vetores típicos de clonagem. (A) plasmídio pUC18, mostrando sítios de clonagem (polylinker), origem de
replicaçªo (ori), gene de resistŒncia ao antibiótico ampicilina (Amp R) e o promotor lac. (B) Fago lambda gt10 (vetor de
inserçªo), mostrando o œnico sítio de clonagem EcoRI.
O plasmídeo Ø introduzido na cØlula hos-
pedeira submetendo-se a bactØria a um cho-
que tØrmico na presença de fosfato e cÆlcio.
Este processo Ø conhecido como transformaçªo
(Fig. 2.12). A transformaçªo tambØm pode ser
realizada submetendo-se as bactØrias a um cam-
po elØtrico que promove o aparecimento de po-
ros temporÆrios na membrana celular, por onde
penetram as molØculas de DNA. Este processo
Ø conhecido como eletroporaçªo. Após a trans-
formaçªo as bactØrias sªo plaqueadas em agar
sólido contendo meio nutritivo e antibióticos. As
colônias contendo plasmídeo sªo recuperadas e
analisadas.
O bacteriófago ou fago lambda Ø um vírus de
bactØrias que tem sido largamente utilizado em
clonagem gŒnica. O genoma do fago lambda Ø
constituído por uma œnica molØcula de DNA com
cerca de 40.000 pb.
Existem duas maneiras de se inserir um
fragmento de DNA exógeno no fago. Uma de-
las consiste em substituir um trecho do DNA
do fago por um fragmento de DNA exógeno,
cujo tamanho pode variar de 9.000pb a
23.000pb. Neste caso, elimina-se uma regiªo
do DNA do fago nªo-essencial à sua sobrevi-
vŒncia na cØlula hospedeira, sendo o vetor co-
nhecido como vetor de substituiçªo. A outra
opçªo consiste em adicionar ao DNA do fago o
fragmento de DNA (menor que 8.000 pb) que
se deseja clonar. Neste caso, o vetor Ø conheci-
do como vetor de inserçªo.
As molØculas de DNA fÆgico recombinantes
sªo utilizadas para construir partículas virais in
vitro em uma reaçªo conhecida como encapsi-
daçªo in vitro (Fig. 2.15). Em œltima anÆlise,
partículas virais sªo geradas no tubo de ensaio
e, a seguir, utilizadas para infectar bactØrias. A
infecçªo de bactØrias com fagos costuma ser um
processo mais eficiente do que a transformaçªo
quando se leva em conta o nœmero de recombi-
nantes obtidos.
O plasmídeo e o fago lambda sªo os vetores
mais apropriados para o isolamento e estudo
de um gene em particular e construçªo de ge-
notecas ou bibliotecas de um dado organismo.
PorØm, com o rÆpido desenvolvimento da tec-
nologia do DNA recombinante, outros vetores
com finalidades diversas foram construídos e
aperfeiçoados, como, por exemplo, o fago fila-
mentoso M13, os cosmídeos, os YACs, BACs e
vetores derivados de vírus de cØlulas eucarióti-
cas. No presente artigo, serÆ abordada a clona-
gem em plasmídeos e fago lambda. Contudo, Ø
importante salientar que o racional e estratØgias
utilizadas na clonagem nestes vetores podem ser
aplicados aos outros vetores.
Para que uma cØlula seja utilizada como cØ-
lula hospedeira ou receptora em clonagem gŒni-
ca ela deve preencher uma sØrie de requisitos:
A) B)
Hi
nd
 II
Sp
h I
Pu
l I
So
l I
Xi
ba
 I
Bo
m
HI
Sm
al
Kp
nl
Sa
c I
Ec
oR
I
IacZ’
AmpR
ori Mapa genético do bacterófago l
2,69 kb
Mapa do vetor plasmídio pUC 18
Genesdo
capsídeo
Genes da
cauda
Recombinação Lisogenia
Síntese de DNA
Lise
Sítio
cosSítiocos 48kb
att int xis a b l cBi N cl cro dl O P Q S R
45
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
crescimento rÆpido (tempo de geraçªo curto), fÆcil
manipulaçªo, estrutura genØtica bem conhecida.
As cØlulas hospedeiras, em geral, possuem uma
sØrie de mutaçıes no seu sistema de recombina-
çªo genØtica que garantem a propagaçªo e a es-
tabilidade do vetor.
