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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA MATEUS GERALDO SIMÕES USO DA MACHO-ESTERILIDADE NA PRODUÇÃO DE SEMENTES DE MILHO HÍBRIDO VIÇOSA – MINAS GERAIS 2017 MATEUS GERALDO SIMÕES USO DA MACHO-ESTERILIDADE NA PRODUÇÃO DE SEMENTES DE MILHO HÍBRIDO Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal de Viçosa como parte das exigências para a obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Modalidade: Revisão de Literatura. Orientador: Rodrigo Oliveira de Lima Coorientador: Denise Cunha dos Santos Dias VIÇOSA – MINAS GERAIS 2017 MATEUS GERALDO SIMÕES USO DA MACHO-ESTERILIDADE NA PRODUÇÃO DE SEMENTES DE MILHO HÍBRIDO Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal de Viçosa como parte das exigências para a obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Modalidade: Revisão de Literatura. APROVADO: 05 de Junho de 2017 Prof. Rodrigo Oliveira de Lima “E, tudo o que pedirdes em oração, crendo, o recebereis. ” Mateus 21:22 AGRADECIMENTOS À Deus, pelo dom da vida e proteção. À Nossa Senhora Aparecida, por interceder por mim junto a seu Filho amado. Aos meus pais, como exemplos de seres humanos, apoiando, incentivando e orando pelos meus sonhos. À minha irmã, pelo incentivo. À minha namorada, pelo encorajamento, paciência, amor e companheirismo. Aos meus parentes e familiares, pelo encorajamento. Aos amigos pelos exemplos, apoio, momentos de descontração, conselhos e companheirismo. À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade, ensinamentos, conhecimentos compartilhados e suporte. Ao meu coordenador Rodrigo Oliveira de Lima, pelos ensinamentos, pela atenção e pelo apoio constante. À minha coorientadora Denise Cunha dos Santos Dias, pela atenção e apoio constante. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho. MEU ETERNO AGRADECIMENTO! RESUMO A produção de sementes híbridas de milho é trabalhosa e onerosa. A necessidade de garantir o cruzamento entre as linhagens e a pureza das sementes exige a realização do despendoamento de extensos campos de produção. Contudo, a adoção dessa técnica enfrenta diversos desafios, tais como a escassez de mão de obra qualificada, eficiência e qualidade do trabalho realizado, danificação das plantas e custo elevado. Portanto, a implantação de uma técnica que substitua o despendoamento e solucione alguns desses obstáculos favorecerá a produção de sementes híbridas de milho. Dessa forma, a técnica da macho-esterilidade é uma opção que comprovadamente é eficiente para substituir o despendoamento, visto que a planta é incapaz de produzir pólen viável, sem afetar o desenvolvimento dos órgãos florais femininos e as estruturas vegetativas não apresentarem qualquer anomalia. Essa característica é obtida através de genes recessivos que impedem o desenvolvimento ou viabilidade do pólen. Atualmente, existem dois sistemas de macho-esterilidade descritos para a cultura do milho, a macho-esterilidade de origem citoplasmática e a nuclear. Esses sistemas diferem de acordo com os genes de esterilidade e os genes restauradores da fertilidade. A macho-esterilidade citoplasmática é o sistema mais difundido e estudado, e foi muito utilizada na segunda metade do século XX. Todavia, apresenta alguns fatores a serem superados para ser adotado plenamente nos sistemas de produção, tais como a susceptibilidade das plantas a doenças e instabilidade da esterilidade diante de determinados fatores ambientais. Em contrapartida, ao longo dos últimos anos uma nova técnica denominada SPT (Seed Production Technology) têm sido estudada e aprimorada, visando auxiliar no processo de multiplicação e manutenção de linhagens com macho-esterilidade nuclear através da transgenia. Desta forma, a técnica da macho-esterilidade se mostra muito próspera, viável e sustentável nos sistemas de produção de sementes híbridas de milho. Contudo, é necessária a busca por novos genes de indução e restauração e o entendimento da interação desses genes em diferentes genótipos e ambientes. Palavras-chave: Zea mays L.; melhoramento genético; despendoamento; helmintosporiose. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS APROSOJA Associação do Produtores de Soja e Milho do Mato Grosso CIMMYT International Maize and Wheat Improvement Center CMS Macho-Esterilidade Citoplasmática CNA Confederação da Agricultura e Pecuária CONAB Companhia Nacional de Abastecimento EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária GMS Macho-Esterilidade Nuclear GoT Grow Out IAC Instituto Agronômico de Campinas SPT Seed Production Technology TUS Taxa de Utilização de Sementes UFV Universidade Federal de Viçosa USDA United States Department of Agriculture VPA Variedade de Polinização Aberta LISTA DE FIGURAS Figura 1. A – Pendão estéril sem anteras. B – Pendão parcialmente restaurado com variável número de anteras soltas. C – Pendão fértil com anteras em todos os ramos ..........................16 Figura 2. Etapas de produção de sementes híbridas utilizando macho-esterilidade citoplasmática ...........................................................................................................................23 Figura 3. Etapas de produção de sementes híbridas de milho utilizando o processo SPT ….25 Figura 4. Multiplicação da linhagem mantenedora SPT ..........................................................25 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 10 2. DESENVOLVIMENTO ................................................................................................... 12 2.1. IMPORTÂNCIA ........................................................................................................ 