Toxicologia e Análises Toxicológicas

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APONTAMENTOS 
 
 
 
 
TOXICOLOGIA E ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
- Aulas Laboratoriais - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FACULDADE DE FARMÁCIA 
 
 UNIVERSIDADE DE COIMBRA 
 
 
 
 
 
I- EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE TÓXICOS 
1 - Generalidades 
No meio em que actualmente vivemos somos confrontados com uma vastidão de 
produtos químicos e biológicos que, pela sua natureza, concentração, modo de 
administração, emprego, entre outros, podem desencadear reacções adversas ou 
tóxicas. Para contrariar essa toxicidade é necessário conhecer a natureza do 
composto tóxico, os seus efeitos e o seu antídoto. 
A pesquisa de um tóxico num meio compreende a sua extracção do meio e a sua 
identificação. 
2 - Extracção 
2.1. Introdução 
Para promover um correcto isolamento de um veneno é necessário conhecer 
previamente a sua natureza, nomeadamente as suas propriedades físico-químicas 
(solubilidade e ionização), grupos funcionais, etc. 
Um tóxico de natureza mineral isola-se destruindo o substrato orgânico que o 
acompanha por um processo de mineralização. 
Se o tóxico é de natureza complexa, orgânica ou mineral, deve-se ter em conta a sua 
solubilidade (ou dos seus derivados) em diferentes solventes, relativamente a outras 
substâncias que o acompanham, bem como a polaridade da sua molécula sob a 
influência de um campo eléctrico. 
Tóxicos voláteis, ou volatilizáveis, são facilmente extraídos do meio em que se 
encontram, por este ser normalmente fixo. 
2.2. Separação de venenos voláteis 
A separação deste tipo de venenos das amostras de tecidos é normalmente efectuada 
por destilação por arrastamento de vapor, substituída, na prática, por uma destilação 
simples. 
O tecido, é triturado e homogeneizado em água destilada. A mistura é acidificada 
com ácido tartárico e colocada num aparelho de destilação pelo vapor. O destilado é 
recolhido em 5 fracções (50 ml). Este método permite isolar dos tecidos, álcoois, 
aldeídos, éteres, acetona, fenóis, sulfureto de carbono, óleos e hidrocarbonetos 
voláteis, clorofórmio, ácido cianídrico, entre outros. 
 
 
Após a recolha destas fracções (que vão sendo analisadas) deixa-se arrefecer o 
aparelho, alcaliniza-se o meio com magnésia e recomeça-se a destilação recolhendo, 
pelo menos, mais duas fracções. Obtém-se, neste destilado, amónia, anilina, nicotina 
e outras bases voláteis presentes nos tecidos. 
2.3. Separação de venenos minerais 
O resíduo que permanece no balão de destilação após a separação dos venenos 
voláteis é usado para a pesquisa de venenos metálicos. O primeiro passo a efectuar 
implica a destruição da matéria orgânica por oxidação com cloro, ácido nítrico, ácido 
perclórico, entre outros. O tecido é aquecido com o agente oxidante até a mistura 
ficar com uma consistência fluida, cor amarela uniforme e sem partículas de matéria 
orgânica. A mistura é filtrada a quente e o resíduo lavado com água. O resíduo 
apresenta prata, sob a forma de cloretos insolúveis, chumbo, bário e estrôncio sob a 
forma de sulfatos insolúveis. 
O filtrado, que contém os restantes metais presumivelmente existentes na amostra, é 
aquecido e o excesso de cloro removido por passagem através da solução duma 
corrente de anidrido carbónico. A adição de sulfito de sódio, em quantidade 
suficiente para produzir um cheiro a anidrido sulfuroso, vai converter o arsénio 
pentavalente em arsénio trivalente. 
A mistura é aquecida até que desapareça o cheiro a anidrido sulfuroso. Neutraliza-se 
o excesso de ácido (caso exista) com carbonato de sódio, para não impedir a 
precipitação do antimónio e do estanho com uma corrente de gás sulfídrico. 
Coloca-se o filtrado num banho de água mantendo-se a temperatura a cerca de 70 ÛC. 
Faz-se passar pela solução e durante pelo menos uma hora uma corrente de gás 
sulfídrico e deixa-se em repouso durante a noite. Este processo permite a 
precipitação do arsénio, antimónio, estanho, mercúrio, chumbo, cobre, bismuto e 
cádmio, sob a forma de sulfuretos. 
O filtrado conterá todos os restantes metais, todos os vestígios de chumbo e qualquer 
porção de bário e estrôncio que não tenha sido retido no filtro sob a forma de sal 
insolúvel. A separação e identificação dos vários metais pode ser efectuada por 
métodos qualitativos e quantitativos específicos. 
Em casos de suspeita de envenenamento por metais existem testes qualitativos 
extremamente rápidos e que podem servir para despiste. O Teste de Reinsch, 
aplicado em amostras contendo matéria orgânica, permite a identificação dos 
venenos metálicos mais comuns e mais tóxicos: Hg, As, Sb, Bi. O Teste de Gutzeit é 
um método qualitativo bastante eficaz na pesquisa do arsénio e baseia-se no facto da 
arsina decompor o nitrato de prata com formação de prata metálica. 
 
 
Outro processo de destruição da matéria orgânica é o da mineralização por via seca 
(incineração e calcinação). Este método tem a vantagem de levar a uma concentração 
máxima do tóxico e à obtenção de cinzas isentas de compostos orgânicos, com os 
metais sob a forma de carbonatos, no entanto, além de ser moroso, pode ocasionar 
perdas importantes por volatilidade de alguns metais (Hg, Zn, Cd) e dos seus 
derivados (óxidos de arsénio e cloretos de antimónio). 
2.4. Separação de venenos orgânicos não voláteis 
Para a separação da maioria destes venenos é necessário preparar um extracto 
relativamente puro. Usa-se normalmente o método de Stas-Otto-Ogier, com algumas 
modificações, e que se fundamenta na solubilidade destes compostos em água e no 
álcool absoluto em presença de uma pequena quantidade de ácido. O álcool tem a 
vantagem de ser praticamente inerte quimicamente, apresentar uma grande pureza e 
uma miscibilidade total com a água. Além disso é relativamente volátil, o que facilita 
a sua eliminação posterior, tem um fraco poder dissolvente em relação aos tóxicos, 
floculando as proteínas e as gorduras. Este processo permite extrair os alcalóides e 
outras substâncias básicas, os glucósidos e outros princípios neutros, os ácidos 
orgânicos e os óleos, gomas e resinas. 
A amostra é dividida, tão finamente quanto possível, por trituração ou 
homogeneização, acidificada e extraída com álcool a quente. O extracto alcoólico é 
concentrado até pequeno volume e diluído com água, eliminando-se, por filtração, a 
maior parte da matéria gorda. O filtrado é de novo concentrado até pequeno volume e 
extraído com etanol absoluto eliminando a maior parte dos constituintes dos tecidos, 
de modo que o novo filtrado, livre de proteínas, hidratos de carbono, gorduras e sais 
minerais, possa ser novamente concentrado e fraccionado. 
As fracções, concentradas, são acidificadas e extraídas com éter. O extracto etéreo 
(éter ácido) poderá conter glicósidos, óleos, pirotoxina, ácido pícrico, ácido 
salicílico, acetanilina, derivados do ácido barbitúrico e outros compostos de 
solubilidade semelhante. 
A solução aquosa é agora alcalinizada com hidróxido de sódio e de novo extraída 
com éter. O extracto etéreo (éter alcalino) contém alcalóides livres. 
No entanto, os alcalóides que contêm o grupo hidroxilo fenólico (como a morfina) 
não são extraídos por este método. É necessário acidificar novamente a fase aquosa, 
alcalinizá-la com amónia e extraí-la com clorofórmio. 
Concluída esta fase, pode-se efectuar os métodos de análise qualitativa apropriados. 
Para a análise quantitativa deve-se, se possível, efectuar o ensaio directamente nos 
tecidos, ou tratar padrões nas mesmas condições, uma vez que estes métodos de 
extracção originam perdas de produto. 
 