Existem cØlulas hospedeiras que permitem
que os genes clonados sejam expressos, garan-
tindo a recuperaçªo em larga escala dos produ-
tos destes genes, por exemplo, proteínas. As
bactØrias sªo as cØlulas hospedeiras mais utili-
zadas em Engenharia GenØtica. PorØm, existem
à disposiçªo dos pesquisadores outros hospedei-
ros, como cØlulas de cultura de tecido de mamí-
feros e insetos, leveduras etc.). A escolha da
cØlula hospedeira vai depender dos objetivos do
trabalho. Geralmente, a clonagem de um dado
gene Ø feita em bactØria e, posteriormente, se-
gundo as necessidades o gene clonado Ø trans-
ferido para um outro hospedeiro.
CONSTRU˙ˆO DE BIBLIOTECAS
OU GENOTECAS
Biblioteca ou genoteca Ø uma coleçªo de frag-
mentos de DNA de um dado organismo, clona-
dos e propagados em um hospedeiro adequado
(bactØria, levedura, cØlula de cultura de tecido).
Para que uma biblioteca seja representativa, qual-
quer gene do organismo estudado deve estar re-
Fig. 2.12 — Clonagem de DNA genômico em plasmídio (construçªo de biblioteca genômica). Digestªo do plasmídio e
DNA genômico com enzimas compatíveis (EcoRI), ligaçªo com a enzima DNA ligase, transformaçªo de bactØrias compe-
tentes, seleçªo com o antibiótico tetraciclina, identificaçªo e amplificaçªo dos clones recombinantes.
DNA genômico Vetor plasmídio
Eco RI
Eco RI
TeiR
ori
Ec
o 
RI
Ec
o 
RI
Ligação
Transformação em
E. coli
E. coli contendo
plasmídio recombinante
Seleção com antibióticos
Seleção de recombinantesE. coli contendo
plasmídio selvagem
46
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Fig. 2.13 — Isolamento e purificaçªo do RNAm poliadeni-
lado (RNAm poli-A) atravØs de cromatografia de afinidade
em coluna de oligo (dT) celulose. O RNA total extraído do
organismo de interesse (tecido, cØlulas em cultura) Ø aplica-
do em colunas de oligo (dT) celulose. A cauda poli A (resí-
duos de adenina) do RNAm hibridam com os resíduos de
timina presentes na resina (oligo dT celulose). O RNAm poli-
A Ø eluído com soluçªo apropriada.
presentado na genoteca. Em outras palavras, a
probabilidade de se encontrar um dado gene deve
ser igual ou superior a 99%.
Desta maneira, conhecendo-se a complexi-
dade do genoma e o tamanho dos fragmentos
clonados pode-se estimar o nœmero de clones
recombinantes necessÆrios para que uma biblio-
teca seja representativa. De acordo com a ori-
gem do DNA, as bibliotecas sªo denominadas
a) genômica, se o DNA clonado for o DNA nu-
clear ou cromossômico; b) cDNA, se o DNA clo-
nado for copiado do RNAm pela transcriptase
reversa.
Bibliotecas Genômicas
O DNA extraído do nœcleo das cØlulas Ø de-
nominado DNA genômico ou cromossômico. O
DNA genômico pode ser obtido rompendo-se
as cØlulas na presença de detergentes, seguin-
do-se extraçªo com solventes orgânicos (fenol,
clorofórmio).
Em geral, o DNA Ø digerido com enzimas
de restriçªo ou com Dnase I, escolhidas pelo pes-
quisador levando-se sempre em conta os objeti-
vos do trabalho e os sítios de clonagem existentes
no vetor (Fig. 2.12). A digestªo com enzimas de
restriçªo pode ser total ou parcial, variando-se o
tempo de incubaçªo com a enzima. Os fragmen-
tos a serem inseridos no vetor podem ser purifi-
cados atravØs de eletroforese em gel de agarose,
escolhendo-se apenas os fragmentos de tama-
nho adequado ao vetor escolhido.
Fragmentos de tamanho igual ou inferior a
23.000 pb podem ser clonados em fago lambda.
Os plasmídeos e o fago filamentoso M13 aco-
modam com facilidade fragmentos menores que
10.000pb. Como serÆ discutido em outro capí-
tulo, fragmentos com tamanho igual ou supe-
rior a 40.000 pb devem ser clonados em vetores
especialmente desenvolvidos para acomodar
grandes fragmentos de DNA como os YACs (ye-
ast artificial chromosome), BACs (Bacterial Ar-
tificial Chromosome) e cosmídeos.