12 2.2. MACHO-ESTERILIDADE ....................................................................................... 14 2.2.1. MACHO-ESTERILIDADE CITOPLASMÁTICA (CMS) ................................ 15 2.2.1.1. CMS – T ............................................................................................................. 17 2.2.1.2. CMS – S ............................................................................................................. 18 2.2.1.3. CMS – C ............................................................................................................. 19 2.2.2. MACHO-ESTERILIDADE NUCLEAR (GMS) ................................................... 20 2.2.3. PRODUÇÃO DE SEMENTES HÍBRIDAS .......................................................... 20 2.2.3.1. OBTENÇÃO DAS LINHAGENS MACHO-ESTÉRIL E MANTENEDORA . 21 2.2.3.2. SISTEMA CMS DE PRODUÇÃO .................................................................... 23 2.2.3.3. SISTEMA GMS DE PRODUÇÃO .................................................................... 23 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 26 4. REFERÊNCIAS ................................................................................................................27 10 1. INTRODUÇÃO Originário do continente americano, mais especificamente do México, o milho (Zea mays L.) foi cultivado e consumido primeiramente pelos povos Maias, Astecas e Incas. No Brasil, os povos indígenas também faziam uso do cereal em suas dietas. Entretanto, após a descoberta da América e das grandes navegações do século XVII, a cultura do milho se expandiu para outras regiões do mundo (APROSOJA, 2012). Atualmente, o grão é cultivado e consumido em todos os continentes e é o cereal produzido em maior volume no mundo (CNA, 2016). De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2017), na safra 2015/2016, o Brasil foi o terceiro maior produtor mundial de milho, e ficou atrás apenas dos Estados Unidos e China. Quando se refere ao consumo do cereal, o país se encontra na quarta posição. Boaretto (2009) destaca que no ano de 2050 a população mundial será de nove bilhões de pessoas, 20% maior que a atual. Esse aumento populacional requererá um crescimento na produção de alimentos, principalmente de milho, utilizado como base alimentar de muitos povos e matéria-prima industrial e energética (GARCIA et al., 2006). Para suprir essa demanda existem alternativas como expandir as áreas cultivadas e aumentar a produtividade das lavouras. A expansão de novas áreas é limitada por fatores como limites físicos, agroecológicos, sociais e econômicos (MIRANDA, 2016). Diante disso, o investimento no incremento da produtividade das áreas é um caminho a ser seguido para atingir o sucesso dos cultivos agrícolas. Ao longo dos anos diversas práticas e tecnologias foram inseridas na agricultura com intuito de facilitar o manejo e elevar a produtividade. Práticas como a utilização de fertilizantes e corretivos de solo, plantio direto, uso de defensivos agrícolas e sementes melhoradas são alguns dos exemplos que contribuíram para o aumento da produtividade dos cereais nos últimos anos (VIEIRA FILHO; CAMPOS; FERREIRA, 2005). Entre todos os fatores citados acima, o melhoramento genético com finalidade de obtenção de sementes híbridas de milho foi uma das principais técnicas inseridas no sistema de produção que contribuíram para o aumento da produtividade. Assim, o milho híbrido foi introduzido no mercado em meados da década de 1930, substituindo gradativamente as variedades de polinização aberta que existiam na época (BARBOSA, 2015). Nesta época, o uso de milho híbrido nos Estados Unidos era de 75% da área total cultivada e alcançou 95% na década de 1960, devido a sua elevada produtividade (BUENO; MENDES; CARVALHO, 11 2006). No Brasil, o primeiro programa de melhoramento para obtenção de milho híbrido teve início no Instituto Agronômico de Campinas, em 1932. A partir desse programa, o pesquisador Carlos Arnaldo Krug e colaboradores produziram no mesmo ano de inauguração, o primeiro híbrido duplo brasileiro (SANTOS, 2009), entretanto apenas em 1937, os professores da Universidade Federal de Viçosa (UFV), Diogo Alves de Melo e Antônio Secundino de São José sintetizaram e lançaram o primeiro híbrido de milho comercial no Brasil por meio do cruzamento dos cultivares de polinização aberta Cateto e Amarelão (PROGRAMA MILHO UFV), o que causou grande impacto econômico na época. Atualmente, quase toda a produção comercial de milho é oriunda de sementes híbridas. Entretanto, para a obtenção dessas sementes é necessário que ocorra a polinização cruzada entre dois parentais distintos, uma linhagem masculina, fornecedora de pólen, e outra, fornecedora de óvulos. Diante disso, é necessário controlar o fluxo de pólen no campo de produção de sementes como forma de garantir a polinização cruzada (MAGALHÃES, 2011) e evitar a autopolinização das linhagens femininas (CIGAN, 2014). Para garantir a fecundação cruzada entre os dois genitores que constituirão o híbrido, é necessário assegurar que as linhagens fêmeas não produzirão pólen. Isso pode ser obtido de duas formas: despendoamento manual ou mecanizado, que é oneroso e trabalhoso em extensos campos de produção de sementes, ou através do sistema de macho-esterilidade genética, que é uma alternativa mais eficiente e de maior retorno financeiro. Os materiais machos-estéreis não produzem grãos de pólens viáveis e o uso dessas linhagens fêmeas, elimina-se a necessidade de realizar o despendoamento das mesmas. Essa técnica vem auxiliar estrategicamente as unidades de produção de sementes com redução dos custos e aumento na qualidade das sementes colhidas (BIUDES, 2012; CHEN et al., 2016). Ao longo das últimas décadas, entretanto, a utilização da macho-esterilidade não está difundida nos campos de produção de sementes híbridas de milho. A ocorrência desse fato deve-se a instabilidade dos genes inseridos nos genótipos superiores diante variações climáticas e susceptibilidade a doenças (MARSHALL et al., 1974). Diante disso, o objetivo desse trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica sobre a utilização de macho-esterilidade na produção de sementes híbridas de milho. 