 
3 - Identificação 
3.1. Ensaios prévios 
Em Toxicologia não existe um só método para proceder à identificação primária e 
rápida de um tóxico desconhecido. O número de moléculas é de tal modo elevado 
que é necessário fazer uma pesquisaprévia de modo a prever o tipo de substância em 
causa. O exame do local do acidente, a recolha de recipientes e de informações 
relativas à pessoa e ao local, entre outros, são dados que não podem ser descurados 
para um procedimento que se quer correcto e rápido, com resultados fiáveis. 
A ausência completa de dados prévios levaria a equacionar a possibilidade de um tão 
grande número de substâncias, que tornaria a sua identificação impossível, pelo 
menos em tempo útil. No entanto, é por vezes necessário efectuar um elevado 
número de análises para se tentar encontrar a identidade da substância em causa. 
Uma fonte principalmente eleita para efectuar essas análises, nomeadamente pela 
quantidade disponível, é a urina. 
Outro factor a ter em conta é o tempo que medeia a recolha da amostra e a sua 
análise efectiva. Devem estas amostras serem correctamente armazenadas, nas 
condições de conservação ideais e que não permitam ou provoquem qualquer 
alteração das substâncias. 
As amostras recolhidas, nomeadamente amostras de tecido, devem ser separadas em 
várias fracções, de acordo com o tipo de testes a efectuar e de modo a manter pelo 
menos uma fracção de reserva, para prevenir qualquer anomalia ou confirmação dos 
resultados. 
3.2. Identificação específica 
Após conhecer, de um modo mais ou menos seguro, a substância em causa, está-se 
em condições de recorrer a técnicas emanadas das diversas áreas científicas: química 
analítica, farmacodinamia, etc. 
A escolha do método terá de se basear nas características do próprio método 
(reprodutibilidade, proporcionalidade, etc.), da disponibilidade do laboratório que vai 
proceder à análise e do tempo que se dispõe para a obtenção dos resultados. 
Terá também de se ter em conta as características da própria substância, no que 
concerne ao seu comportamento farmacocinético. 
3.3. Análise de ácidos e bases corrosivos 
A identificação deste tipo de compostos vem muitas vezes dificultada pelo anterior 
uso de antídotos e pela sua instabilidade nos tecidos animais. Além disso, a 
 
 
concentração de alguns iões, tais como o sódio, o potássio, os cloretos e os sulfatos, é 
normalmente bastante elevada nas amostras biológicas. 
O ácido sulfúrico pode ser detectado pela acidez invulgar, bem como com ensaios 
específicos para o ião sulfato. Os ácidos nítricos e clorídricos podem ser 
concentrados por destilação. Os hidróxidos alcalinos e os carbonatos podem ser 
detectados por determinação do excesso de alcalinidade e pela presença de 
quantidades invulgares de sódio e potássio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BARBITÚRICOS 
1 - Introdução 
O diagnóstico desta intoxicação, quando não é evidente, pode ser feito graças às 
pesquisas toxicológicas no sangue e na urina. Embora os barbitúricos não circulem 
livremente no plasma, a sua concentração no sangue, pelo menos no início da 
intoxicação, é muito maior do que na urina, uma vez que a eliminação urinária é 
fraca no início da intoxicação; só depois da alcalinização do organismo é que a 
concentração aumenta. O líquido de lavagem gástrico pode ser usado se não tiverem 
passado mais de 1-2 horas entre a ingestão da droga e a recolha do líquido. 
A escolha dos vários métodos a usar depende essencialmente do equipamento 
existente no laboratório. A extracção pelo método de Griffon e Le Breton, tanto para 
o sangue como para a urina, seguida de identificação do barbitúrico em causa por 
cromatografia em camada fina (CCF) e a dosagem espectofotométrica de UV estão 
ao alcance de qualquer laboratório e são técnicas rápidas e precisas. 
 
1.1. Extracção e Purificação pelo Método de Griffon e Le Breton 
No almofariz, adicionar: 
1 - Amostra: 20 ml de urina 
2 - Ácido acético puro: V a X gotas (insolubiliza os barbitúricos e evita a 
passagem dos alcalóides para o solvente orgânico. Tem o inconveniente de 
favorecer a passagem dos ácidos gordos fisiológicos e sobretudo dos ácidos 
orgânicos medicamentosos cujos iões H+ poderão ulteriormente interferir na 
espectroscopia no UV) 
3 - Sulfato de sódio anidro: 35 g (promove a desidratação) 
Triturar lenta e progressivamente até obtenção de uma mistura pulverulenta. 
 
Preparar uma coluna de vidro introduzindo sucessivamente através 
 de um tubo de vidro : 
1 - Carvão vegetal activado pulverizado: 0,2 g 
 (adsorve as impurezas e não os barbitúricos) 
2 - Magnésia calcinada: 0,2 g 
 (neutraliza algum ácido) 
3 - Sulfato de sódio anidro: 2 g 
 (desidratante) 
 
 
 
4 - Mistura pulverulenta 
5 - Sulfato de sódio anidro: 2 g 
 (promove a desidratação, eliminando a fase aquosa 
 e as impurezas que ela contém) 
6 - Clorofórmio: o suficiente para impregnar toda a massa. 
7 - Extrair com 30 ml de clorofórmio (gota-a-gota) de modo a que o solvente fique 
sempre 2 cm acima da massa. 
Recolher o clorofórmio num matraz. 
Nota 
O clorofórmio é o solvente classicamente utilizado. O inconveniente que possui em 
formar emulsões muito estáveis em métodos de extracção por agitação é aqui 
anulado. Prefere-se ao éter (uma vez que este retém muita água) e ao diclorometano 
(porque é necessária uma grande quantidade). 
1.2. Identificação por TLC 
Após extrair a amostra pelo método de Griffon e Le Breton, evaporar o clorofórmio a 
pressão reduzida e retomar o resíduo em 0,5 ml de clorofórmio. Aplicar na placa 
(adsorvente: silica-gel com 0,25 mm de espessura) 3 manchas diferentes correspondentes a 
20, 100 e 200 µl da solução clorofórmica (as concentrações óptimas de barbitúricos 
para uma boa separação situam-se entre os 100 e os 200 mg). Ao lados das manchas 
que contêm o produto a identificar, colocar depósitos de 40 µl das soluções padrão 
(soluções de 5 mg de barbitúrico por ml de clorofórmio ou água no caso de não serem solúveis). 
Proceder ao desenvolvimento (eluente: clorofórmio 90 ml; acetona 10 ml) até o eluente ter 
migrado 15 cm. Marcar imediatamente a frente do solvente. 
Revelação - pulverizar as placas uniformemente com solução de sulfato de mercúrio 
(óxido amarelo de mercúrio 5 g, água destilada 100 ml, ácido sulfúrico concentrado 20 ml, quando 
todo o óxido de mercúrio estiver dissolvido, completar para 250 ml; este reagente mantém-se 15 dias). 
Os barbitúricos aparecem sob a forma de manchas brancas sobre um fundo cinzento 
claro. Uma segunda revelação, efectuada sobre o mesmo cromatograma, com solução 
de difenilcarbazona (dissolver 10 mg de difenilcarbazona em 100 ml de clorofórmio; mantém-se 
15 dias ao abrigo da luz), cora os barbitúricos de azul ou violeta. Marcar o contorno das 
manchas e determinar os valores de Rf a partir do centro da mancha observada. Fazer 
a identificação, por comparação com os valores de Rf dos padrões e com o tipo de 
mancha. 
 