É muito comum na construçªo de biblio-
tecas submeter-se o DNA genômico a uma di-
gestªo parcial com uma enzima que corta
freqüentemente o DNA, como, por exemplo, a
Sau3AI. Este procedimento aumenta a proba-
bilidade de um dado gene estar presente nos
Oligo (dT)
celulose
T T T T T
T T T T T
T T T T T
RNA total
A A A A A
A A A A A
A A A A A
A A A A A
T T T T T
A A A A ARNAm Pdi (A)
hibridiza com
oligo (dT)
A A A A A
T T T T T
NaCL 100mM
Eluição de RNAr e RNAt
A A A A A
Tris 10mM
EDTA 1mM
A A A A A
A A A A AA A A A A
A A A A A A A A A A
A A A A AA A A A A
Eluição do RNAm Poli (A)
47
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
fragmentos a serem inseridos no vetor. Por
exemplo, se um dado gene estiver contido em
fragmento EcoRI de 30.000pb, ele nªo pode-
rÆ ser clonado em fago lambda (tamanho mÆxi-
mo 23.000pb). Certamente, dentro deste
fragmento existem muitos sítios para Sau3AI,
que podem ser utilizados para gerar fragmentos
de tamanho adequado para clonagem em fago
lambda atravØs de digestªo parcial com Sau3AI.
Após a inserçªo dos fragmentos de DNA em
um vetor apropriado, o material a ser clonado Ø
introduzido e propagado em bactØrias ou em le-
veduras no caso dos YACs. Como foi discutido
anteriormente, a introduçªo do material a ser clo-
nado Ø uma etapa crucial na construçªo de geno-
tecas de um dado organismo, existindo vÆrios
protocolos de transformaçªo (plasmídeos, BACs,
YACs, fago filamentoso M13) e encapsidaçªo in
vitro (fago lambda, cosmídeo) que permitem a
constituiçªo de genotecas representativas.
Para que uma genoteca de DNA genômico
de um dado mamífero (por exemplo, o homem)
construída em fago lambda seja representativa
sªo necessÆrios 810.000 fagos recombinantes
contendo fragmentos de DNA humano de cer-
ca de 17.000pb. Em uma genoteca deste porte,
a probabilidade de se detectar um gene qual-
quer Ø maior que 99%. Os fagos citados aqui
podem ser estocados em um pequeno tubo de
ensaio em um volume menor do que 0,5ml. De
certa maneira, o DNA recombinante permite
que o patrimônio hereditÆrio do homem seja
estocado em um tubo de ensaio, o qual pode
ser conservado por muitos anos na geladeira.
Construçªo de Bibliotecas de cDNA
As bibliotecas de cDNA contŒm fragmentos
de DNA copiados pela transcriptase reversa ten-
do como molde as molØculas de RNAm. Desta
maneira, em uma genoteca de cDNA estªo re-
presentados apenas os genes que codificam para
proteínas e que estªo sendo expressos na cØlula
ou tecido do qual o RNAm foi extraído. A geno-
teca de cDNA pode ser a opçªo mais correta
quando se quer clonar um gene que codifica uma
dada proteína, visando estudar-se a seqüŒncia
de aminoÆcidos desta proteína, seus efeitos bio-
lógicos, produçªo em larga escala etc.
A primeira etapa da construçªo de uma ge-
noteca de cDNA consiste na extraçªo do RNAm
da cØlula ou do tecido desejado, utilizando-se
mØtodos em que o material biológico Ø lisado na
presença de substâncias denaturantes de proteí-
nas, como fenol, clorofórmio, isotiocianato de
guanidina, detergentes, etc. A seguir, o RNAm Ø
separado dos outros RNAs (tRNA, rRNA, etc.)
atravØs de cromatografia em uma coluna de oli-
go (dT)-celulose, ou seja, uma resina contendo
celulose acoplada a resíduos de oligo (dT) (nu-
cleotídeo desoxi-timidina) (Fig. 2.13). Os RNAm
possuem na extremidade 3’ uma cauda conten-
do muitos resíduos do nucleotídeo adenina, a
qual Ø denominada cauda poli-A. Desta manei-
ra, quando o RNA celular Ø cromatografadona
resina de oligo (dT), as caudas de poli-A pre-
sentes nos RNAm hibridam-se com os resíduos
de T, separando os RNAm dos outros RNAs ce-
lulares. Os RNAm sªo eluídos da coluna, cons-
tituindo uma fraçªo enriquecida em RNAm
denominada RNA poliadenilado.