12 2. DESENVOLVIMENTO 2.1. IMPORTÂNCIA O milho é o cereal mais produzido do mundo, sendo cultivado em todos os continentes. Desde que foi domesticado há 8.000 anos atrás até sua difusão por inúmeras regiões do mundo, o milho mostrou adaptação a distintas condições climáticas e latitudes (BIUDES, 2012). Desta maneira, o cereal se tornou base alimentar de muitos povos, além de matéria-prima para inúmeros outros setores. De acordo com USDA (2017), a produtividade média mundial de milho, na safra 2015/2016, foi de 5,41 toneladas por hectare. Todavia, é visível a discrepância entre países líderes de produtividade em comparação aos que se situam no outro extremo da lista, nítido reflexo das formas de cultivo realizadas e nível de desenvolvimento do país. De acordo com USDA (2017), a produção e produtividade norte-americana de milho, na safra 2016 bateu recordes, com produtividade média de 11 toneladas por hectare. O estado de Iowa produziu na referida safra aproximadamente 70 milhões de toneladas de milho, com produtividade média de 12,5 toneladas por hectare, superando a produção brasileira que foi de 66,5 milhões de toneladas e produtividade média de 4,1 toneladas por hectare na mesma safra (CONAB, 2017). Essa discrepância na produtividade média pode ser atribuída ao desenvolvimento de técnicas de cultivo mais apropriadas, adoção de modernos maquinários e sistemas de adubação e proteção de cultivos que propiciem incrementos na produtividade. Da mesma forma, o investimento em genótipos superiores que respondam a utilização de insumos é de extrema importância na obtenção de produtividades superiores. Os programas de melhoramento genético do milho buscam selecionar genótipos superiores para incrementar a produtividade e sanidade das sementes comerciais, como forma de garantir ótimo desempenho no campo. Essas sementes comerciais podem ser classificadas como variedades de polinização aberta ou híbridos. Uma variedade de polinização aberta (VPA) de milho é um conjunto de indivíduos selecionados que se intercruzam (CIMMYT, 2007). Ela é um material geneticamente estável e que, por esta razão, com os devidos cuidados em sua multiplicação, pode ser reutilizada por várias safras sem nenhuma perda de seu potencial produtivo (NUNES, 2016). Essas sementes são de menor custo e de grande utilidade em regiões onde, devido às condições socioeconômicas e de baixa tecnologia, a utilização de híbridos de milho torna-se inviável, como por exemplo no continente africano. Sementes de híbridos são materiais que geram plantas com alto vigor e produtividade, no entanto, para produzir bem necessitam de ótimascondições de crescimento, com quantidades 13 corretas de fertilizantes e água, além do manejo de pragas e doenças (PIONEER SEMENTES, 2014). No mercado existem três tipos de sementes híbridas de milho, classificadas como simples, duplos ou triplos. Os híbridos simples são o resultado do cruzamento de duas linhagens puras e indicados para sistemas de produção que utilizam alta tecnologia, pois possuem o maior potencial produtivo. São também os mais caros. O híbrido triplo é o cruzamento entre uma linhagem pura e um híbrido simples e é indicado para agricultores que utilizam média a alta tecnologia, enquanto o híbrido duplo é o resultado do cruzamento entre dois híbridos simples, sendo indicado também para média tecnologia (CRUZ; PEREIRA FILHO, 2009). Segundo Peske (2016), a taxa de utilização de sementes (TUS) de milho no Brasil é de, aproximadamente, 90%, que reflete o reconhecimento dos benefícios do uso de híbridos, cuja genética não se mantém de geração após geração. Assim, produtor necessita adquirir sementes para cada novo cultivo. De acordo com EMBRAPA (2016), na safra 2016/2017, de todos os 315 cultivares ofertados 67,61% foram híbridos simples, 6,03% híbridos duplos, 16,82% híbridos triplos, 3,17% híbridos simples modificados e 0,63% híbridos triplos modificados. As variedades representaram 5,07% do mercado de sementes de milho. O mercado de produção comercial de sementes híbridas de milho é trabalhoso e exige tecnologia. As sementes híbridas são obtidas através de polinização cruzada entre duas linhagens parentais geneticamente distintas, em que uma linhagem selecionada como a doadora de pólen (linhagem paterna) e a outra como receptora (linhagem materna) na qual a semente irá se desenvolver. As linhagens parentais masculinas e femininas são plantadas alternadamente, em linhas adjacentes, em campos isolados para permitir a livre polinização das linhagens fêmeas pelas doadoras de pólen (WU et al., 2016). A necessidade de impedir a autopolinização das linhagens femininas e promover a polinização cruzada promoveu a adoção de alguns métodos para o controle do fluxo de pólen nos campos produção de sementes. O método mais empregado pelas empresas é o despendoamento, o qual consiste na remoção da estrutura floral masculina das plantas selecionadas como genitoras femininas, através do uso de cortadores ou puxadores manuais ou mecânicos, assegurando que essas linhas