 
1.3. Dosagem dos barbitúricos 
Fundamento 
A dosagem é efectuada pela medida de absorção diferencial a 260 nm para cada uma 
das duas formas ionizadas. 
A simples medida de intensidade de absorção a 260 nm num resíduo de extracção a 
pH 13 é proporcional ao teor em barbitúricos, mas tem um erro por excesso devido à 
presença de impurezas extraídas conjuntamente. Eliminam-se estas interferências 
operando por uma dupla medida a pH 10. 
Nestas condições a absorção devida aos barbitúricos não é a mesma, enquanto que a 
absorção de base dos extractos biológicos é idêntica. Elimina-se esta interferência 
fazendo a diferença entre os dois valores de pH. 
Técnica 
A extracção é feita pelo método de Griffon e Le Breton. 
Retoma-se o resíduo com 2 x 25 ml de clorofórmio e reúne-se o total numa ampola 
de decantação. 
Lava-se a fase orgânica com 2 x 5 ml de tampão fosfato pH 7,4 rejeitar de cada vez a 
fase aquosa superior. 
Juntar à solução clorofórmica contida na ampola, 5 ml de soda 0,45 N. Agita-se 
vigorosamente durante5 minutos e recolhe-se a fase aquosa (superior) para tubo de 
centrífuga de 20 ml. Repetir o processo de extracção por mais duas vezes. 
Centrifugar os 15 ml de solução sódica (indispensável para impedir a absorção de 
vestígios de emulsão do clorofórmio, que absorve no UV a 239 nm). 
Tomar 2 ml desta solução, juntar 2 ml de soda 0,45 N (2ª ionização a pH 13-14) e 
agitar. 
Medir a absorvância entre 230 e 270 nm contra um testemunho de soda 0,45 N. Este 
espectro deve apresentar um máximo a 252-255 nm e um mínimo 234-237 nm. 
Tomar mais 2 ml da solução centrifugada, adicionar 2 ml de ácido bórico 0,6 M (1ª 
ionização a pH 9,8-10,5) e agitar. 
Medir a absorvância entre 230 e 270 nm, contra um testemunho constituído por 2 ml 
de soda 0,45 N e 2 ml de ácido bórico 0,6 M. Este espectro deve apresentar um 
máximo a 238-240nm e não deve ter um mínimo entre 240 e 270 nm. 
Os dois espectros devem apresentar 2 pontos de intercepção a cerca de 230 e 250 nm. 
Estes 5 pontos atrás referidos são característicos dos diversos barbitúricos 
dissubstituídos. 
 
 
Padronização 
Fazer as seguintes diluições em tubo de ensaio: 
 
Sol. de Barbitúrico a 500 mg/l (ml) 2 1 0,8 0,4 0,2 0 
Sangue heparinado proveniente dum indivíduo que 
não recebeu qualquer terapêutica (ml) 
8 9 9,2 9,6 9,8 10 
Concentração de barbitúrico no sangue (mg/l) 100 50 40 20 10 0 
 
Medir a absorção diferencial a 260 nm, como para a dosagem partindo de 10 ml das 
diversas diluições. 
Traçar a curva padrão em - mg de barbitúrico / litro. 
Resultados 
As doses terapêuticas variam entre 1 e 10 mg de barbitúrico por litro de sangue. 
As doses tóxicas, variam com o tipo de barbitúrico (tanto maior quanto mais lenta for 
a sua acção) são geralmente 10 vezes a dose terapêutica. 
A eliminação urinária depende do pH. 
Valores inferiores a 50 mg/l podem, por alcalinização, ser aumentadas para 300 mg/l. 
 
 
 
Notas 
- As propriedades espectrais dos barbitúricos dependem dos 2 grupos NH, entre os 3 
grupos C=O. Os barbitúricos substituídos no azoto não possuem, logicamente, 2ª 
ionização. 
- A extracção em meio ácido impede a extracção de aminas, como a fenotiazina, mas 
faculta a extracção dos ácidos orgânicos, como o salicílico que possui um espectro de 
UV intenso entre 230 e 260 nm. Os ácidos são, no entanto, eliminados lavando a fase 
orgânica com tampão fosfato. 
 
 
ÁCIDO CIANÍDRICO E CIANETOS 
1 - O ácido cianídrico e cianetos 
O ácido cianídrico (ácido prússico) é, de entre todos os venenos, o mais rápido e 
mais violento devido ao efeito do ião cianeto, extremamente tóxico. Os cianetos são 
facilmente hidrolizáveis (formação de hidróxidos mais ou menos cáusticos) e 
facilmente decomponíveis pelos ácidos (mesmo pelos mais fracos como o 
carbónico). Assim, os cianetos conservam-se mal ao ar ocorrendo: 
a) libertação de HCN gasoso, 
b) alcalinização e carbonatação de onde vem a acção cáustica e a perda de 
toxicidade ao longo do tempo. 
Os cianetos mais importantes são os de potássio e de sódio (solúveis em água) e os 
de zinco, chumbo, cobre e prata (insolúveis), e o cianeto de mercúrio (muito tóxico). 
Os cianetos complexos são numerosos. O agrupamento CN- satura com uma grande 
afinidade as valências de coordenação dos metais com formação de complexos 
metálicos sendo assim dissimulado. Os complexos têm uma toxicidade relativamente 
baixa. 
2 - Introdução 
O odor cianídrico (amêndoas amargas) é facilmente notado em amostras que contêm 
estes compostos. No entanto, este odor pode desaparecer por hidrólise ou oxidação 
do ácido cianídrico em amostras expostas ao ar. Pode também não ser detectado, uma 
vez que uma em cada quatro pessoas devido a um defeito genético, não detecta o 
cheiro. Nestes casos, a amostra deve ser extraída com água destilada e o extracto 
verificado com papel de tornassol. Se a reacção for alcalina (positiva) deve ser 
confirmada com o teste do azul da Prússia. As amostras devem ser colocadas, pelo 
médico que realiza a autópsia, em frascos de vidro devidamente selados e enviadas 
ao laboratório sem demora. Se possível os exames devem fazer-se imediatamente, 
uma vez que as possibilidades de identificação diminuem com o tempo, devido à 
volatilidade do ácido cianídrico, à possibilidade de combinação com outros 
compostos e ainda à facilidade com que se hidroliza. 
Como as doses letais são mínimas, e o tempo que medeia entre a ingestão e a morte é 
curto, não é vulgar fazer análises em produtos excretados. Pelo contrário, é no 
estômago e na primeira parte do intestino que se encontra a maior parte do veneno 
após a morte. Além do estômago e duodeno, as análises podem ser feitas no sangue, 
nos órgãos ricos em sangue e, em casos de suspeita de intoxicação por inalação, nos 
 
 
pulmões. É frequente ainda fazer as análises em produtos alimentares suspeitos (o 
caso desta aula, em que se analisa uma farinha) que permite a identificação correcta e 
definitiva da substância em causa. 
3 - Ensaios prévios 
3.1. Pesquisa de ferricianetos alcalinos 
Fundamento 
Em meio ácido, o ferricianeto alcalino liberta o anião que, com o sulfato ferroso, 
origina o azul de Turnbull (ferricianeto ferroso), mais nítido em meio clorídrico. 
K3Fe(CN)6 ------> [Fe(CN)63- + 3K+ 
 Fe(CN)63- + Fe2+ ------> Fe3[Fe(CN)6]2 
 (Azul de Turnbull) 
Técnica 
 
1- Num tubo de ensaio adicionar um pouco de amostra líquida. 
2- Adicionar alguns cristais de sulfato ferroso, aquecer ligeiramente e juntar umas 
gotas de HCl. 
A formação de uma cor azul esverdeada traduz a presença de ferricianetos alcalinos 
3.2. Pesquisa de ferrocianetos alcalinos 
Fundamento 
Em meio ácido, o ferrocianeto alcalino liberta o anião que, com o cloreto férrico 
origina o azul da Prússia (ferrocianeto férrico), mais nítido em meio clorídrico. 
K4Fe(CN)6 ------> [Fe(CN)64- + 4 K+ 
Fe(CN)64- + Fe3+ -----> Fe4[Fe(CN)6]3 
 (Azul da Prússia) 
Técnica 
1- Num tubo de ensaio deitar um pouco de amostra líquida. 
2- Adicionar uns cristais de cloreto férrico, aquecer ligeiramente e juntar umas gotas 
de HCl. 
 