As etapas de síntese e clonagem do cDNA
estªo esquematizadas nas Figs. 2.13 a 2.15. A
preparaçªo contendo o RNA poliadenilado
(RNAm) Ø usada para a síntese do cDNA sim-
ples fita em uma reaçªo catalasida pela trans-
criptase reversa. Oligonuclucleotídeos sintØticos
contendo resíduos de timina [oligo (dT)] sªo
utilizados como iniciadores ou primers para a
síntese do cDNA simples fita (Fig. 2.14). Eles
hibridam com os resíduos da cauda poli-A dos
RNAm, servindo como primer para a açªo da
enzima transcriptase reversa. O cDNA simples
fita mantØm-se ligado à molØcula de RNAm origi-
nando um híbrido RNAm/cDNA. Esse híbrido Ø o
substrato de uma enzima denominada RNase H,
a qual digere especificamente o RNAm. A RNa-
se H nªo digere totalmente o RNAm, deixando
pequenas regiıes intactas, as quais servirªo de
primers para a síntese da segunda fita de cDNA.
A segunda fita do cDNA Ø catalisada pela
DNA polimerase, utilizando os primers origina-
dos acima. Deve-se salientar que existem outras
alternativas de geraçªo de primers para a síntese
da segunda fita, como a utilizaçªo de uma mis-
tura de hexanucleotídeos aleatórios (contendo
todas as combinaçıes possíveis entre os nucleo-
tídeos) ou a utilizaçªo regiªo de dupla fita em
forma de grampo situada na extremidade da fita
de cDNA. A segunda fita tambØm pode ser sin-
tetizada via PCR, utilizando-se a Taq DNA po-
48
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
limerase e oligonucleotídeos. Essa alternativa Ø
utilizada para fins específicos e serÆ discutida
no final deste capítulo.
O cDNA dupla fita Ø incubado com enzi-
mas que reparam as suas extremidades (por
exemplo, T4 DNA polimerase) e, a seguir, adi-
ciona-se às suas extremidades oligonucleotídeos
sintØticos contendo sítios de enzimas de restri-
çªo compatíveis com os sítios de restriçªo exis-
tentes no vetor (plasmídeo ou fago) a ser
utilizado na clonagem. Estes oligonucleotídeos
podem ser de dois tipos: linkers ou adaptadores.
Os adaptadores nªo necessitam ser digeridos com
enzimas de restriçªo, pois jÆ apresentam extre-
midades coesivas.
Na etapa seguinte, as molØculas de cDNA
sªo inseridas no sítio de clonagem do vetor
(plasmídeo ou fago) e propagadas em bactØrias
(Fig. 2.15), como visto no item anterior. O iso-
lamento dos clones recombinantes serÆ descrito
no item a seguir.
Isolamento de Clones
Recombinantes em Bibliotecas
de cDNA ou Genômicas
As estratØgias de isolamento de clones re-
combinantes sªo essencialmente as mesmas, quer
tratar-se de uma biblioteca de cDNA ou genô-
mica. Algumas delas serªo discutidas a seguir.
Isolamento de Clones Recombinantes com
Sondas Radioativas atravØs de Hibridaçªo
de `cidos NuclØicos
Entende-se por sonda uma seqüŒncia de
DNA ou um oligonucleotídeo utilizado para o
isolamento de um gene de interesse (Fig. 2.16A).
Se existe alguma informaçªo sobre a seqüŒncia
de nucleotídeos do gene de interesse, pode-se
sintetizar oligonucleotídeos com base na seqüŒn-
cia de nucleotídeos conhecida e utilizar esses oli-
gonucleotídeos marcados radioativamente no
rastreamento das genotecas. Como muitos ge-
nes sªo razoavelmente conservados na escala
evolutiva, pode-se isolar um dado gene de uma
espØcie conhecendo-se a seqüŒncia de nucleotí-
deos do gene homólogo de outra espØcie.
Existem situaçıes em que se dispıe da pro-
teína purificada, mas nada se sabe sobre a se-
qüŒncia de nucleotídeos do gene que a codifica.
A seqüŒncia de aminoÆcidos de alguns fragmen-
tos desta proteína pode ser obtida atravØs das
tØcnicas de microsseqüenciamento. Conhecida
a seqüŒncia de aminoÆcidos pode-se predizer a
seqüŒncia de nucleotídeos que codifica esses ami-
noÆcidos e, conseqüentemente, sintetizar os oli-
gonucleotídeos correspondentes.
