12 DNA Recombinante

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DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
A tecnologia do DNA recombinante trans-
formou a maneira como a pesquisa biológica Ø
realizada nos dias de hoje. Este conjunto de tØc-
nicas, desenvolvido em meados de 1970, teve um
marco importante com o descobrimento de dois
tipos de enzimas, que permitiram a clonagem do
DNA. As do primeiro tipo sªo as chamadas enzi-
mas de restriçªo, que clivam a dupla-hØlice do
DNA em sítios específicos, gerando um conjun-
to característico e reprodutível de fragmentos,
permitindo o isolamento de seqüŒncias de DNA
de interesse.Um outro tipo de enzima, a DNA
ligase, Ø capaz de ligar os fragmentos de DNA,
por exemplo, a uma molØcula replicante de DNA,
ou vetor, produzindo o DNA recombinante. Este
DNA recombinante pode ser introduzido em
cØlulas apropriadas, normalmente, bactØrias ou
vírus, por serem altamente replicativos. O isola-
mento e a identificaçªo dos descendentes de uma
œnica cØlula portadora de um mesmo DNA re-
combinante desejado, isto Ø, um clone, permi-
tem nªo só a obtençªo de quantidades ilimitadas
da determinada proteína, como tambØm o seu
seqüenciamento nucleotídico e deduçªo dos ami-
noÆcidos constituintes. Assim, qualquer segmen-
to de DNA clonado pode ser reinserido em
vetores, e estes transformados em cØlulas, e tes-
tados para atividade biológica.
DNA Recombinante
Este grupo de tØcnicas, coletivamente cha-
mado de tecnologia do DNA recombinante,
tornou-se a abordagem dominante no estudo
de muitos processos biológicos. Neste capítu-
lo, abordaremos vÆrias tØcnicas que compıem
a tecnologia do DNA recombinante. O poder
e o sucesso desta nova tecnologia trouxeram
muitos benefícios prÆticos, particularmente na
Medicina.
ENZIMAS DE RESTRI˙ˆO
As enzimas de restriçªo sªo endonucleases
encontradas em bactØrias, e seu papel biológi-
co Ø proteger o genoma bacteriano de possíveis
vírus invasores, clivando qualquer DNA exó-
geno. O DNA da própria bactØria nªo Ø reco-
nhecido por essas enzimas porque esses sítios
se encontram metilados. Estas enzimas sªo al-
tamente específicas e reconhecem de quatro a
oito nucleotídeos de ambas as fitas do DNA.
Algumas endonucleases de restriçªo produzem
quebras assimØtricas, originando caudas cur-
tas de DNA fita-simples nas duas extremida-
des. Estes terminais sªo conhecidos como
terminais coesivos, uma vez que cada cauda sim-
ples fita pode formar pares complementares
Leny Toma
Yara M. Michelacci
Helena B. Nader
MarimØlia Porcionatto
Lœcia O. Sampaio
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VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
com a outra cauda produzida pela mesma en-
zima. Outras enzimas, ainda, geram terminais
retos ou cegos (Fig. 12.1). A DNA-ligase res-
taura ligaçıes fosfodiØsteres de ambos os ter-
minais.
Mais de 90 endonucleases de restriçªo jÆ
foram identificadas, purificadas, e estªo hoje dis-
poníveis comercialmente. Seus nomes consistem
em abreviaçıes de trŒs letras do organismo do
qual foi isolado (por exemplo, Eco, para Esche-
richia coli, Hin para Haemophilus influenza, Hae
para Haemophilus aegyptius) seguido da desig-
naçªo da linhagem (se necessÆrio) e uma nume-
raçªo romana (para distinguir diferentes enzi-
mas de um mesmo organismo). Exemplos sªo
dados na Tabela 12.1.
A disponibilidade dessas enzimas possibili-
tou a construçªo de mapas de restriçªo, onde os
fragmentos gerados podem ser agora separados
em gel de agarose, e corados com brometo de
etídio. As bandas visualizadas com uma fonte de
luz UV podem ser fotografadas (Fig. 12.2). A
migraçªo relativa no gel, comparado a padrıes
de peso molecular, refletem o tamanho dos frag-
A) Produçªo de terminais cegos
-N-N-A-G-C-T-N-N- Alu I -N-N-A-G C-T-N-N-
-N-N-T-C-G-A-N-N- -N-N-T-C G-A-N-N-
 terminal cego
B) Produçªo de terminais coesivos
-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N- Eco RI -N-N-G A-A-T-T-C-N-N-
-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N- -N-N-C-T-T-A-A G-N-N-
 terminal coesivo
N, representa qualquer base.
Fig. 12.1 — Formaçªo de terminais coesivos e cegos pela clivagem de diferentes enzimas de restriçªo.
Tabela 12.1
Sítios de Reconhecimento de Algumas Enzimas de Restriçªo
Enzima Fonte Sítio de Reconhecimento Terminais Coesivos e Cegos
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC Coesivo
Eco RI Escherichia coli RY 13 GAATTC Coesivo
Hind III Haemophilus influenza Rd AAGCTT Coesivo
Hae III Haemophilus aegyptius GGCC Cego
Hpa I Haemophilus parainfluenzae GTTAAC Cego
Hpa II Haemophilus parainfluenzae CCGG Coesivo
Mbo I Moraxella bovis GATC Coesivo
Taq I Thermus aquaticus TCGA Coesivo
Not I Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC Coesivo
Sfi I Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC Coesivo
N, representa qualquer base.
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DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
mentos. Ainda, a digestªo incompleta em tem-
pos variÆveis permite a deduçªo da organizaçªo
relativa desses fragmentos na molØcula de DNA
como um todo.