 
A formação de uma cor azul traduz a presença de ferrocianetos alcalinos. Por vezes 
forma-se uma cor esverdeada que resulta da mistura da cor azul do precipitado com 
a cor amarela da solução. Por filtração pode ver-se o precipitado azul. 
3.3. Pesquisa de cianeto de mercúrio 
Fundamento 
O cianeto de mercúrio é solúvel em água quente. Por acção do gás sulfídrico dá um 
precipitado branco de sulfureto de mercúrio que imediatamente passa a negro e que é 
insolúvel em ácido azótico e solúvel em água-régia. 
Hg(CN)2 + H2S -----> HgS + 2 HCN 
Técnica 
1- Tomar um pouco de amostra líquida para um tubo de ensaio e aquecer. 
2- Fazer borbulhar através da amostra uma corrente de gás sulfídrico. 
FeS + 2HCl -----> FeCl2 + H2S 
 
Se o cianeto de mercúrio estiver presente, forma-se um precipitado branco que 
enegrece rapidamente passando por amarelo. 
3- Confirmar a insolubilidade do precipitado em HNO3 e a solubilidade em água-
régia (HCl conc. + HNO3 conc. 1:1). 
Em amostras que contêm cianeto de mercúrio, o uso de gás sulfídrico permite libertar 
o HCN. 
 
4 - Destilação (Isolamento do ácido cianídrico) 
4.1. Notas 
Para a determinação qualitativa e quantitativa do ácido cianídrico e cianetos tem 
de se proceder ao seu isolamento, por destilação simples. Esta destilação, que se 
deve efectuar logo que se receba a amostra, pode ter três causas de erro que, no 
entanto, podem ser eliminadas. 
 
 
1- Se existirem ferri ou ferrocianetos alcalinos, estes, por acção do ácidotartárico, 
libertam HCN que é recolhido no destilado. Como estes compostos são pouco ou 
nada tóxicos, o resultado viria assim alterado por excesso. 
2- Se a amostra possuir cianeto de mercúrio, que é duplamente tóxico (cianeto e 
mercúrio), mas como não se decompõe pelo ácido tartárico, somos levados a 
concluir que o produto não é tóxico. 
3- Pelos motivos apresentados, é muito importante fazer as análises de pesquisa atrás 
referidas. 
Se a amostra tiver ferro ou ferricianetos, e para os fixar segundo as reacções atrás 
descritas, deve juntar-se respectivamente sal férrico ou ferroso antes da destilação. 
Se a amostra tiver cianeto de mercúrio, adicionar alguns mililitros de água 
sulfídrica recentemente preparada. O cianeto decompor-se-á totalmente e passa 
para o destilado sob a forma de ácido cianídrico 
4- Por vezes os ensaios prévios são positivos e os resultados dos testes no destilado 
são negativos. Pode-se admitir a hipótese de ter havido uma grande diluição. 
Deve-se fazer nova destilação (a partir do destilado inicial) num aparelho 
rectificador. 
 
4.2. Destilação 
Fundamento 
O ácido cianídrico, em solução ácida, é arrastado pelo vapor de água. O ácido 
tartárico que tem por fim acidificar o meio, usa-se por ser um ácido fixo não 
passando para o destilado. Além disso, ao contrário de outros ácidos minerais fortes, 
não decompõe os tóxicos. 
Técnica 
1- Tomar um pouco de amostra (4 g) para um balão, adicionar água destilada, 
suficiente para evitar ebulição tumultuosa e carbonização da amostra (±200ml) e 
ácido tartárico a 5%, suficiente para acidular. 
2- Fazer a destilação, recolhendo o destilado num balão, onde se coloca previamente 
água destilada e onde se mergulha o tubo de recolha, de modo a evitar que se percam 
as primeiras porções de HCN. Destilar cerca de metade do volume. 
3- Com a água de lavagem do condensador e da alonga, completar o volume de 200 
ml e proceder aos ensaios qualitativos e de dosagem. 
 
 
Para evitar qualquer perda de HCN, o destilado deve ser recolhido em banho de gelo 
ou mesmo em NaOH 10%. 
5 - Ensaios de pesquisa do ácido cianídrico e cianetos no destilado 
5.1. Reacção do azul da Prússia 
Fundamento 
Em presença de hidróxido de potássio o ácido cianídrico transforma-se em cianeto de 
potássio. O cianeto formado, reagindo com o sulfato ferroso dá origem ao 
ferrocianeto de potássio e este, por acção do cloreto férrico, origina o azul da Prússia. 
HCN + KOH --------> KCN + H2O 
 6 CN- + Fe2+ -------> Fe(CN)64- 
 4 K4Fe(CN)6 + 4 Fe3+ --------> Fe4[Fe(CN)6]3 
 (Azul da Prússia) 
 
Como se junta ao destilado um excesso de KOH, os sais de ferro precipitam sob a 
forma de óxidos de ferro de cor esverdeada o que dificulta a observação do azul da 
Prússia. Para facilitar a observação, adiciona-se ácido clorídrico, que dissolve os 
óxidos. No entanto, a adição de muito ácido pode levar a que a solução fique 
amarela. 
Técnica 
1 - Ao destilado, juntar solução de KOH 50% em excesso para tornar a solução 
alcalina. 
2 - Juntar 0,5 ml de solução recente de sulfato ferroso a 10% e 0,5 ml de solução de 
cloreto férrico a 10%. Agitar e aquecer suavemente. Arrefecer. 
3 - Juntar HCl conc. gota-a-gota até dissolver o pp. castanho que se forma. 
Se estiver presente HCN formar-se-á um precipitado de azul da Prússia. 
Se o HCN estiver muito diluído, a cor azul apenas se observa ao fim de 1-2 horas. 
 
 
 
 
5.2. Reacção do azul da Prússia modificada por Cheele 
Fundamento 
Análogo ao ensaio anterior, mas a sensibilidade é muito aumentada por controlo dos 
valores de pH. A alcalinidade em vez de ser conferida pelo KOH, é dada pelo 
carbonato de sódio, evitando assim a formação de óxidos de ferro. 
Técnica 
1 - Ao destilado, juntar I gota de solução alcoólica de fenolfetaleína a 1% (Incolor 
em solução ácida e rosa em solução alcalina). 
2 - Juntar ácido sulfúrico a 5% até que o líquido fique incolor. 
3 - Alcalinizar a solução por adição dum excesso de carbonato de sódio a 10%, até 
que a cor vire de novo para rosa. 
4 - Juntar III a IV gotas de solução recente de sulfato ferroso a 10%, misturar bem e 
deixar em repouso durante alguns minutos. Juntar I-II gotas de cloreto férrico a 10%. 
5 - Misturar e acidificar com HCl conc. Até tornar a solução límpida (dissolve alguns 
óxidos formados). 
A cor azul, em caso de soluções diluídas pode demorar um pouco a aparecer. 
A sensibilidade pode ser aumentada adicionando I gota de cloreto de bário a 10%. O 
cloreto de bário separa-se imediatamente e adsorve o azul da Prússia que, depois de 
alguns minutos, aparece no fundo do tubo sob a forma dum precipitado branco 
azulado. 
5.3. Teste com acetato de cobre-acetato de benzidina 
 
Fundamento 
Os sais de cobre reagem com a benzidina, em presença de cianetos e halogenetos, 
para dar azul de benzidina. 
A reacção tem lugar porque o potencial de oxidação dos iões de cobre II aumenta 
quando os iões de cobre I resultantes são gastos na formação do cianeto cuproso 
insolúvel. 
Consequentemente, fazendo actuar o ácido cianídrico sobre uma solução de acetato 
de cobre - acetato de benzidina, há desenvolvimento instantâneo de cor azul. 
 