As genotecas sªo plaqueadas em placas de
Petri contendo agar sólido nutritivo. As colônias
(no caso dos plasmídeos, cosmídeos, fagos M13,
YACs, BACs) ou placas de lise (fago lambda)
presentes na placa de Petri sªo utilizadas para
gerar rØplicas em filtros de nitrocelulose ou nÆi-
lon. Os filtros, por sua vez, sªo tratados com
soluçıes adequadas e hibridados com a sonda
radioativa. Após a hibridaçªo, os filtros sªo
expostos em filmes de raios X e revelados. Os
clones recombinantes contendo seqüŒncias ho-
mólogas à sonda utilizada vªo formar híbridos
radioativos, os quais vªo originar um sinal posi-
tivo no filme de raios X, permitindo sua identifi-
caçªo e isolamento (Fig. 2.16A).
O Gene de Interesse Expressa uma
Proteína Contra a Qual se Tem Anticorpos
ou uma Proteína que Possui Alguma
Atividade Biológica
(Enzima, Hormônio, etc.)
Neste caso, a biblioteca deve ser cons-
truída em um vetor de expressªo (fago lambda
ou plasmídeo), o qual permite a clonagem e a
expressªo do gene de interesse. O vetor de ex-
pressªo possui um gene que codifica uma pro-
teína, em geral bacteriana, o qual estÆ sob o
controle de uma regiªo denominada promotor.
A expressªo da proteína depende da ativaçªo
do promotor. O artifício consiste em inserir-se
o gene de interesse em um sítio localizado den-
tro do gene que codifica a proteína acima. Neste
caso, quando o promotor Ø ativado tem-se a
produçªo de uma proteína híbrida ou de fusªo,
a qual contØm parte da proteína que estava sob
o comando do promotor mais a proteína que se
deseja clonar e expressar.
A estratØgia mais utilizada Ø gerar anticor-
pos contra a proteína que se deseja clonar e
utilizÆ-los em um rastreamento imunológico das
49
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
Fig. 2.14 — Síntese de cDNA. Síntese de cDNA (cDNA simples fita) pela transcriptase reversa utilizando-se oligo dT como
primer e o RNAm poli-A como molde. Degradaçªo do RNAm molde com Rnase H gerando primers para a síntese da
segunda fita do cDNA. Síntese do cDNA dupla fita com a enzima DNA polimerase.
genotecas. O procedimento Ø semelhante ao
descrito no item anterior. As bibliotecas sªo pla-
queadas, rØplicas de nitrocelulose contendo os
clones recombinantes, sªo preparadas e incu-
badas com os anticorpos dirigidos contra a pro-
teína de interesse. A seguir, utilizam-se tØcnicas
comuns de detecçªo de complexo antígeno-an-
ticorpo, como por exemplo, conjugados liga-
dos a peroxidase (Fig. 2.16B). Após a revelaçªo,
as bactØrias produtoras da proteína de interes-
se sªo identificadas e isoladas.
Se a proteína de interesse tem alguma ativi-
dade biológica, por exemplo enzimÆtica, pode-
se montar um ensaio para detecçªo da atividade
desta enzima tal como se procedeu no rastrea-
mento imunológico. Evidentemente, existem
muitas outras alternativas de isolamento de clo-
nes recombinantes. As citadas nos itens anterio-
res sªo as mais comuns.
Isolamento de Clones Recombinantes
atravØs de PCR
Quando a seqüŒncia de nucleotídeos de um
gene Ø parcial ou totalmente conhecida pode-se
gerar oligonucleotídeos baseados nestas seqüŒn-
cias, os quais serªo utilizados como primers em
reaçıes de PCR (Polymerase Chain Reaction).
Esta estratØgia tem sido muito utilizada no iso-
lamento de recombinantes. Amostras contendo
quantidades mínimas de DNA dos clones recom-
binantes sªo desnaturadas, incubadas com
“primers”específicos para o gene de interesse e
amplificadas atravØs da Taq DNA polimerase. O
material Ø analisado atravØs de eletroforese em
gel de agarose e hibridaçªo. Muitas vezes, o pro-
duto da reaçªo de PCR Ø clonado em um vetor
apropriado e seqüenciado, para confirmar-se se
realmente ele tem a seqüŒncia de nucleotídeos
do gene de interesse.