PLASM˝DEOS
Plasmídeos sªo pequenas molØculas de DNA
dupla fita, circulares, de ocorrŒncia natural em
bactØrias, que podem replicar independentemen-
te, sem estar associados a cromossomos. Nor-
malmente carregam genes para inativaçªo de
antibióticos, produçªo de toxinas e degradaçªo
de produtos naturais. Algumas características
fundamentais sªo requeridas para que os plas-
mídeos sejam utilizados como vetores: 1) ori-
gem de replicaçªo (seqüŒncia de DNA que auxilia
a replicaçªo da molØcula de DNA, atravØs de in-
teraçıes com a DNA polimerase da cØlula hos-
pedeira); 2) genes que conferem resistŒncia a
antibióticos, assim a bactØria que carrega o plas-
mídeo pode ser selecionado (por exemplo, re-
sistŒncia a ampicilina, tetraciclina); 3) poli-linker
ou seqüŒncias de sítios de clonagem mœltiplas,
sªo seqüŒncias sintØticas, adicionadas aos plas-
mídeos naturais, e que contŒm uma cópia de
diversos sítios de restriçªo diferentes (Fig. 12.3).
Plasmídeos, em geral, consistem em apenas
2 a 4kb de DNA, tamanho este que facilita a
anÆlise do fragmento de DNA inserido. Para ser
clonado num plasmídeo, um fragmento do in-
serto Ø ligado a um sítio de restriçªo apropria-
do no vetor e a molØcula recombinante Ø usada
para transformar E.coli. Colônias resistentes ao
antibiótico, que contŒm DNA plasmidial, sªo
selecionadas. Tais bactØrias contendo plasmí-
deo recombinante sªo colocadas para crescer
em grandes quantidades e seu DNA extraído
(Fig. 12.4). As molØculas plasmidiais, que nor-
malmente se apresentam em centenas de cópias
por cØlula, podem ser separadas do DNA cro-
mossômico bacteriano; o resultado Ø um DNA
plasmidial purificado, que Ø apropriado para
anÆlise do inserto clonado.
Fig. 12.2 — Visualizaçªo de bandas de DNA em eletrofo-
rese em gel de agarose por coloraçªo com brometo de
etídio e iluminaçªo ultravioleta.
VETORES
Sªo definidos como vetores molØculas de
DNA que podem replicar quando introduzidos
a uma cØlula hospedeira, como as cØlulas bacte-
rianas ou leveduras, e do qual possam ser isola-
dos posteriormente. A clonagem de fragmentos
de DNA em vetores por meio de enzimas de res-
triçªo e DNA-ligase, conforme descrito aqui,
possibilita a propagaçªo do fragmento clonado
juntamente com o vetor. Como as bactØrias e
leveduras crescem facilmente no laboratório,
enormes quantidades das seqüŒncias de DNA
desejadas sªo obtidas concomitantemente. Ve-
tores com alta capacidade de clonagem tŒm sido
desenvolvidos nos œltimos anos (Tabela 12.2).
No entanto, cada um deles apresenta suas van-
tagens e tambØm limitaçıes.
Tabela 12.2
Vetores mais Utilizados em Clonagem Molecular
Vetor Hospedeiro Tipo de Clonagem Tamanho do Inseto
Plasmídeo BactØria Genômica. cDNA 5-10kb
Bacteriófago lambda BactØria Genômica.cDNA < 20kb
Cosmídeos BactØria Genômica < 50kb
Cromossomosartificiais Levedura Genômica 100-1.000kb
Bandas de DNA
fluorescentes
LUZ UV
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VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
Fig. 12.3 — Um plasmídeo típico. Em alguns plasmídeos o poli-linker estÆ localizado dentro do fragmento do gene lac Z
de E. coli, que codifica b -galactosidase. O poli-linker nªo interfere na síntese da enzima ativa. Quando E. coli sªo cresci-
das em presença de X-gal, um composto incolor, a clivagem de X-gal pela enzima produz um produto insolœvel azul. Assim,
colônias de E. coli com plasmídeos que nªo tŒm inserto de DNA externo no poli-linker sªo azuis. Contudo, a inserçªo de
DNA no poli-linker interfere ou termina a janela de leitura do gene lac Z; galactosidase nªo Ø produzida e o plasmídeo
resultante produz colônias incolores que, assim, distinguem-se das outras na placa de Ægar.
Fig. 12.4 — Etapas bÆsicas da clonagem em plasmídeos.
BACTERIÓFAGO LAMBDA
O fago lambda Ø um vírus bacteriano de
DNA dupla fita, com cerca de 45kb. É o vetor
ideal para insertos de DNA de aproximadamente
15kb de comprimento. A clonagem de grandes
fragmentos de DNA em fago Ø possível pelo fato
de um segmento de 15-25kb do DNA do fago
poder ser substituído, sem comprometer sua re-
plicaçªo em E. coli. O empacotamento do DNA
do fago na partícula viral Ø limitado pelo seu
comprimento total, que deve ser de aproxima-
damente 50kb.
A estrutura do fago Ø muito simples, con-
sistindo em DNA, ou ocasionalmente RNA,
que carrega genes para a replicaçªo, rodeado
por uma capa de proteçªo ou capsídeo, com-
posto por molØculas protØicas.
O processo de infecçªo ocorre em trŒs eta-
pas, mostradas na Fig. 12.5:
1) O fago adere na superfície da bactØria e
injeta seu DNA cromossomal dentro da cØ-
lula.
Amp R
Hi
nd
 II
I
Sp
h 
I
Ps
t I
Sa
l I
Xb
a 
I
Ba
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 H
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Sm
a 
I
Sa
c I
Ec
o 
RI
Poli-linker
Promotor
Iac
Iac Z
Ori
DNA
recombinante
+
+
Plasmídeo
Inserto
BactériaTransformação
da bactéria
Multiplicação do
DNA recombinante
Divisão de célula
hospedeira
Colônias bacterianas crescendo em meio sólido
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DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
2) O DNA do fago Ø replicado, geralmente com
enzimas específicas, codificadas por genes
presentes no cromossomo do fago.
3) Outros genes do fago direcionam a síntese
de proteínas componentes do capsídeo, e
novas partículas de fago sªo montadas e li-
beradas da bactØria.