 
 
Técnica 
1- Misturar I gota de solução em ensaio com I gota de reagente (sol. de acetato de cobre/ 
acetato de benzidina) numa placa de reacção. 
Há formação instantânea de cor azul. 
5.4. Teste com iodo 
Fundamento 
O ácido cianídrico combina-se com o iodo para formar o iodeto de cianogénio, 
incolor: 
HCN + I2 --------> HI + CNI 
Consequentemente, quando o ácido se liberta dos cianetos e actua sobre o papel de 
amido iodetado, azul, a cor desaparece. 
 
Técnica 
1- Deitar I gota de solução em ensaio numa tira de papel de amido iodetado (mergulhar 
as tiras de papel de amido numa solução de iodo N/100). 
A cor azul do papel desaparece. 
6 - Dosagem do ácido cianídrico no destilado 
6.1. Método ciano-argentimétrico de Denigés 
Fundamento 
Ao juntar AgNO3 a uma solução aquosa de cianeto, forma-se quantitativamente o 
complexo argentociânico: 
2 CN- + Ag+ --------> Ag(CN)2- 
que é solúvel em amónia com formação de argentocianato de amónio. 
2 CN- + NH4+ + Ag+ -------> Ag(CN)2NH4 
Por sua vez, o iodeto de prata precipita em meio amoniacal. O ponto termo é então 
dado pela turvação devida à formação duma nuvem opalescente branco azulada de 
iodeto de prata: 
 
 
AgNO3 + KI --------> AgI + KNO3 
Técnica 
1 - Tomar 25 ml de destilado para o balão Erlenmeyer. 
2 - Juntar 2 ml de amónia conc. e 1 ml de sol. de iodeto de potássio a 10%. 
3 - Titular com solução de nitrato de prata N/200, até aparecimento duma turvação 
permanente. 
Para se obterem bons resultados, a solução titulante deve ser adicionada 
cuidadosamente próximo do ponto termo. Este é mais evidente quando a titulação é 
realizada na semi-obscuridade fazendo-se passar um feixe de luz horizontalmente 
através da solução, ou, mais simplesmente, realizando a titulação sobre fundo escuro. 
 
Cálculos: 
1000 ml AgNO3 N --------------- 2 x 27 = 54 g HCN 
1 ml AgNO3 N/200 -------------- 0,00027 g HCN 
n ml AgNO3 N/200 -------------- n x 0,00027 g HCN 
n x 0,00027 g HCN ----------------- 25 ml 
X g HCN -------------------------- 200 ml 
 
Partimos de 4 g de farinha para a destilação e recolhemos 200ml de destilado. 
Os resultados devem vir em g de HCN / 100 g de produto. 
Nota: As farinhas não devem libertar mais do que 0,01g de HCN por 100g de 
farinha. 
6.2. Método de Aldridge 
FundamentoÉ um método de dosagem do ácido cianídrico muito sensível, que se baseia na 
reacção de Koenig, e aplicável a material biológico (urina, saliva, sangue, plasma ou 
soro). 
O cianeto é convertido a brometo de cianogénio pela água de bromo. 
A piridina, em meio alcalino, forma com o brometo de cianogénio um sal de 
piridínio. A adição a este derivado duma amina aromática primária abre o ciclo 
 
 
piridínico entre o azoto e o carbono D com formação dum derivado do aldeído 
glutacónico intensamente corado. 
As reacções que se seguem traduzem o fundamento: 
 
 
 
 
 
 
 
A natureza e a sensibilidade da cor estão na dependência da amina aromática posta 
em jogo, sendo a amina mais prática a benzidina que permite a obtenção duma cor 
alaranjada. 
 
 
 
 
 
 
 
Técnica 
 
1- A 6ml do destilado (ou duma diluição na soda 0,1N), juntar sucessivamente: 
- 0,5 ml de ácido acético conc. 
-2 ml de água de bromo saturada (preparada recentemente) 
2- Deixar em banho-maria gelado durante 10 minutos 
3- Juntar, agitando: 
- 2,5 ml de solução de arsenito de sódio (3g de meta-arsenito de sódio em 100ml de 
NaOH N/5) 
- 4 ml de solução de piridina-benzidina [18ml de piridina em 12ml de água destilada, 
3ml de ácido clorídrico conc., 10ml de sol. de benzidina (0,560g de cloridrato de benzidina em 
50ml de HCl N/2)] 
- 5 ml de etanol a 95º 
 
4- Deixar desenvolver a cor durante 30 minutos na obscuridade e ler a sua 
intensidade de cor no espectrofotómetro a O 510 nm, em relação a um testemunho 
preparado nas mesmas condições. 
5- Comparar os resultados obtidos com uma curva de calibração previamente 
traçada. 
6-.Este método é muito sensível e a curva de calibração é realizada com quantidades 
de ácido cianídrico entre 0 e 6Pg (para a preparação da curva-padrão, partir de uma solução 
contendo 1Pg HCN / 1ml de água). 
 
Nota 
Na ausência de tiocianatos (que reagem de modo semelhante) pode o processo 
realizar-se na urina e saliva sem tratamento preliminar, ou no sangue, plasma e soro 
depois de desproteinizado pelo ácido tricloroacético (1ml de sangue é tratado com 2ml de 
ácido tricloroacético a 5%). Uma vez que o ácido tiociânico não é volátil é mais seguro 
separar o ácido cianídrico por destilação. 
 
 
ÁLCOOL METÍLICO 
1 - Introdução 
A pesquisa toxicológica do álcool metílico pode efectuar-se no sangue, tecidos 
(essencialmente fígado e intestinos), conteúdo estomacal, vinhos, aguardentes e 
outros líquidos suspeitos, ar, etc. 
A amostra a analisar é acidulada com ácido tartárico e água destilada para a tornar 
fluida, destilando-se em seguida. 
 
2 - Ensaios de pesquisa 
2.1. Técnica de Denigés 
Fundamento 
O álcool metílico reduz muito rapidamente a solução de permanganato de potássio a 
1:1000 em meio ácido, oxidando-se a aldeído fórmico (o álcool etílico oxida-se 
muito lentamente): 
2 (MnO4- + 8 H+ + 5 e- --------> Mn2+ + 4 H2O) 
5 (CH3OH --------> HCHO + 2 H+ + 2 e-) 
 . 
2 MnO4- + 16 H+ + 5 CH3OH --------> 2 Mn2+ + 8 H2O + 5 HCHO + 10 H+ 
O aldeído fórmico produzido é caracterizado pelo reagente de Schiff (fucsina 
bissulfitada) ao qual restitui a cor violeta. O excesso de MnO4- que fica na solução é 
reduzido pelo ácido oxálico em meio sulfúrico: 
 
2 (MnO4- + 8 H+ + 5 e- ----------> Mn2+ + 4 H2O ) 
5 (C2O42- ----------> 2 CO2 + 2 e- ) 
 . 
2 MnO4- + 5 C2O42- + 16 H+ ----------> 2 Mn2+ + 10 CO2 + 8 H2O 
 
 
 
 
Técnica 
1- Num tubo de ensaio deitar 2,5 ml do destilado e adicionar 0,5 ml da mistura 
oxidante (KMnO4 3g; H3PO4 85% 15 ml; água destilada qbp 100 ml). 
2- Após 10 minutos à temperatura ambiente, descorar com 1,5 ml de solução de 
ácido oxálico a 5% em ácido sulfúrico a 50%. 
3- Juntar 2,5 ml de reagente de Schiff (fucsina básica 0,2 g em 120 ml de água destilada 
quente; arrefecer e juntar sulfito de sódio anidro 2 g dissolvido em 20 ml de água destilada; por fim 2 
ml de HCl concentrado) e esperar 10 minutos. A formação da cor violeta dentro de 10 
minutos indica a presença de álcool metílico. 
 