RNAm
5’ 3’
Anelamento
oligo (dT)
3’
5’3’
5’ Extensão
Transcriptase reversa
híbrido RNA/DNA
RNAm
cDNA“primers” RNA
Degradação do molde
Rnase H
cDNA
cDNA
Síntese da segunda fita
DNA polimerase I
+ dNTPs + DNA ligase
cDNA dupla fita
AAAAAA
TTTTTTTT
AAAAAA
TTTTTTT
AAAAA
TTTTTT
50
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 2
Fig. 2.15 — Clonagem de cDNA em fago lambda l gt10. Linkers EcoRI sªo adicionados às extremidades das molØculas
de cDNA dupla fita pela enzima DNA ligase. A seguir, as molØculas de cDNA e do vetor l gt10 sªo digeridas com a enzima
de restriçªo EcoRI gerando extremidades compatíveis. Vetor e inserto sªo ligados entre si pela DNA ligase gerando uma
longa molØcula de DNA (concatamero linear). No processo de encapsidaçªo (geraçªo de partículas fÆgicas), uma molØcu-
la recombinante (DNA do fago + inserto) Ø introduzida em uma partícula fÆgica ou um vírus.
CLONAGEM DE UM GENE
ATRAVÉS DE PCR
O desenvolvimento e o aprimoramento da
tecnologia de PCR permitiram o desenvolvimen-
to de novos protocolos de clonagem de um dado
gene ou de algumas regiıes do mesmo. Para
tanto Ø necessÆrio ter informaçıes sobre a se-
qüŒncia de nucleotídeos do gene de interesse. Oli-
gonucleotídeos correspondentes a regiıes
conhecidas do gene sªo usadas no processo de
amplificaçªo por PCR. Em geral, regiıes de 100pb
atØ 5.000pb podem ser amplificadas por PCR.
A amplificaçªo pode ser feita utilizando-se
o DNA genômico ou cDNA. Amostras conten-
do algumas nanogramas de DNA podem ser uti-
lizadas para amplificaçªo de um gene de inte-
resse. Após a reaçªo de PCR, a banda amplificada
correspondente ao gene Ø clonada em um plas-
mídeo ou fago filamentoso, tal como descrito nos
itens anteriores. Deve-se salientar que o PCR Ø
adequado para se clonar um gene especificamen-
te, mas nªo para gerar genotecas representati-
vas de todos os genes do organismo.
É muito comum utilizar-se o PCR para iso-
lar uma regiªo do gene, a qual Ø posteriormen-
te utilizada como sonda para o isolamento do
gene completo em uma biblioteca de cDNA ou
genômica.
Eco RI
cDNA
Eco RI metilaseMe
Me
DNA ligase
Me
Me
Me
Eco RI
Adaptadores Eco RI
Extremidades coesivas Me
Adaptadores
ligados
Ligação
Sítio cos
l gt10
Eco RI
Eco RI
Sítio cos
Sítio cos anelado
Empacotamento da partícula
fágica in vitro
Sem inserto
cDNA
DNA de fago recombinante
E. coli infectada
Tapete bacteriano Placa de fago
A
T
A
T
A
T
A
T
A
T
G
C
A
T
C
G
G
C
A
T
T
A
T
A
C
G
G
C
A
T
A
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A
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A
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A
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A
T
A
T
A
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A
T
A
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A
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A
T
A
T
A
T
A
T
G
C
C
G
TA A T
T T A A
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
51
PRINC˝PIOS DA BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
Cap. 2
BIBLIOGRAFIA
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1986.
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S. Paulo, Brasil, 1997.
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Protocols: a guide to methods and applications,
Academic Press, New York, 1990.
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Fig. 2.16 — Isolamento de clones recombinantes. A) Rastreamento com sondas genØticas radioativas e B) Imunosseleçªo
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A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Segunda
Ediçªo, 1989.
6. Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Wriner
AM. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition,
The Benjamin/Cummings Publishing Company,
Menlo Park, California, Volumes 1 and 2, 1987.
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American Books, New York, 1992.
8. White BA. PCR Protocols: Current methods and
application, Methods in Molecular Biology, 15:1,
1993.
A) Rastreamento com sonda radioativa
Genoteca
(colônias de bactérias contendo
diferentes fragmentos de DNA eucariótico)
Sonda
DNA genômico marcado
com 32p
Hibridação
Detecção por auto-radiografia
filme de Raio X
Clone
Isolamento do fago
recombinante
Placa original (mãe)
B) Imuno seleçªo de fagos recombinantes
Detecção de clones recombinantes com
imunoglobulinas acopladas à peroxidase
Carimbo da placa em filtro Rastreamento como soro
contendo anticorpo de interesse

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