O fago lambda pode replicar atravØs de duas
vias, uma lítica e outra chamada lisogŒnica.
Via Lítica
Alguns tipos de fagos possuem o ciclo
infectivo completo bastante rÆpido, possivel-
mente em menos de 20 minutos. Este tipo de
infecçªo rÆpida Ø chamada ciclo lítico, uma
vez que a liberaçªo das novas partículas de
fago estÆ associada à lise da cØlula bacteria-
na. Um aspecto característico do ciclo de in-
fecçªo lítico Ø que a replicaçªo do DNA do
fago Ø seguida imediatamente da síntese das
proteínas do capsídeo e o DNA do fago nªo
Ø mantido na bactØria hospedeira numa con-
diçªo estÆvel.
A replicaçªo do DNA do fago lambda se dÆ
atravØs de um mecanismo de círculo rolante onde
as novas fitas vªo sendo continuamente desen-
roladas da molØcula molde (template), gerando
vÆrios genomas lambda linear unidos por sítios
cos (coesivos) (Fig. 12.6). As seqüŒncias nu-
cleotídicas dos sítios cos sªo reconhecidas por
endonucleases específicas, que clivam o DNA,
produzindo um genoma lambda completo e li-
near. Portanto, durante a replicaçªo de seu DNA
o fago lambda pode intercalar entre as formas
linear e circular (Fig. 12.7).
Ciclo LisogŒnico
A infecçªo lisogŒnica Ø caracterizada pela in-
tegraçªo do DNA do fago ao DNA cromosso-
mal da bactØria, mantidas assim por milhares de
divisıes celulares ou geraçıes. Algumas altera-
çıes ambientais fazem com que o DNA do fago
seja liberado do genoma da bactØria e o fago re-
verte o ciclo lítico e lisa a cØlula.
M13 — FAGO FILAMENTOSO
O fago filamentoso M13 possui um genoma
muito menor e mais simples do que o fago, com
Fig. 12.5 — Processo de infecçªo, replicaçªo e lise da cØlula bacteriana por um bacteriófago.
Partícula de fago
DNA
1. O fago se liga à bactØria
e injeta seu DNA
Moléculas de DNA do fago
2. O DNA do fago Ø replicado
Lise celular
Componentes
do capsídeo 3. Compronentes do capsídeo sªo
sintetizados, novas partículas do fago
sªo montadas e liberadas
Novas
partículas
de fago
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VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
Fig. 12.6 — Replicaçªo do DNA l atravØs do círculo rolante.
Fig. 12.7 — Formas linear e circular do DNA l.
cerca de 6.407 nucleotídeos. É um DNA circu-
lar, porØm simples fita, o que o distingue dos ou-
tros fagos. O DNA do fago M13 Ø injetado em E.
coli atravØs do pílus. Uma vez dentro da cØlula o
DNA simples fita Ø usado como molde para sín-
tese da fita complementar, resultando num DNA
dupla fita. Este DNA nªo Ø incorporado no geno-
ma bacteriano, mas replica atØ 100 cópias por
cØlula. Quando a bactØria divide, cada filha rece-
be cópias do genoma do fago, que continua a re-
plicar, mantendo um nœmero determinado por
cØlula. Novas partículas de fago sªo continuamen-
te montadas e liberadas, com cerca de 1.000 no-
vos fagos sendo produzidos durante cada geraçªo
de uma cØlula infectada. Ao contrÆrio do fago lam-
bda, o fago M13 nªo leva à lise e morte celular.
Cos Cos Cos Cos
Replicação por círculo rolante
Clivagem pela endonuclease
Componentes protéicos do capsídeo
Endonuclease cliva no sítio cos
Novas partículas de fago
são montadas
Terminal coesivo
Sítio Cos
Forma linear do DNA l Terminal coesivo
Endonuclease
GG G G G G
G G
G G
G
GGG
GG G
C C
C C C C C C
C C C
CC C
C C
C
A
A
T
Forma circular do DNA l
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DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
O aspecto mais atraente do fago M13 como
vetor de clonagem Ø que os genes clonados em
M13 podem ser facilmente obtidos na forma de
fita simples. Essa forma Ø requerida em diversas
situaçıes ou tØcnicas, como seqüenciamento de
DNA, mutagŒnese in vitro, ou mesmo, utilizado
como molde na obtençªo de sondas radioativas.
Outras conveniŒncias sªo o tamanho peque-
no, que facilita sua manipulaçªo e tambØm o fato
de que a forma replicativa dupla fita comporta-
se como um plasmídeo, sendo facilmente obtido
de uma cultura de E. coli, e pode ser reintrodu-
zido por transfecçªo.
COSM˝DEOS
Sªo vetores sofisticados que reœnem carac-
terísticas híbridas dos fagos lambda e plasmí-
deos bacterianos. Possuem a capacidade de
acomodar, ou “empacotar” grandes fragmentos
de DNA e introduzi-los em cØlulas bacterianas.
Infectam as bactØrias de maneira semelhante a
de um vírus lambda, reassumem a forma circu-
lar e replicam-se como um grande plasmídeo.
Um cosmídeo possui um sítio cos, um mar-
cador de seleçªo, como o gene de resistŒncia a
um antibiótico e uma origem de replicaçªo. Os
cosmídeos nªo produzem placas, mas formam
colônias no meio de seleçªo, como um vetor plas-
mideal. Podem abrigar insertos de atØ 50kb.
CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS DE LEVEDURAS
Cromossomos artificiais de leveduras (YACS,
Yeast Artificial Chromosomes) sªo cromossomos
lineares, normais em Saccharomyces cerevisae
(levedura de padaria), utilizados como vetores
para clonagem de fragmentos de DNA de atØ
1.000kb. Tal qual cromossomos normais, pos-
suem centrômeros e telômeros, replicam-se e se-
gregam-se no hospedeiro.