Notas e causas de erro: 
Deve tratar-se uma amostra do destilado com reagente de Schiff sem prévia 
oxidação, para excluir a presença de aldeído fórmico no original. 
Devem fazer-se outros testes do aldeído fórmico para confirmação. 
Quando o teste é realizado num destilado dum cérebro fresco, uma reacção positiva 
pode ser interpretada com segurança como sendo uma reacção positiva ao metanol. 
A reacção é positiva para qualquer aldeído mas só é durável para o aldeído fórmico. 
A existência de álcool etílico reduz a sensibilidade da técnica de Denigés e o líquido 
submetido a este método não deve conter mais de 5% de álcool etílico. Se contiver 
uma quantidade excessiva de álcool etílico, deve diluir-se a solução, ou trabalhar 
com testemunhos constituídos por misturas tituladas de álcool etílico e metílico. 
 
3 - Dosagem 
3.1. Método colorimétrico 
Fundamento 
O álcool em presença da solução de permanganato de potássio em meio ácido, sofre 
uma oxidação a aldeído fórmico. 
O bissulfito de sódio tem uma acção análoga à indicada para o ácido oxálico na 
pesquisa. 
O ácido cromotrópico em solução ácida concentrada liga-se ao aldeído originando 
um composto de cor púrpura, com uma absorção óptima no comprimento de onda de 
O 570 nm. O ácido é estável em meio sulfúrico. 
 
 
 
Técnica 
Oxidação a formaldeído 
1- Em balão aferido de 10 ml mergulhado em banho de gelo, introduzir 
sucessivamente 2 ml de destilado, 0,5 ml de ácido fosfórico a 85% e 0,05 ml de 
solução aquosa de KMnO4 a 5%. 
2- Deixar no banho de gelo durante 5 minutos, agitando ocasionalmente. 
3- Descorar por adição de quantidade suficiente de solução saturada de bissulfito de 
sódio (HSO3Na) evitando qualquer excesso de reagente, o que poderia provocar uma 
opalescência ou um enfraquecimento da cor. 
Dosagem espectrofotométrica do aldeído fórmico 
4- Juntar por pequenas porções de 1 ml, arrefecendo depois de cada adição, 5 ml de 
reagente cromotrópico (ácido cromotrópico 5g/100ml em água destilada. Na altura do emprego, 
diluir 4 ml desta solução com ácido sulfúrico 15 M, ou seja a 80% em volume até perfazer 100 ml). 
5- Levar a banho-maria fervente durante 30 minutos. 
Desenvolve-se uma cor violeta estável durante várias horas e cuja intensidade é 
proporcional à concentração de aldeído fórmico. 
6- Arrefecer sob uma corrente de água. 
7- Completar os 10 ml com uma solução de H2SO4 9M (ou seja a 48% em volume) e 
determinar a sua intensidade de cor no espectrofotómetro a O 570 nm. 
Nota 
Para a curva de calibração usar metanol puro isento de acetona, purificado por 
destilação sobre óxido de cálcio, rejeitar o primeiro 1/3 do destilado recolhendo as 
fracções de 64,5 - 65 °C. 
Interpretação dos resultados 
A dose tóxica varia com a susceptibilidade individual, mas devem considerar-se 
extremamente perigosos para a vida, níveis superiores a 80 mg / 100 ml de sangue. 
Valores superiores a 2,5 mg /100 ml já revelam metilismo. 
 
 
Vantagens e causas de erro 
Esta técnica é específica do metanol em presença dos seus homólogos superiores. É 
perfeitamente aplicável à dosagem de pequenas quantidades de metanol em presença 
de quantidades relativamente elevadas de álcool etílico. 
Se já existir aldeído fórmico no líquido a pesquisar comete-se um erro por excesso 
(causamuito rara). Pode, no entanto, entrar-se com esse valor no cálculo final, pelo 
que é conveniente pesquisar o aldeído fórmico pré-existente (a omissão do passo da 
oxidação torna o método aplicável ao formaldeído). Se houver uma oxidação 
enérgica o álcool metílico passa a ácido fórmico, o que originaria um erro por 
defeito. 
 
 
FLÚOR 
1 - Pesquisa de flúor e fluoretos na água 
 
1.1. Com o reagente de BOER 
Fundamento 
Ao fazer a junção, em volumes iguais, das soluções A (sol. aquosa de vermelho de 
alizarina S [sulfo-alizarinato de sódio] a 0,17 %) e B (sol. aquosa de cloreto de zircónio a 0,81 % 
[ou oxicloreto de zircónio a 0,9315 %]), que constituem o reagente de Böer, forma-se uma 
laca vermelho-violeta (complexo de alizarina-zircónio) cuja formação envolve a 
ligação, por adsorção química, da alizarina à superfície das partículas do sal de 
zircónio. 
Acontece que o flúor e os fluoretos em solução ácida têm mais afinidade para o 
zircónio do que a alizarina pelo que a deslocam da laca, formando com o zircónio o 
anião complexo fluorado, incolor (ZrF6)2-. 
A alizarina livre, em meio ácido, tem cor amarela, e assim, a observação desta cor na 
solução indica a presença de flúor ou fluoretos. 
Técnica 
1- Misturar num tubo de ensaio, alguns mililitros de água em análise com HCl 
concentrado. 
2- Adicionar II a III gotas de reagente de Böer. 
3- A formação de uma coloração amarela, indica a presença de flúor ou fluoretos. 
Nota 
Estas reacções podem efectuar-se em papel: 
a) Impregnar uma tira de papel de filtro com solução de alizarina-zircónio. Secar. 
b) Colocar no papel uma gota de ácido acético a 5% e uma gota da água em 
análise. 
c) A cor vira para amarelo se existirem fluoretos. Se a quantidade de fluoretos for 
muito pequena, 
 recomenda-se activar a reacção, aquecendo o papel no vapor de água. 
 
 
 
1.2. Reacção com a sílica 
Fundamento 
A evaporação à secura, da água em análise, tem por fim concentrar o flúor. 
O sulfato de prata que se junta ao resíduo elimina possíveis cloretos existentes na 
água que precipitam sob a forma de AgCl. 
O vidro, que é constituído por sílica, e o flúor originam fluoreto de silício (SiF4), 
volátil que vai atingir a gota de acetato de bário colocada no vidro de relógio. 
O fluoreto de silício, em contacto com a solução aquosa de bário, dá origem a ácido 
fluossilícico e a um precipitado de hidróxido de silício que se dispõe em anel à volta 
da gota. 
3 SiF4 + 4 H2O ----------> Si(OH)4 + 2 H2SiF6. 
Por sua vez, o ácido fluossilícico reage com o acetato de bário, originando cristais 
incolores de fluossilicato de bário, que podem observar-se ao microscópio. 
2 CH3COO- + Ba2+ + H2SiF6 ----------> BaSiF6 + 2 CH3COOH. 
Técnica 
1- Em cadinho de porcelana deitar 10-20 ml de água em análise e evaporar à secura 
em bico de Bunsen. 
2- Juntar ao resíduo um cristal de sulfato de prata e algum vidro pulverizado. 
Misturar. 
3- Adicionar um pouco de HCl concentrado. 
4- Tapar com vidro de relógio, no qual se coloca previamente pela parte inferior, I 
gota de solução de acetato de bário 10%. 
5- A presença de flúor ou fluoretos revela-se por um anel de sílica e na parte central, 
cristais incolores de fluossilicato de bário visíveis ao microscópio. 
 
 
 
2 - Dosagem de flúor e fluoretos na água 
2.1. Método Espectrofotométrico 
Fundamento 
Formação do complexo flúor-zircónio e libertação de alizarina, como já foi descrito 
no método de pesquisa com o reagente de Böer. 
Técnica 
1- Numa série de 6 tubos de ensaio proceder de acordo com a tabela seguinte. 
2- A solução mãe de NaF deve conter 0,1 mg flúor / ml, (dissolver 0,221 g de fluoreto de 
sódio em água e completar o volume para um litro). 
 