apenas receberão pólen oriundo das linhas masculinas (WU et al., 2016). A técnica do despendoamento possui algumas características positivas e outras negativas. A retirada apenas do pendão, por exemplo, pode favorecer a planta, visto que a estrutura atua como um forte dreno e sua remoção diminui a concorrência por fotoassimilados (DIAS, 2015). Entretanto, a substituição do despendoamento por outra técnica mais eficiente é necessária. Fatores como o aumento no tamanho das lavouras, período curto para operação 14 (MENEZES, 1994), escassez de mão de obra qualificada (KOMATUDA et al., 2006) e danos causados as plantas, oriundos da remoção de algumas folhas são alguns exemplos de entraves enfrentados. Todavia, visando sanar essa necessidade, a técnica denominada macho- esterilidade vem sendo estudada e aprimorada para substituir o despendoamento. 2.2. MACHO-ESTERILIDADE A macho-esterilidade é a incapacidade de uma planta em produzir pólen viável, sem afetar o desenvolvimento dos órgãos florais femininos e as estruturas vegetativas não apresentarem qualquer anomalia (Figura 1) (SCHNABLE; WISE, 1998). Essa característica possui múltiplas origens podendo ser resultado de condições adversas de crescimento, por doenças, ou por mutações (BUDAR, 2001). Plantas macho-estéreis possuem pólens não viáveis que são formados através de uma cadeia de processos vitais durante a microsporogênese ou gametogênese. Esses processos estão sobre o controle genético de muitos locos, no qual a mutação de qualquer loco pode resultar na formação de grãos de pólen não viável ou micrósporos e, consequentemente, macho-esterilidade (SINGH et al., 2002). Desta maneira, esse sistema permite a eliminação da emasculação da linhagem feminina nos campos de produção de sementes híbridas (SCHNABLE; WISE, 1998). O primeiro registro de macho-esterilidade ocorreu em 1763, quando Koelreuter observou o aborto de anteras em alguns híbridos específicos (BIUDES, 2012). Segundo Kaul (1988), a manifestação de plantas macho-estéreis já ocorre em mais de 300 espécies vegetais, tais como milho, soja, feijão, arroz, trigo, couve-flor, abóbora, espinafre, entre outras. O primeiro registro de materiais macho-estéreis em milho ocorreu por Eyster (1921). Ao longo das últimas décadas, o interesse por conhecimento e domínio da técnica da macho-esterilidade aumentou pelos programas de melhoramento genético com intuito de desenvolver cultivares híbridos com maior eficiência e menor custo. Alguns fatores como a crescente demanda por milho e a expansão do uso de sementes híbridas pelos agricultores foram decisivos para a inserção da técnica. Atualmente, inúmeros tipos de macho-esterilidade foram descritos. Entretanto, os programas de melhoramento genético de milho fazem uso apenas de condicionamento de fatores citoplasmáticos e nucleares. A macho-esterilidade citoplasmática, a qual é associada a sigla CMS (Cytoplasmic Male Sterility) afeta alguns dos estádios da microsporogênese, enquanto a macho esterilidade nuclear, a qual é associada a sigla GMS (Genic Male Sterility) afeta a gametogênese masculina (COLOMBO; GALMARINI, 2017). Os processos de microsporogênese e gametogênese estão sobre o controle genético de muitos 15 locos, no qual a mutação de algum loco pode resultar em formação de grãos de pólen ou micrósporos não funcionais e, consequentemente, macho-esterilidade (SINGH et al., 2002). Os indivíduos machos-estéreis apresentam inúmeras interações com o ambiente em que estão localizados. Variáveis climáticas como a temperatura do ar e disponibilidade de água, duas a três semanas antes da antese (MARSHALL et al., 1974), estão correlacionados positivamente ou negativamente com a reversão parcial da esterilidade, independente dos genes citoplasmáticos e nucleares. Assim, a macho-esterilidade tem interação com fatores ambientais e genéticos (WEIDER et al., 2009). A relação entre essas variáveis envolvidas e a macho esterilidade ainda são pouco esclarecidas Figura 1. A – Pendão estéril sem anteras. B – Pendão parcialmente restaurado com variável número de anteras soltas. C – Pendão fértil com anteras em todos os ramos. Fonte: BÜCKMANN et al., 2014 2.2.1. MACHO-ESTERILIDADE CITOPLASMÁTICA (CMS) A macho-esterilidade citoplasmática é a principal forma de obtenção de indivíduos macho-estéreis para a cultura do milho. Esse sistema representa um dos poucos exemplos bem caracterizados de variabilidade herdada transmitida através do citoplasma (DEWEY et al., 1987). São envolvidos genes mitocondriais, herdados maternalmente, e restauradores da fertilidade de natureza nuclear, que exibem herança mendeliana e, assim, constitui-se um sistema binário (BELICUAS; GUIMARÃES, 2009). A incapacidade de estabelecer uma harmonia genômica entre a organela (mitocôndria) e o genoma nuclear resulta na CMS (FUJII; TORIYAMA, 2008; TOUZET; MEYER, 2014). A CMS tem sido descrita em mais de 140 espécies vegetais (LEVINGS III, 1990; COLOMBO; GALMARINI, 2017), entre as quais inclui milho, sorgo, arroz, petúnia, girassol, feijão, beterraba e cenoura (SCHNABLE; WISE, 1998). Em milho, o primeiro relato de CMS 16 foi realizado por Rogers (1944). Entretanto, a CMS não é efetiva para todos os germoplasmas de milho. A eficáciadepende da presença ou ausência de genes de restauração da fertilidade (rf), responsáveis pela inibição da expressão dos genes de macho-esterilidade, os quais são específicas para um dado citoplasma e se o germoplasma será utilizado como parental masculino ou parental feminino. Isso restringe as combinações gênicas disponíveis para o uso na produção de sementes híbridas de milho (WU et al., 2016). A CMS pode decorrer como um