CONSTRU˙ˆO DE BIBLIOTECAS
Bibliotecas Genômicas
Uma biblioteca genômica Ø um conjunto de
clones recombinantes que contØm todo o DNA
presente num organismo. Portanto, qualquer
gene desejado pode ser selecionado a partir da
biblioteca daquele organismo ou tecido. Um
exemplo de construçªo de uma biblioteca de
DNA genômico Ø mostrada na Fig. 12.8. DNAgenômico humano Ø parcialmente digerido com
uma enzima de restriçªo, como Sau3A. Assim,
fragmentos parcialmente clivados, com tamanho
adequado para clonagem (~20 kb), sªo selecio-
nados por gradiente de sacarose, ou qualquer
outro mØtodo de fracionamento por tamanho.
Estes fragmentos sªo, entªo, ligados a braços de
bacteriófago lambda, previamente tratados com
Sau3A ou Bgl II, que tambØm Ø Sau3A compatí-
vel, de modo a complementar a extremidade
Sau3A dos fragmentos de DNA humano. Após
empacotamento in vitro em partículas infecciosas
de bacteriófago lambda, a biblioteca estÆ pronta.
Este conjunto de DNA recombinante serÆ sub-
metido ao processo de clonagem, isto Ø, triagem
do clone que contØm a seqüŒncia desejada.
Bibliotecas de DNA Complementar
(cDNA)
Em eucariotos muitos genes sªo transcritos
em RNAm somente em determinados tipos ce-
lulares. As seqüŒncias específicas de DNA, ex-
pressas como RNAm naquele tipo particular de
cØlula, podem ser clonadas sintetizando-se có-
pias de DNA a partir de RNAm isolado daquela
cØlula e, entªo, clonando essas cópias de DNA
em plasmídeos ou bacteriófago lambda. As có-
pias de DNA a partir dos RNAm sªo chamados
de DNA complementar (cDNA).
As vantagens de se utilizar bibliotecas de
cDNA sªo:
1. Representam apenas seqüŒncias codificado-
ras, expressas como RNAm de um tipo ce-
lular, com a vantagem de apresentar ausŒncia
de íntrons presentes numa biblioteca de DNA
genômico.
2. Uma segunda vantagem seria a possibilidade
de enriquecer a biblioteca, utilizando teci-
dos com alta expressªo e/ou expressªo sele-
tiva da proteína de interesse.
A primeira etapa na construçªo de uma bi-
blioteca de cDNA consiste em isolar RNA total
da cØlula ou tecido de interesse. Numa segun-
da etapa, RNAm sªo separados dos outros
RNAs ribossomais e transportadores, atravØs de
uma característica presente nos RNAm de eu-
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VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
cariotos. Os RNAm de eucariotos possuem 50
a 250 resíduos de adenilato, chamado de cau-
da de poli-A (Fig. 12.9). Esta cauda Ø capaz de
parear pequenas seqüŒncias sintØticas de timi-
dilato acopladas a uma matriz, em colunas cha-
madas de oligo-dTs. Uma vez que os outros
RNAs nªo se ligam à coluna, eles podem ser
separados do RNAm, que por sua vez sªo re-
cuperados por eluiçªo em tampªo com baixa
concentraçªo de sal.
A enzima transcriptase reversa, isolada de
retrovírus, Ø utilizada para sintetizar uma fita de
DNA complementar para cada RNAm, utilizan-
do primers de oligo-dT, que se hibridizam com a
cauda de poli-A no terminal 3’.
Uma vez que as fitas simples de cDNA sªo
sintetizadas, os RNAm sªo removidos por trata-
mento com Ælcali, que hidrolisa RNA, mas nªo
DNA. Numa próxima etapa a DNA polimerase
usa o cDNA simples fita como molde para sin-
tetizar a fita complementar, produzindo, assim,
uma dupla fita completa, correspondente a cada
RNAm da preparaçªo original.
Pequenos segmentos de DNA dupla fita,
contendo sítios de restriçªo para enzimas de res-
triçªo particulares sªo ligados a ambos termi-
nais do cDNA dupla fita. Estes segmentos
chamados ligantes sªo selados atravØs da DNA
ligase de bacteriófago T4. Ligaçıes entre termi-
nais cegos ou retos sªo menos eficientes que
entre terminais coesivos, mas podem ser maxi-
mizados com a adiçªo de altas concentraçıes
desses ligantes na reaçªo de ligaçªo. O cDNA
dupla fita resultante, contendo o ligante em am-
bos terminais, sªo agora submetidos à digestªo
com a enzima específica para o ligante, geran-
do, assim, um cDNA com terminais coesivos.
Este produto estÆ pronto para ser ligado a um
vetor, seja um plasmídeo ou bacteriófago, pre-
viamente tratado com a mesma enzima de restri-
çªo. Os vetores recombinantes sªo entªo
submetidos à eletroporaçªo em E. coli (inclusªo
dos plasmídeos recombinantes na cØlula), ou
“empacotados” in vitro em partículas virais in-
fectivas para E. coli. O conjunto de clones re-
combinantes daquele determinado tecido ou
cØlula estÆ agora representado nessa biblioteca
de plasmídeos ou fago lambda.
Fig. 12.8 — Construçªo de uma biblioteca de DNA genômico humano em fago lambda.
Sítios Bam HI
DNA genômico
humano
Braço esquerdo Braço direito
Vetor l
Digestão por Bam HI
Fragmentos internos
Remoção de fragmentos internos
não essenciais à replicação do fago
Braço Braço
DNA ligase
Braço esquerdo Braço direitoInserto
Empacotamento in vitro no bacteriófago
e infecção da E. coli
Biblioteca de fragmentos de DNA humano
Fragmentos de DNA
com ~20kb após
digestão parcial
Digestão parcial com Sau 3A
155
DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
Identificaçªo de Clones Específicos numa
Biblioteca Genômica ou de cDNA
 Os mØtodos mais comuns de se identificar
clones de interesse (screening) dentre os milhares
numa biblioteca, consiste em hibridizaçªo com
sondas radioativas de DNA ou RNA, ou ainda
atravØs da identificaçªo da proteína expressa.