 
 
 Solução Mãe Água em análise HCl conc. Reag. de BOER Água destilada 
Tubo 1 2ml 1ml 1ml 11ml 
Tubo 2 4ml 1ml 1ml 9ml 
Tubo 3 6ml 1ml 1ml 7ml 
Tubo 4 8ml 1ml 1ml 5ml 
Tubo 5 10ml 1ml 1ml 3ml 
Tubo 6 10ml 1ml 1ml 3ml 
 
 
3- Agitar bem os tubos. Esperar 5 minutos e ler no espectrofotómetro U:V., 
Spectronic 20, a O 525nm. 
Referir os resultados em mg de flúor por litro de água 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TESTE DE REINSCH 
Permite a detecção de uma forma rápida e fácil, ainda que não definitiva, de certos 
metais, como o arsénio, mercúrio, bismuto e antimónio (As, Hg, Bi, Sb), por 
deposição do metal à superfície de uma espiral de cobre, em soluções fortemente 
ácidas. A grande vantagem é de que os metais podem assim ser separados dos fluidos 
e dos tecidos sem prévia destruição da matéria orgânica. 
Nota 
a) - As espirais de cobre devem estar limpas e brilhantes (limpar com HCl ou HNO3 
diluído 1:1). 
b) - Este teste também pode aplicar-se a órgãos finamente divididos, tais como o 
fígado, rim, etc., sem prévia destruição da matéria orgânica. 
c) - A deposição de bismuto é um pouco mais demorada. 
d) - O As e o Hg podem encontrar-se por muitos dias na urina. Em exposições 
crónicas, é possível encontrá-los várias semanas depois. 
e) - Se o fio de cobre permanecer inalterado, pode concluir-se da ausência de As, Sb, 
Hg e Bi ou da sua presença em pequena quantidade. 
f) - O aspecto do fio de cobre não pode aceitar-se como definitivo, mas tão só como 
ponto de partida para métodos de confirmação específicos. 
Técnica 
1 - Num Erlenmeyer (ou num tubo de ensaio) contendo 20 ml de urina (ou conteúdo 
gástrico, alimento, etc.), juntar 3 ml de HCl conc. (fazer paralelamente um ensaio em 
branco com urina normal). 
2 - Introduzir uma pequena espiral de cobre bem limpa e brilhante. 
3 - Colocar em banho-maria fervente, durante cerca de uma hora. Evitar que entre em 
ebulição para prevenir a evaporação. Se necessário, o volume pode ser mantido com 
HCl 10%. 
4 - Interpretação dos resultados. 
Metal Aspecto do fio de cobre Sensibilidade do 
teste (aprox.) 
Sensibilidade 
Arsénio Preto 0,010 mg % 0,5 µg/ml 
Mercúrio Prateado-brilhante 0,075 mg % 2,5 µg/ml 
Bismuto Preto-acinzentado 0,030 mg % 1,0 µg/ml 
Antimónio Preto-púrpura brilhante 0,030 mg % 1,0 µg/ml 
Os resultados serão referidos como presença fraca, moderada, intensa ou negativo. 
 
 
Confirmação dos resultados: 
a) Mercúrio (prateado brilhante) 
Teste de Gettler: - Num vidro de relógio colocar uma rodela de papel de filtro, 
depositar II gotas de iodeto cuproso e deixar a espiral de cobre com o depósito sobre 
a mancha esperando entre 1 a 12 horas. Forma-se o iodeto mercúrico cuproso de cor 
salmão. 
2 Cu2I2 + Hg2+ ----------> Cu2(HgI4) + Cu22+ 
b) Arsénio (preto) 
Num tubo de ensaio colocar a espiral de cobre escurecida e X a XV gotas de KCN 
10%. O depósito escuro dissolve-se após alguns minutos se o arsénio estiver 
presente. 
Esta solução cianídrica contém também (se estiverem presentes na amostra) selénio e 
telúrio. 
O depósito de Hg, Bi e Sb não se dissolve. 
 O teste de Gutzeit, praticado na solução depois de acidificada com ácido sulfúrico 
10%, confirmará a presença de As. 
c) Bismuto (preto acinzentado) 
Coloque a espiral de cobre com o depósito preto num tubo de ensaio, II gotas de 
solução de NaHSO3 10% , X gotas de HNO3 15%. O depósito negro dissolve-se 
após 5 minutos se o bismuto estiver presente. 
Os depósitos de Sb ou As não se dissolvem. 
Retire a espiral adicione 1ml de reagente quinina - KI e agite. 
Um precipitado laranja mais ou menos intenso indica a presença do bismuto. 
A reacção é específica para o bismuto. 
d) Antimónio (Preto-púrpura brilhante) 
Completamente diferente de a) e não reactivo a b) e c). 
 
 
 
ARSÉNIO 
O arsénio pode existir normalmente no solo e nosalimentos. Os seus derivados 
existem na indústria, nas artes e na fitofarmácia. 
As intoxicações agudas podem ser causadas pela utilização de arsénio com fins 
criminosos, da tentativa de suicídio e de acidentes diversos: alimentos (vinhos 
arsenicais, cervejas e alimentos inquinados); origem terapêutica e outras 
(conservação de peles e animais embalsamados, luta contra parasitas agrícolas e 
calcinação industrial de minérios arseníferos). 
Na pesquisa e no doseamento de arsénio nos meios biológicos, podem existir erros 
por defeito (volatilização) e por excesso devido à introdução de As pelos reagentes e 
pela presença de antimónio (dá testes positivos). Na interpretação dos resultados das 
análises deve considerar-se o arsénio normal, o arsénio impureza de substâncias 
alimentares, o arsénio medicamentoso e o arsénio no solo. 
 
1 - Pesquisa de arsénio na urina 
1.1. Teste de BETTENDORF 
Fundamento 
Os compostos de arsénio trivalentes e pentavalentes são reduzidos a arsénio 
elementar pelas soluções de cloreto estanhoso fortemente acidificadas com ácido 
clorídrico. 
O arsénio separa-se sob a forma dum precipitado preto-acastanhado. 
2 As5+ + 5 Sn2+ ----------> 2 As + 5 Sn4+ 
2 As3+ + 3 Sn2+ ----------> 2 As + 3 Sn4+ 
A redução é acelerada pelo aquecimento. Só ocorre em solução fortemente ácida uma 
vez que apenas os catiões de arsénio reagem com o cloreto estanhoso. 
Em soluções fracamente ácidas os catiões não estão presentes devido à reacção de 
hidrólise: 
As3+ + 3 H2O ----------> AsO33- + 6 H+ 
 
 
O tratamento com cloreto de magnésio em meio alcalino (amónia concentrada) 
transforma o arsénio em Mg2As2O7 (piro-arsenato de magnésio), resistente ao calor, 
pelo que pode então preceder-se a um aquecimento intenso para nos libertarmos dos 
sais de mercúrio, voláteis, não interferindo na reacção (nas condições do ensaio eles 
também se reduzem ao estado metálico). O teste de Bettendorf é bastante específico 
para o arsénio. 
Técnica 
1 - Misturar num pequeno cadinho de porcelana 1ml de solução em ensaio com I-II 
gotas de amónia concentrada, I gota de peróxido de hidrogénio a 10% e I gota de 
solução de cloreto de magnésio a 10%. 
2 - Evaporar a mistura lentamente e depois aquecer fortemente. 
3 - Misturar o resíduo com I-II gotas de solução concentrada de cloreto estanhoso em 
ácido clorídrico conc. e aquecer suavemente. 
 A formação de um precipitado ou de uma coloração preto-acastanhado indica a 
presença de arsénio. 
1.2. Teste de GUTZEIT 
Fundamento 
Por reacção de ácido sulfúrico diluído sobre o zinco, há libertação de hidrogénio 
nascente que, actuando sobre o AsO43- (composto oxigenado de arsénio), ou sobre o 
arsénio noutros estados de oxidação, o reduz a arsina, que se desprende com o 
excesso de hidrogénio: 
As O5 + 16 H+ ----------> As H3 + 5 H2O 
H3AsO4 + 4 H2 ----------> AsH3 + 4 H2O 
A arsina, em contacto com nitrato de prata, dá um composto de substituição de cor 
amarela que, em contacto com a água, se torna imediatamente negra por formação de 
prata metálica: 
AsH3 +6 AgNO3 ----------> (Ag3As) (AgNO3)3 + 3 HNO3 
(Ag3As). (AgNO3)3 + 2 H2O ----------> HAsO2 + 3 HNO3 + 6 Ag 
 