mecanismo espontâneo da espécie (HANSON; BENTOLILA, 2004), no qual ocorrem mutações no genoma mitocondrial (mtDNA) como resultado de recombinações intra e/ou intermolecular envolvendo sequências curtas repetidas de DNA (LEVINGS III, 1990). Outra fonte de desenvolvimento da CMS é por meios experimentais como mutações induzidas, mutação ampla/interespecífica, fusão protoplasmática e engenharia genética (YAMAGISHI; BHAT, 2014; WANG et al., 2013; SINGH et al., 2015). Em relação a macho-esterilidade genética (GMS), o desenvolvimento por engenharia genética para obtenção de linhagens CMS é mais difícil devido a obstáculos de transformar os genes alvos diretamente nos genomas mitocondriais ou citoplasmáticos (WANG et al., 2013). Os sistemas de restauração também podem ser utilizados para classificar os citoplasmas do milho. De acordo com Schnable e Wise (1998), esses sistemas são classificados como esporofítico, quando agem antes da meiose ou em tecidos esporofíticos ou gametofíticos, quando agem depois da meiose em micrósporos e grãos de pólen. Essas diferenças levam a várias diferentes transmissões paternas. Uma planta diploide que carrega um citoplasma macho- estéril e é heterozigota para um gene restaurador (Rf/rf) produzirá duas classes de grãos de pólen: aqueles que carregam o restaurador e aqueles que não carregam. No caso de um restaurador esporofítico, ambos as classes genotípicas dos gametas serão funcionais. Em contraste, no caso de uma planta heterozigota para um restaurador gametofítico, apenas aqueles gametas que carregam o restaurador serão funcionais. Entre os sistemas existentes, o sistema restaurador gametofítico é o mais propenso a reversão da fertilidade (KRAMPS; MCCARTY; CHASE, 1996) A diversidade no sistema de restauração estende-se ao número de genes restauradores que são necessários. Em alguns sistemas, a completa restauração requer a ação de vários genes, muitos dos quais têm pouco efeito (SCHNABLE; WISE, 1998). Por outro lado, em alguns sistemas poucos genes têm grandes efeitos. Assim, genes modificadores adicionais são às vezes requeridos para completar a restauração da fertilidade (POEHLMAN; SLEPER, 1995 apud BIUDES, 2012). 17 Em milho, existem três sistemas distintos de macho-esterilidade citoplasmática, identificados e classificados de acordo com suas respostas a específicos genes restauradores da fertilidade (Rf) do pólen: Texas ou T, USDA ou S e Charrua ou C (MALIGA et al, 2015). Vinculados a esses três grupos principais, atualmente são reconhecidos mais de 40 subtipos de CMS em milho (BIUDES, 2012). 2.2.1.1. CMS – T O primeiro sistema de macho-esterilidade citoplasmático descoberto em milho foi o T, detectado em 1944, no estado do Texas – EUA, na variedade Golden June (Rogers, 1952). Esse tipo de sistema é caracterizado pela falha da protrusão da antera e pelo abortamento dos grãos de pólen (LEVINGS III, 1990). Além disso, possuem grande número de células binucleadas (ROY; SARKAR, 1991 apud BELICUAS; GUIMARÃES, 2009). A CMS – T em milho é atribuída à presença do único gene mitocondrial chamado de T- urf13. A supressão completa dele e a restauração da fertilidade requer a ação de dois genes nucleares, rf1 e rf2 (DUVICK, 1965), localizados nos cromossomos 3 e 9, respectivamente (BIUDES, 2012). Além desses, os genes rf8 e rf* são capazes de restaurar a fertilidade parcialmente nesse tipo de citoplasma (WISE et al., 1999). Os genes rf1, rf8 e rf* se caracterizam pela redução dos níveis de expressão do gene T-urf13 (DILL et al., 1997; WISE et al., 1996). Entretanto, rf2 é um gene regulatório do gene rf1, de expressão constitutiva (CUI et al., 1996), que tem sido amplamente estudado. O gene rf2 codifica um aldeído desidrogenase (LIU et al., 2001) que, em plantas citoplasma T, tem a função de restauração da fertilidade e, em plantas de citoplasma normal, está envolvida no desenvolvimento das anteras (SOFI et al., 2007). A descoberta desse sistema foi importante para geneticistas e melhoristas, pois eliminou-se o custo do processo de emasculação manual ou mecanizada utilizada na produção de sementes híbridas de milho. Dessa forma, sua implementação nos campos de produção de sementes dos Estados Unidos e Brasil entre as décadas de 1950 e 70 foi muito significativa. As características como o fornecimento de uma fonte estável de CMS para a produção de sementes (LEVINGS III, 1990) e a obtenção fácil dos restauradores desse tipo de citoplasma foram importantes para o sucesso do CMS -T. No início da década de 1970, nos Estados Unidos e, no ano seguinte, no Brasil, uma epidemia de helmintosporiose (Helminthosporium maydis race T) atingiu os materiais que carregavam CMS-T, que naquele momento constituía mais de 85% da área de produção de 18 sementes de milho nos Estados Unidos, e, praticamente, extinguiu a sua utilização nos campos de produção de sementes (DEWEY; KORTH, 1994). Esse fungo produz a patotoxina BmT que é hospedeiro-específico para esse sistema de macho esterilidade, mas não para outros citoplasmas de milho e outras espécies de plantas (LEVINGS III, 1990). Diante do ocorrido, a produção e utilização em larga escala de sementes híbridas de CMS-T foi interrompida e, passou-se, a empregar o citoplasma normal ou os tipos C e S (BELICUAS; GUIMARÃES, 2009). Além disso, deixou-se um alerta de perigo referente à vulnerabilidade por uniformidade, neste caso não genética, mas citoplasmática (BORÉM, 1999). 