Sondas de Oligonucleotídeos SintØticos
 No caso de uma biblioteca de fago lambda,
E. coli sªo infectadas por vírions lambda recom-
binantes, e imediatamente plaqueadas e imobili-
zadas numa camada de Ægar nutritivo em placas
de Petri. Placas formadas no Ægar (halo mais cla-
ro), contendo vírions recombinantes sªo trans-
feridos a membrana de nÆilon, como se fosse
um mata-borrªo. Parte das partículas virais em
cada placa adsorve na superfície da membrana,
embora grande parte permaneça nas placas, na
superfície do Ægar da placa de Petri. Desta ma-
neira, uma rØplica da placa de Petri contendo
clones de lambda individuais sªo reproduzidos
na superfície da membrana. A placa de Petri origi-
nal, contendo a coleçªo de clones lambda, Ø re-
frigerada e guardada. A membrana Ø, entªo, in-
cubada numa soluçªo alcalina, que desfaz os
vírions, liberando e desnaturando o DNA encap-
sulado. Este DNA Ø fixado à membrana por ex-
posiçªo à luz UV atravØs de cross-linking, ou
entªo desnaturado no forno por duas horas. A
membrana Ø incubada com a sonda radioativa
sob condiçıes especiais de hibridizaçªo. Son-
das nªo hibridizadas sªo lavadas, e o filtro Ø sub-
metido a auto-radiografia.
A presença de um clone recombinante con-
tendo DNA complementar à sonda irÆ aparecer
como uma mancha escura no filme de raios X. A
posiçªo dessa mancha no autoradiograma Ø co-
localizada na placa de Petri original, e a placa
identificada. As partículas virais da placa-mªe sªo
reinfectadas em E. coli, e replaqueadas, atØ se-
rem clonadas, isto Ø, esse processo se repete atØ
a obtençªo de placas livre de contaminaçªo. Pro-
cesso semelhante pode ser aplicado na identifi-
caçªo de clones de interesse numa biblioteca
construída em plasmídeos.
Sondas oligonucleotídicas específicas para
genes que codificam proteínas nªo tªo abundan-
Fig. 12.9 — SumÆrio do procedimento de construçªo do cDNA.
156
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
tes podem ser sintetizadas quimicamente, ba-
seando-se na seqüŒncia de aminoÆcidos da pro-
teína de interesse. Uma vez que primers contendo
apenas 20 nucleotídeos sªo suficientes para a
construçªo da sonda e para a identificaçªo dos
clones, apenas uma parte da proteína necessita
ser seqüenciada. Normalmente, a proteína de
interesse precisa ser purificada, digerida com
uma ou mais proteases, resultando em peptíde-
os específicos. A seqüŒncia de aminoÆcidos ami-
noterminal Ø determinado por degradaçªo
seqüencial de Edman. Baseando-se no código
genØtico, sondas de oligonucleotídeos codifican-
do seqüŒncias peptídicas determinadas podem
ser sintetizadas e marcadas radioativamente. Ao
se escolher quais seqüŒncias peptídicas usar na
construçªo dos primers de oligonucleotídeos,
deve-se levar em consideraçªo a degeneraçªo do
código genØtico. Assim, peptídeos contendo ar-
ginina, leucina ou serina precisam ser evitados,se possível, uma vez que seis diferentes códons
codificam para cada um desses aminoÆcidos.
Clonagem em Vetores de Expressªo
Clones de interesse tambØm podem ser iden-
tificados atravØs da detecçªo de proteínas espe-
cíficas. Para isso, vetores de clonagem especiais
sªo utilizados, como vetores de expressªo lamb-
da, na qual o DNA clonado Ø transcrito em
RNAm, que por sua vez Ø traduzido na proteína
em questªo.
Um exemplo de vetor de expressªo Ø lamb-
da gt11, concebido para expressar altos níveis da
proteína beta-galactosidase de E. coli. O œnico
sítio de restriçªo para EcoRI nesse vetor situa-se
perto do terminal 3’ do gene da galactosidase.
Se um cDNA ou um fragmento de DNA genô-
mico codificante de proteína for inserido nesse
sítio de EcoRI na orientaçªo correta e no mes-
mo sentido da janela de leitura, serÆ expresso
como uma proteína fundida à galactosidase. Pla-
cas resultantes da infecçªo com lambda gt11 re-
combinante conterÆ altas concentraçıes de tal
proteína fundida. Estas proteínas podem ser
transferidas e fixadas a uma membrana de nÆi-
lon ou nitrocelulose, que serÆ incubada com um
anticorpo monoclonal que reconhece a proteína
de interesse. Lavando-se o filtro, remove-se an-
ticorpos nªo ligados à proteína fundida ligada
ao filtro. Os anticorpos ligados sªo detectados
incubando-se o filtro com um segundo anticor-
po radioativo que se liga ao primeiro anticorpo.
Qualquer mancha que apareça no auto-radio-
grama Ø utilizada para localizar placas na placa
master original, contendo o gene de interesse.
AN`LISE E SEQÜENCIAMENTO DO DNA
CLONADO
Uma vez que um cDNA ou fragmento de
DNA genômico em particular foi clonado, ele
pode ser excisado do vetor com a mesma enzi-
ma utilizada para inseri-lo, ou com outras enzi-
mas apropriadas. Assim, uma vez que o vetor foi
dissociado do DNA clonado, ambos sªo separa-
dos em eletroforese em gel de agarose, e o in-
serto Ø eluído do gel, e agora estÆ pronto para
ser introduzido num vetor conveniente para se-
qüenciamento.
MØtodo de Maxam-Gilbert
O primeiro mØtodo de seqüenciamento foi
desenvolvido por Allan M. Maxam e Walter Gil-
bert no final de 1970. O mØtodo envolve cliva-
gem química específica, após marcaçªo de um
dos terminais com 32P. A polinucleotídeo quina-
se catalisa a adiçªo de 32P à hidroxila terminal
5’. O DNA marcado radioativamente Ø entªo cli-
vado quimicamente em determinadas bases:
1. As purinas sªo destruídas pelo dimetilsulfa-
to, que metila a guanina no N-7 e a adenina
no N-3. A ligaçªo glicosídica de uma purina
metilada Ø prontamente quebrada por aque-
cimento em pH neutro, o que deixa o açœ-
car sem a base. O aquecimento subseqüente
em Ælcali leva à clivagem do arcabouço em
G (clivagem só em guanina), enquanto o tra-
tamento com Æcido diluído causa clivagem
tanto em A quanto em G (clivagem tanto em
adenina quanto em guanina).
2. A hidrazinólise cliva anØis de T e C, que Ø
seguido do tratamento com piperidina, que
remove ambas as bases modificadas (cliva-
gem de timina e citosina). A hidrazinólise
em presença de NaCl 2M poupa T, seguido
de piperidina, que remove C (clivagem de
citosina).
Assim, o DNA pode ser clivado só em G, em
A e G, em C e T, e só em C. Os fragmentos de
157
DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
cada mistura sªo separados por eletroforese em
gel de poliacrilamida, que fracionam por tama-
nho molecular. O gel Ø seco e submetido à auto-
radiografia. Comparando-se as quatro colunas
correspondentes, a seqüŒncia pode ser deduzi-
da (Fig. 12.10).
MØtodo do Dideoxi de Sanger
Alguns anos mais tarde, Frederick Sanger e
seus colaboradores desenvolveram um segundo
mØtodo de seqüenciamento, que Ø hoje o mais
utilizado. Este mØtodo envolve a utilizaçªo de
2’,3’-dideoxinucleosídeo trifosfato (ddNTPs)
(Fig. 12.11), que nªo possui o grupo hidroxila
3’, responsÆvel pela elongaçªo da cadeia; daí
tambØm serem conhecidos como o mØtodo do
dideoxi.
Um DNA simples fita Ø hibridizado com um
primer deoxinucleotídico sintØtico e marcado ra-
dioativamente no terminal 5’. O primer Ø alon-
Fig. 12.10 — Seqüenciamento de DNA pelo mØtodo de Maxam-Gilbert.
5’ GGCC
Fragmento Klenow
da DNA polimerase
I de E. coli
GACT 5’
+[a –32P]dGTP +[a –32P]dCTP
TUBO 2TUBO 1
GACT 5’
3’5’ GGCC
GACT 5’
3’ 32p
C5’ GGCC
3’3’32p
G
G A+G
C+T C
G A+G C+T C
Eletroforese em gel de poliacrilamida
G A+G
C+T C
CC+TA+GG
TopoTopo
Fundo Fundo
Se
qü
ên
cia
G
T
C
T
A
G
C
A
A
T
G
G
A
G
A
T
C
G
T
T
A
C
Se
qü
ên
cia
 c
om
pl
em
en
ta
r
Auto-radiografia do gel
158
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
Fig. 12.11 — Estrutura do deoxinucleosídeo trifosfato e
dideoxinucleosídeo trifosfato.
gado em quatro reaçıes separadas, contendo os
quatro deoxinucleosídeos trifosfatos normais
(dNTPs), mais um dos quatro dideoxinucleosí-
deos trifosfato (ddNTPs), numa proporçªo de
100 para 1. Uma molØcula de ddNTP pode ser
adicionada no lugar de um dNTP normal cor-
respondente, mas quando isto ocorre a elonga-
çªo da cadeia pÆra porque ddNTP nªo possui a
hidroxila 3’. Com o tempo, cada reaçªo conterÆ
uma mistura de cadeias prematuramente termi-
nadas a cada ocorrŒncia de um ddNTP. Cada
mistura de reaçªo Ø submetida à eletroforese em
gel de poliacrilamida, e os diferentes fragmen-
tos sªo detectados por auto-radiografia. A de-
tecçªo de bandas no filme de raios X em cada
uma das reaçıes permite ler diretamente a se-
qüŒncia de bases no molde de DNA original
(Fig. 12.12). Uma vez que a seqüŒncia de ba-
ses daquele fragmento Ø determinado, primers
de fragmentos coincidentes sªo deduzidos e sin-
tetizados baseando-se nesta seqüŒncia, e assim
utilizados para seqüenciar porçıes contínuas
desconhecidas.
MÉTODOS DE AN`LISE DO `CIDO NUCLÉICO
TØcnica de Southern Blot
Esta tØcnica foi desenvolvida por Edward
Southern, cujo nome serviu de referŒncia tanto a
Fig. 12.12 — Seqüenciamento de DNA pelo mØtodo do
didesoxinucleosídeo trifosfato de Sanger.
este procedimento, quanto a outros derivados, por
analogia ao nome, como northern e western blot.