2.2.1.2. CMS – S A CMS - S foi descrita pela primeira vez por Jenkins, funcionário do USDA, na linhagem Teopode de milho (GRACEN et al., 1979). Atualmente, esse sistema é o maior grupo entre os três tipos, além de possuir amplas fontes de citoplasmas (VANČETOVIĆ et al., 2010). Entretanto, esse sistema é também o tipo mais instável de fertilidade e exibe macho-esterilidade incompleta em linhas estéreis sobre específicos antecedentes genéticos (GABAY- LAUGHNAN, et al. 1995; WEIDER, et al. 2009). Devido a esses aspectos negativos, o seu uso na produção comercial de sementes híbridas de milho não foi bem-sucedida (SU et al., 2016). Esse tipo de citoplasma é um exemplo de um sistema CMS gametofítico (KAMPS et al. 1996). Os materiais CMS – S são caracterizados pela presença de pequenos plasmídeos de baixo peso molecular denominados S1 (6379 pares de bases) e S2 (5453 pares de bases) (PAILLARD et al., 1985). A esterilidade do pólen durante seu desenvolvimento está associada à região R do genoma mitocondrial, local em que ocorre a expressão da quimera orf355-orf77 e contribui para a esterilidade (WEN et al., 1999; MATERA et al., 2011). A restauração da fertilidade de indivíduos CMS – S ocorre por meio do gene nuclear dominante rf3, localizado no cromossomo 2 (LAUGHMAN; GABY-LAUGHMANM, 1983). A ação do rf3 resulta na redução do tamanho dos transcritos do citoplasma S associados com a orf355-orf 77 (BELICUAS; GUIMARÃES, 2009). Weider et al. (2009) caracterizou um segundo gene restaurador da fertilidade de CMS-S, nomeado rf9, qual foi retratado como altamente influenciável pelas condições ambientais. Quase 60 locos restauradores da fertilidade de CMS – S já foram descritos além do rf3, sete deles mapeados no cromossomo 2 e os outros nos cromossomos 1, 3, 6 e 8 (GABAY-LAUGHNAMet al., 2004). Grande parte desses locos não é útil comercialmente, pois possuem características como a letalidade ou efeitos deletérios 19 em homozigose e, portanto, são denominados restauradores de fertilidade letais (WEN et al., 2003). As frequentes reversões de fertilidade desse sistema podem ser consequência de mutações nucleares ou de mudanças citoplasmáticas (GABAY-LAUGHNAM et al., 2004). Além do mais, existem evidências de que elementos transponíveis podem estar relacionados à recuperação da fertilidade, o que torna o processo mais instável (LAUGHMAN; GABY- LAUGHMANM, 1983). 2.2.1.3. CMS – C O primeiro relato de CMS – C foi realizado por Beckett (1971) na variedade brasileira de milho nomeada Charrua. Esse sistema quando comparado com os outros dois citados acima mostra-se mais estável que a observado pelo CMS – S (WEIDER et al., 2009) e não está associado à nenhuma doença como o CMS - T. Dessa forma, atualmente o CMS – C tem sido o sistema mais utilizado para geração de linhagens macho-estéreis em programas de melhoramento de milho e desenvolvimento de híbridos (BELICUAS; GUIMARÃES, 2009). Contudo, a utilização desse sistema em escala comercial não ocorre devido sua instabilidade diante a variações climáticas A mitocôndria do citoplasma CMS – C é caracterizada por apresentar um único peptídeo de 17,5 kD no lugar de um peptídeo de membrana de 15,5 kD em citoplasma normal (NEWTON, 1989 apud SOFI et al., 2007). Além disso, já foram detectadas mutações nos genes, nomeados atp 6, atp 9 e cosII, resultantes do rearranjo entre o genoma mitocondrial e o do cloroplasto (SOFI et al., 2007). Segundo Kheyr-Pour et al. (1981) e Newton (1983), a capacidade de restaurar completamente a fertilidade de materiais CMS – C ocorre através do gene dominante Rf4, localizado no cromossomo 8. Todavia, Tang et al. (2002) e Weider et al. (2009) entre outros autores, apresentam evidências de que pelo menos dois ou três genes nucleares rf seriam importantes na restauração de fertilidade. Segundo Josephson et al. (1978), Kheyr-Pour et al. (1981) e Gabay-Laughnan et al. (2004), além do gene nuclear dominante rf4, os genes rf5 e o rf6 estão envolvidos na restauração total ou parcial da fertilidade nesse tipo de citoplasma. Inúmeros estudos têm sido apresentados sobre restauração da fertilidade e aborto de pólen em milho, entretanto, esses mecanismos permanecem vagos e não alcançam um consenso (CHEN et al., 2016). Como resultado, a falta de compreensão dos fatores de restauração prejudica a sua utilização em escala comercial. (YONGMING, 2016). 20 2.2.2. MACHO-ESTERILIDADE NUCLEAR (GMS) A macho-esterilidade nuclear foi descrita pela primeira vez em milho por Eyster (1921). Atualmente, mais de 175 espécies possuem genes nucleares descritos que afetam o desenvolvimento do pólen (COLOMBO; GALMARINI, 2017). Entre elas pode-se destacar: arroz, tomate, soja, ervilha e arabidopsis (SKIBBE; SCHNABLE, 2005). Desde sua descrição em milho, mais de 40 locos associados à característica foram identificados (SKIBBE; SCHNABLE, 2005). A GMS ocorre quando a formação do pólen falha devido lesões em genes nucleares codificados (SKIBBE; SCHNABLE, 2005). Essas lesões no gene afetam quase todos os estádios de desenvolvimento da antera e varia de pré-meiose até o grão de pólen completamente desenvolvido (ALBERTSEN, 1997; CHAUBAL et al., 2003). Em milho, um gene macho- estéril (ms45) tem sido isolado (CIGAN et al., 2001). A característica de uma planta macho- estéril é expressa apenas pela manutenção de uma condição homozigótica recessiva (ms/ms) para o gene de fertilidade (PIONEER HI-BRED, 2009). Entretanto, o genótipo pode apresentar restauração parcial ou total da fertilidade dos pólens, de acordo com as condições ambientais (SINGH, 2002). De acordo com Skibbe e Schnable (2005), o mecanismo molecular pelo qual esse gene atua não é conhecido. A restauração da fertilidade e multiplicação das linhagens macho-estéreis ocorre através do cruzamento com uma linhagem restauradora homozigota (Ms/Ms) e com uma linhagem mantenedora heterozigota (Ms/ms), respectivamente. Contudo, as progênies oriundas do cruzamento da linhagem macho-estéril com a linhagem mantenedora são 50% macho estéreis e 50% macho férteis. Em virtude de não ser possível distinguir uma semente fértil de uma estéril, a GMS não possui uma forma prática de multiplicação de suas linhagens macho-estéreis (WILLIANS, 1995; PEREZ-PRAT; CAMPAGNE, 2002; WU et al., 2015). Portanto, não é utilizada comercialmente. 