O mØtodo permite identificar fragmentos de res-
triçªo de DNA específicos numa mistura com-
plexa de fragmentos de restriçªo. O DNA de um
organismo Ø digerido com uma enzima de restri-
çªo e os fragmentos resultantes sªo separados por
tamanho numa eletroforese em gel de agarose. O
BaseBase
CH2
O
O
O
O
O
O
O
CH2
–O P
P
P–O
–O
O–
O
O
O
O
O
O
–O P
P
P–O
–O
H
H
H H
H H
H H
H
OH HH
O O
Deoxinucleosídeo
Trifosfato
(dNTP)
Dideoxinucleosídeo
Trifosfato
(ddNTP)
DNA de interesse
5’ 3’
35S 5’
“Primer universal”
Mistura
de reação
DNA polimerase
+ddGTP
+dATP
+dCTP
+dTTP
Fita molde
5’ 3’
C C C C
35S 5’
35S 5’
35S 5’
35S 5’
G
G
G
G
Síntese
de DNA
(a) Bacteriófago M13 recombinante
TUBO 1
ddG
TUBO 2
ddC
TUBO 3
ddA
TUBO 4
ddT
Topo
Fundo
Auto-radiografia do gel
Seqüência
Eletroforese em gel
de poliacrilamida
(b) Eletroforese em gel de poliacrilamida da
mistura de reação
C
A
G
G
T
C
T
T
G
A
C
A
C
C
G
159
DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
DNA Ø desnaturado no gel em Ælcali, e transferi-
do a uma membrana de nitrocelulose ou nÆilon
por capilaridade (Fig. 12.13). Este procedimento
preserva a distribuiçªo dos fragmentos no gel,
criando uma rØplica do gel no filtro; esses frag-
mentos de DNA sªo fixados na membrana por
reaçªo cruzada em UV, ou ainda desnaturados
sob calor. O filtro Ø incubado com uma soluçªo
de hibridizaçªo, em condiçıes especiais, na pre-
sença de sondas nucleotídicas radioativas, nor-
malmente obtidas de fragmentos previamente
clonados. Os fragmentos de DNA complementa-
res à sonda hibridizam, e sªo co-localizadosno
filtro atravØs de auto-radiografia.
TØcnica de Northern Blot
Esta tØcnica emprega o mesmo princípio de
southern blot para separaçªo de RNA.Uma amos-
Fig. 12.13 — Aparato de transferŒncia de fragmentos de DNA por capilaridade.
Fig. 12.14 — Ciclo bÆsico do PCR.
tra de RNA total ou de RNA mensageiro Ø des-
naturado por tratamento com agentes como o
formaldeído, que asseguram o RNA na forma
linear, evitando formaçªo de pontes de hidrogŒ-
nio entre as bases. Estes RNAs sªo tambØm se-
parados em eletroforese em gel de agarose,
transferidos a membrana de nitrocelulose ou
nÆilon, e desnaturados ou fixados à membrana
por UV. O filtro Ø exposto a sonda nucleotídica
radioativa de DNA e bandas visualizadas por
auto-radiografia. A intensidade das bandas ob-
tidas sªo proporcionais à quantidade de RNA
presente na mistura.
Reaçªo em Cadeia da Polimerase (PCR)
A tØcnica da reaçªo em cadeia da polimera-
se (Polymerase Chain Reaction — PCR) foi con-
cebida por Kary Mullis e colaboradores em 1984,
e desenvolvida na Cetus Corporation. A tØcnica
Ø conceitualmente muito simples e mimetiza o
processo natural de replicaçªo do DNA in vivo.
Numa simples reaçªo, permite a amplificaçªo es-
pecífica de segmentos de DNA raros ou em pe-
quenas quantidades numa mistura de DNA,
representando, assim, uma alternativa à clona-
gem gŒnica. À mistura da reaçªo sªo adiciona-
dos os seguintes componentes à seqüŒncia-alvo:
1) um par de primers flanqueando a seqüŒncia a
ser amplificada, 2) todos os quatro desoxirribo-
nucleotídeos trifosfatos (dNTPs), e 3) uma DNA
polimerase termoestÆvel.
O mØtodo baseia-se na repetiçªo de trŒs eta-
pas (Fig. 12.14), todas conduzidas sucessiva-
mente sob condiçıes controladas de diferentes
temperaturas, mantidas em aparelhos específi-
cos para esse fim:
Papel
Whatman
Tampão
Suporte
Pilha de papel
Membrana de nitrocelulose
Gel
160
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 12
Fig. 12.15 — Estrutura da molØcula de insulina.
Etapa 1: a primeira etapa da reaçªo envolve
a desnaturacªo do DNA a 94”C por 1 minuto.
Esta temperatura permite a separaçªo das fitas
duplas de DNA, tornando-as simples fita, pre-
parando assim o DNA para a etapa seguinte de
anelamento dos primers.
Etapa 2: a segunda etapa do ciclo envolve o
anelamento dos primers no terminal 3’ do mol-
de de DNA simples fita . Para isso a temperatura
Ø diminuída para 50”C por 1 a 1.5 minutos.
Etapa 3: a etapa de polimerizaçªo envolve a
utilizaçªo da Taq polimerase que funciona efici-
entemente entre 72-74”C (2 minutos), adicio-
nando bases nucleotídicas complementares ao
molde de DNA utilizado, iniciando a reaçªo a
partir dos primers iniciadores.
Assim, ciclos repetidos de desnaturaçªo, ane-
lamento dos primers e polimerizaçªo amplificam
rapidamente a seqüŒncia de interesse. A cada ci-
clo o nœmero de cópias da seqüŒncia entre os
sítios dos primers Ø dobrada; portanto, a seqüŒn-
cia desejada aumenta exponecialmente.
A tØcnica de PCR Ø tªo eficiente em amplifi-
car seqüŒncias específicas, que DNA isolado de
uma œnica cØlula humana pode ser analisada para
mutaçıes associadas com vÆrias doenças genØ-
ticas. Este procedimento permite a recuperaçªo
e rÆpida amplificaçªo de seqüŒncias inteiras en-
Tabela 12.3
Proteínas Humanas de Valor TerapŒutico
e que sªo Comercialmente Produzidas pela
Engenharia GenØtica
Proteínas Valor TerapŒutico
Fator VIII da Tratamento de hemofilia A
coagulaçªo
Insulina humana Tratamento de diabetes
Interferon Agente anticâncer
Tratamento de hepatite B
Interleucina-2 Supressªo de doenças
auto-imunes
Aumento de sobrevida de
transplantes cardíacos
Eritropoietina Tratamento de anemia
Hormônio do Tratamento de
crescimento deficiŒncias do hormônio
Ativador do Tratamento de trombose
plasminogŒnio coronariana
tecidual
tre quaisquer dois terminais cujas seqüŒncias se-
jam conhecidas; a seqüŒncia amplificada pode ser
entªo ligadas a vetores de clonagem. Fragmentos
de ~2kb ou menos podem ser amplificados efi-
cientemente; no entanto, com o desenvolvimen-
to de outras polimerases mais eficientes, este
limite foi estendido.