2.2.3. PRODUÇÃO DE SEMENTES HÍBRIDAS A produção comercial de sementes híbridas a partir da macho-esterilidade é funcionalmente dividida em três estádios: obtenção e manutenção das linhagens femininas macho-estéril e das linhagens mantenedoras, além da manutenção das linhagens restauradoras da fertilidade. 21 2.2.3.1. OBTENÇÃO DAS LINHAGENS MACHO-ESTÉRIL E MANTENEDORA Assim que selecionadas e caracterizadas as linhagens elites do programa de melhoramento genético, o processo mais comumente utilizado para o desenvolvimento de uma linhagem macho-estéril CMS é o da introgressão (CHASE, 2007; BIUDES, 2012). Através da realização de aproximadamente cinco a seis retrocruzamentos entre a linhagem elite com uma linhagem doadora do gene de macho-esterilidade obtêm-se uma linhagem isogênica a elite, diferenciada apenas pela expressão de macho-esterilidade (KHAN et al., 2015). O conhecimento da genética celular das linhagens elites selecionadas é de grande importância, pois a presença de genes rf nesses materiais pode interferir na eficiência e estabilidade de macho-esterilidade (CHASE, 2007). Diante disso, caso identificado os genes rf nas linhagens, é necessária a realização da seleção contrária a estes genes, de maneira a remover os alelos dominantes das linhagens introgredidas e também da linhagem isogênica macho-estéril (BIUDES, 2012). O desenvolvimento da linhagem restauradora da fertilidade é obtido através das presenças dos alelos rf em homozigose dominante no núcleo. No entanto, o genoma citoplasmático fértil ou infértil não interfere na fertilidade em função da presença dos genes restauradores (BIUDES, 2012). Regularmente são encontradas misturas de linhagens mantenedoras com linhagens macho-estéreis, tendo em vista que ambas são isogênicas do ponto de vista nuclear e, nesse caso, não é possível a distinção dos materiais até o florescimento (COLOMBO; GALMARINI, 1998; BELICUAS; GUIMARÃES, 2009). Todavia, marcadores moleculares podem ser utilizados para analisar e diferenciar de forma mais rápida e precisa os sistemas e os tipos de macho esterilidade presentes e, assim, suplementar o convencional teste de grow-out (GoT) (BOHRA et al., 2016), no qual as plantas são cultivadas até atingirem a maturidade e avalia-se as características fenotípicas que distinguem o híbrido (BELICUAS; GUIMARÃES, 2009) De acordo com Perez-Prat e Campagne (2002), o sistema de obtenção da GMS se baseia na expressão específica de modificações em genes nucleares, através da expressão de uma proteína capaz de interromper a função celular. Essa característica é obtida com a introdução no genoma da linhagem superior selecionada de uma molécula de DNA recombinante que codifica um produto genético que inibe a formação ou a função do pólen (CIGAN; ALBERTSEN, 1998). 22 Uma revolucionária metodologia para criação de uma linhagem mantenedora da GMS é proposta pela Pioneer Hi-Bred (2009), como solução ao obstáculo de diferenciação dos materiais na multiplicação das linhagens femininas macho-estéreis. Essa metodologia fundamenta-se na multiplicação das linhagens macho-estéreisatravés do cruzamento com uma linhagem mantenedora transgênica, e posterior diferenciação de progênies macho-estéreis de progênies macho-férteis. De acordo com Pioneer Hi-Bred (2009), o processo denominado SPT (Seed Production Technology) baseia-se em um evento transgênico de milho DP-32138-1, conhecido como mantenedor STP 321338. Esse mantenedor é utilizado como um polinizador e propagador das sementes das linhagens parentais femininas não transgênicas em produção de sementes híbridas. O mantenedor SPT 32138 é gerado por uma transformação mediada pela Agrobacterium de uma linhagem de milho geneticamente macho-estéril (ms45/ms45) com um plasmídeo designado PHP24597. Esse plasmídeo contém expressão de três genes essenciais para o funcionamento do sistema SPT: Ms45, zm-aa1 e DsRed2(Alt1). Os genes SPT inseridos foram integrados no genoma em um loco que segrega independentemente do loco do gene de macho-esterilidade ms45 e de maneira conectada, de forma que a expressão de um gene resulta na expressão dos demais. A linhagem SPT é homozigota recessiva para o gene ms45 e hemizigoto para o gene recombinante Ms45, indicado como Ms/- (PIONEER HI-BRED, 2009). A presença de uma única cópia do gene Ms45 no genoma ms45/ms45 restaura a macho- fertilidade e possibilita a produção de pólen na mantenedora SPT 32138 (Pioneer Hi-Bred, 2009). Por outro lado, o gene zm-aa1 visa codificar a proteína ZM-AA1 α-amilase, na qual a expressão dessa proteína durante o desenvolvimento do pólen resulta em hidrólise e esgotamento das reservas de amido, tornando o pólen infértil. Por último, o gene DsRed2(Alt1), o qual atua como um marcador que codifica uma variante da proteína vermelho fluorescente (DsRed2). A expressão da proteína DsRed2 em sementes transmite uma coloração vermelho- rosada à camada de aleurona de sementes de milho, essa coloração permite a identificação visual e eficiente separação automática de sementes mantenedoras SPT 32138 de sementes amarelas que não são transgênicas para SPT (WU et.al., 2016). A linhagem mantenedora SPT produz dois tipos de pólen: fértil, porém não contém a inserção SPT e infértil, contendo a inserção SPT, na proporção 1:1. A garantia que os genes de transgenia não são repassados as progênies é resultado da expressão do gene zm-aa1 (WU et.al., 2016). 