APLICA˙ÕES DA CLONAGEM G˚NICA
A aplicaçªo mais bem-sucedida da clonagem
gŒnica tem sido o desenvolvimento de proteínas
animais em microorganismos transformados que
sintetizam versıes recombinantes. Muitas pro-
teínas de valor farmacŒutico sªo sintetizadas por
animais em pequenas quantidades e sua purifi-
caçªo Ø difícil e cara. A clonagem gŒnica oferece
a possibilidade mais barata e reproduzível de pro-
duzir estas proteínas atravØs do crescimento em
larga escala de bactØrias recombinantes.
Uma das primeiras proteínas humanas a se-
rem clonadas foi a insulina em 1978.
Quando o hormônio insulina nªo Ø sinteti-
zado em quantidades suficientes pelas cØlulas
beta das ilhotas de Langerhans no pâncreas, re-
161
DNA RECOMBINANTE
Cap. 12
sulta em diabetes melito. A insulina controla os
níveis de glicose no sangue, e sua deficiŒncia se
manifesta como um complexo de sintomas, que
pode levar à morte se nªo tratado.
Felizmente, muitas formas de diabetes po-
dem ser aliviadas por um programa contínuo de
injeçıes de insulina, assim suplementando a
quantidade limitada do hormônio sintetizado
pelo pâncreas. A insulina utilizada no tratamen-
to da diabetes tem sido obtida tradicionalmente
de pâncreas bovino e suíno. Apesar de ela ser
satisfatória, problemas podem surgir no uso con-
tínuo. Um deles Ø que a pequena diferença entre
a proteína humana e animal pode levar a efeitos
colaterais desagradÆveis em alguns pacientes. Um
segundo problema Ø que os procedimentos de pu-
rificaçªo sªo difíceis e contaminantes, potencial-
mente perigosos e nªo podem ser completamente
removidos. O mØtodo mais satisfatório seria usar
insulina humana para tratamento de diabetes, o
que Ø obviamente impossível.
Duas características da insulina humana fa-
cilitaram sua produçªo recombinante em E. coli.
Primeiramente, após a traduçªo ela nªo Ø modi-
ficada pela adiçªo de açœcares, portanto, uma
insulina recombinante sintetizada por bactØrias
seria supostamente ativa. A outra vantagem Ø
quanto ao tamanho da molØcula. A insulina Ø
composta por dois polipeptídeos, um de 21 ami-
noÆcidos (cadeia A) e outro de 30 aminoÆcidos
(cadeia B). Em humanos, elas sªo sintetizadas
como um precursor chamado preproinsulina, que
contØm os segmentos A e B ligados por uma ter-
ceira cadeia C, que Ø precedida por uma seqüŒn-
cia líder. A seqüŒncia líder Ø removida após
traduçªo e a cadeia C excisada, deixando os po-
lipeptídeos A e B ligados um ao outro por pon-
tes dissulfeto (Fig. 12.15).
Dois plasmídeos recombinantes foram cons-
truídos, um carregando o gene para a cadeia A e
outro o gene para cadeia B. Em ambos os casos
os genes foram inseridos ao lado e in frame do
lac Z no vetor tipo pBR 322. Os genes da insu-
lina estªo sob o controle do promotor forte lac,
e sªo expressos como uma proteína fundida,
consistindo em poucos aminoÆcidos de b -galac-
tosidase seguido dos polipeptídeos A ou B. Os
genes foram construídos de tal maneira que os
segmentos de b -galactosidase e insulina estariam
separados por um œnico resíduo de metionina,
presente em ambas proteínas fundidas. Os poli-
peptídeos poderiam assim, ser clivados do seg-
mento de b -galactosidase por tratamento com
brometo de cianogŒnio, que quebra proteínas nos
resíduos de metioninas. As cadeias A e B purifi-
cadas sªo fundidas uma a outra por formaçªo
de pontes dissulfeto em tubo de ensaio. Na rea-
lidade, na prÆtica esta œltima etapa mostrou-se
ineficiente.
Um aperfeiçoamento subseqüente foi sinte-
tizar toda a proinsulina, com as cadeias A, B e
C. Embora esta seja uma proposiçªo mais desa-
fiadora, o pro-hormônio tem a vantagem de do-
brar espontaneamente na posiçªo correta, que
facilita a formaçªo de pontesdissulfeto. O seg-
mento da cadeia C pode agora ser removido fa-
cilmente por uma clivagem proteolítica.
Existem proteínas para as quais os benefíci-
os da clonagem gŒnica sªo óbvios. Entre elas
incluem-se os interferons, que estªo presentes
no corpo em quantidade tªo pequena, uma vez
que sªo sintetizados em resposta a ataques vi-
rais, e sua purificaçªo Ø quase impossível pelos
meios convencionais. A clonagem gŒnica ofere-
ceu o œnico meio viÆvel de obter grande quanti-
dade dessas proteínas.
Mais importante ainda, a clonagem gŒnica
pôde fornecer preparaçıes ultrapuras das pro-
teínas com problemas de contaminaçªo. Fator
VIII, uma proteína da cascata da coagulaçªo do
sangue, encontra-se deficiente na forma mais
predominante de hemofilia, e era obtida de doa-
dores de sangue humano. Sua purificaçªo en-
volvia dificuldades em remover partículas virais,
que podem estar presentes no sangue. Hepatite
e HIV poderiam ser passados a hemofílicos via
injeçıes de fator VIII. A obtençªo do fator VIII
recombinante, livre de contaminaçıes, bem como
outras proteínas listadas na Tabela 12.3, repre-
senta hoje uma realizaçªo significante para a tec-
nologia da clonagem gŒnica.
BIBLIOGRAFIA
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