23 2.2.3.2. SISTEMA CMS DE PRODUÇÃO Após a avaliação e a constatação da eficiência e estabilidade de macho-esterilidade, a linhagem é direcionada para a multiplicação de suas sementes e posteriores cruzamentos. Conforme a figura 2, atualmente, o processo de multiplicação e manutenção de linhagens macho-estéreis é realizado através do cruzamento com um a linhagem mantenedora isogênica, diferindo apenas pela ausência do gene de macho-esterilidade. Em contrapartida, as linhagens mantenedoras e restauradoras de fertilidade são mantidas e multiplicadas através da autopolinização desses grupos de plantas (SINGH et al., 2002). O próximo passo no processo produtivo é a implantação dos campos de produção de sementes híbridas F1. Através de blocos de cruzamento entre a linhagem macho-estéril e a linhagem restauradora da fertilidade são obtidas as sementes básicas para a produção comercial de milho. A relação entre o número de fileiras de linhagens femininas macho-estéreis e a linhagem restauradora da fertilidade é definida de acordo com a capacidade de fornecimento de pólen e polinização dos materiais (MARTIN et al., 2007). Figura 2. Etapas de produção de sementes híbridas com utilização de macho-esterilidade citoplasmática. Fonte: Adaptado de Atokple, 2012. 2.2.3.3. SISTEMA GMS DE PRODUÇÃO A primeira parte do processo consiste em multiplicar a linhagem mantenedora SPT 32138 (Figura 3). Ela é multiplicada em campos aberto de autopolinização e, assim, possibilita- 24 se a transmissão da inserção SPT que é herdada maternalmente. As sementes geradas das autopolinizações serão de dois tipos distintos, na proporção 1:1, as amarelas são sementes não transgênicas para SPT e as vermelhas-rosadas que fluorescem cor vermelha brilhante sob apropriada iluminação são transgênicas para SPT (Figura 4) (PIONEER HI-BRED, 2009). A mistura de sementes vermelhas e amarelas oriundas da autopolinização do mantenedor SPT 32138 são passadas duas vezes através de um classificador mecânico de cor e possibilita a separação das sementes mantenedoras SPT 32138 das sementes amarelas. Desta forma, as sementes puras do mantenedor SPT 32138 estão disponíveis para a propagação da linhagem feminina macho-estéril não-transgênica e as sementes amarelas podem ser descartadas (PIONEER HI-BRED, 2009). Posteriormente, a linhagem mantenedora isogênica SPT é semeada para cruzamento com a linhagem feminina macho-estéril para multiplicação de semente do parental. A relação de plantio 2:2, 4:4 ou 4:2 (linhagem feminina macho-estéril: linhas mantenedoras isogênicas SPT 32138) é estabelecida de acordo com as características de cada linhagem. Pólens férteis originários das plantas mantenedoras promovem a polinização cruzada e fertilizaram as linhagens parentais femininas macho-estéreis. Por vez, as sementes oriundas das linhagens femininas mantem seu estado de homozigose recessiva e pureza genética, e possuem a cor amarela e não contém a inserção SPT 32138 (PIONEER HI-BRED, 2009). Com objetivo de assegurar a pureza da linhagem macho-estéril e que nenhuma semente da linhagem mantenedora SPT seja plantada em campos de sementes híbridas F1, cada lote de sementes é passado duas vezes pelo classificador de cor e toda semente de linhagem mantenedora é descartada. Essa é uma garantia de que as sementes híbridas F1 colhidas e vendidas para os agricultores não são transgênicas para SPT e são completamente férteis (PIONEER HI-BRED, 2009). Realizado a segunda classificação das sementes, os materiais macho-estéreis estão prontos para serem semeados alternadamente com um parental masculino. O parental masculino detém o gene de restauração da fertilidade em homozigose dominante (Ms45/Ms45), que é transmitido via pólen a linhagem materna. As sementes híbridas F1 geradas pelas linhagens maternas desse cruzamento serão todas férteis e não possuem os genes de transgenia SPT. As linhas paternas não são utilizadas como fornecedoras de sementes e são destruídas antes da colheita. 25 Figura 3. Etapas de produção de sementes de milho híbrido utilizando o processo SPT. Adaptado de Pioneer Hi-Bred (2009). Figura 4. Multiplicação da linhagem mantenedora SPT. Adaptado de Pioneer Hi-Bred (2009). 26 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS A macho-esterilidade é uma solução que comprovadamente sana as necessidades do mercado sementeiro, por uma técnica operacionalmente eficiente, economicamente viável e ecologicamente correto. Contudo, é necessário a busca por compreensão do funcionamento e atuação dos genes indutores de macho esterilidade citoplasmática e suas respostas em diferentes genótipos e ambientes, assim como novas fontes de macho esterilidade mais estáveis e resistentes a doenças. Da mesma forma, a utilização de macho-esterilidade nuclear juntamente com processo SPT de obtenção de sementes híbridas de milho é próspero, porém outros genes devem ser descobertos para aumentar a variabilidade dos materiais e reduzir a possibilidade de perca de eficiência da tecnologia. 27 4. REFERÊNCIAS APROSOJA (2012). A história do milho. Disponível em: http://www.aprosoja.com.br/soja-e- milho/a-historia-do-milho. Acessado em: 26 de abril de 2017. ATOKPLE, I.D.K. (2012). Hybrid Sorghum Production. Presentation at the Bioscience for Farming in Africa. Accra, Ghana. BARBOSA, N.C. (2015). RegistroNacional de Cultivares de Milho no Brasil. Monografia de Graduação. Universidade de Brasília. 68p. BECKETT, J. (1971). 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