 
Técnica 
1 - Num matraz de 100 ml deitar 3ml de solução em ensaio. Misturar com alguns 
grãos de zinco e ácido sulfúrico diluído. (Praticar paralelamente um ensaio em 
branco só com os reagentes). 
2 - Colocar um tampão de algodão no colo do matraz e suspender uma tira de papel 
de filtro embebida em solução de nitrato de prata a 20%. 
Na presença de arsénio, forma-se uma mancha negra. 
2 - Dosagem do arsénio em material biológico 
2.1. Método de GUTZEIT 
- Aparelho de Gutzeit 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fundamento 
O princípio em que se baseia esta técnica, é o da reacção da arsina proveniente dos 
compostos oxigenados do arsénio com molibdato de amónio em condições 
convenientes, e posteriormente reduzido pelo sulfato de hidrazina, com formação 
dum complexo de molibdénio, fortemente corado de azul. 
 
Lã de vidro 
Balão de 
Digestão e 
Gerador 
Cilindro de 
dispersão com 
vidro poroso 
 
 
 
Técnica 
A) DIGESTÃO - mineralização 
O balão do aparelho de Gutzeit pode servir como balão de digestão 
1 - Colocar 5-10 ml de sangue, 25 ml de urina ou 5-10 g de tecido, no balão. 
2 - Juntar 10 ml de ácido nítrico concentrado, 4 ml de ácido sulfúrico concentrado e 5 
ml de ácido perclórico 60-70%. 
3 - Colocar a mistura da digestão em banho de vapor por várias horas até que se torne 
homogénea, transferir para uma placa de aquecimento e aquecer um pouco mais 
fortemente até que se libertem fumos de ácido perclórico (destruição da matéria 
orgânica). 
 4 - Se a mistura começar a ficar castanha, retire-a da placa de aquecimento, arrefeça-
a e junte 5-10 ml de ácido nítrico e 1-2 ml de ácido perclórico. Continuar a aquecer 
até que a mistura fique clara e então aquecer fortemente até à libertação de fumos de 
SO3. Arrefecer. 
5 - Juntar 20 ml de água e 0,1 g de NaHSO3. 
6 - Aquecer no banho de vapor por 10 minutos e transferir depois a mistura para a 
placa quente aquecendo uma vez mais até libertação de fumos de SO3. A mistura, se 
estiver clara e transparente, está pronta para a libertação de arsina depois de 
arrefecida. 
B) DESTILAÇÃO E DOSAGEM DO ARSÉNIO 
Método colorimétrico 
1 - Adicionar 1 ml de solução de SnCl2 40%, e 40 ml de água 
2 - Juntar 2 ml de KI a 15% à mistura, deixar ficar 15 minutos antes de introduzir 5 g 
de grenalha de zinco activado com Cu SO4 e adaptar o cilindro de dispersão do gás. 
3 - Deixar borbulhar a arsina libertada por 1 hora através de 5 ml de solução de iodo 
0,001 N num tubo de ensaio introduzido em banho de gelo. 
4 - Ao fim de 1 hora retirar o tubo com a mistura de iodo. 
5 - Juntar 0,5 ml de solução de molibdato de amónio (a 1% em H2SO4 5N) e 0,2 ml de 
solução de sulfato de hidrazina a15%. Misturar bem depois de cada adição 
 
 
 
6 - Colocar a mistura num banho de água fervente por 10 minutos, arrefecer e ler a 
cor azul a 865 nm contra um branco de água. A cor azul é estável por 24 horas. A 
quantidade de arsénio na amostra é determinada a partir duma curva previamente 
calibrada de arsénio, preparada do mesmo modo. 
Interpretação dos resultados 
Concentrações aproximadas de Arsénio nos tecidos, expressas em mg/100 g, 
segundo vários autores 
 Fígado Rim Sangue Cérebro Urina Cabelo 
Adulto saudável 
normal 
0,001- 0,01 0,001- 0,01 0 - 0,0030 0,001 0,020-0,067 
Tratado com arsenicais 
inorgânicos 
-- -- 0,01 -0,025 -- 0,030 -- 
Tratado com arsenicais 
orgânicos 
0,1 0,02 0,1 -- -- -- 
Envenenamento arsenical 
agudo 
1 - 50 0,5 - 15 0,1 - 1,5 0,05 - 2,0 0,008 - 0,5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA 
1 – Generalidades 
 
2 - Análise 
2 1- Análise Qualitativa 
 
A identificação de uma amostra por cromatografia GL ou HPLC baseia-se no facto 
de, sob idênticas condições de trabalho, os valores de retenção de uma dada 
substância manterem-se constantes. 
O tempo de retenção de cada um dos componentes, ou seja, o tempo que decorre 
desde a injecção da amostra e a saída da concentração máxima do composto, é uma 
constante física para determinado componente em condições bem definidas. Este 
tempo, que depende exclusivamente do coeficiente de partilha entre a fase móvel e a 
fase estacionária, pode ser modificado por alteração de certos parâmetros consoante 
o tipo de cromatografia GL ou HPLC. 
Para que a identificação possa ser possível, os padrões devem ser analisados nas 
mesmas condições da amostra. Deve, no entanto, notar-se que uma simplesanálise 
de cromatografia não identifica completamente uma determinada amostra, uma vez 
que existe uma possibilidade real de substâncias diferentes apresentarem 
comportamento cromatográfico idêntico para um dado sistema, sobretudo quando a 
origem e composição da amostra são desconhecidas. Informação mais positiva é 
obtida pela repetição da análise (amostra e padrão), em outra coluna de polaridade 
diferente da primeira, (ou fazendo variar qualquer outro parâmetro que influencie o 
tempo de retenção), uma vez que é bem mais raro o fenómeno de duas substâncias se 
comportarem identicamente em condições diferentes. Porém a identificação 
definitiva e inequívoca de determinada substância só será possível usando um 
conjunto de métodos analíticos, como por exemplo, outros métodos cromatográficos, 
métodos espectrofotométricos de I.V., R.M.N. ou pelo acoplamento da cromatografia 
a outras técnicas, como por ex. à, espectrometria de massa GC-MS, LC-MS, a 
espectroscopia de radiação infravermelha GC-FTIR, LC-FTIR entre outras. 
 
 
2.2 - Análise quantitativa 
Após optimizar as condições de análise, ter identificado os constituintes da amostra, 
procede-se à quantificação de um ou de todos os seus componentes, por um dos 
seguintes métodos: 
A - Método da normalização de áreas: A área de cada pico é calculada e directamente 
traduzida em percentagem da soma das áreas de todos os picos. Método simples, 
rápido e independente do tamanho da amostra. Mas não é tomada em consideração a 
resposta específica do detector a cada uma das substâncias. É um método 
aproximativo. 
B - Método da normalização de áreas corrigidas. Os valores obtidos são de boa 
reprodutibilidade. Mas exige a avaliação e correcção das áreas de todos os picos do 
cromatograma. Pressupõe a eluição e detecção de todos os componentes. 
C - Método do padrão interno: A substância padrão é adicionada à amostra em 
análise. Esta substância deve ser inerte, miscível com a amostra, originar um único 
pico e ter um tempo de retenção diferente do(s) da amostra mas bem separado. Este 
método tem a vantagem de poder ser usado quando a natureza da amostra a analisar é 
desconhecida, podendo não serem eluídos ou detectados todos os seus componentes. 
Não tão vulnerável ao tamanho da amostra e à estabilidade das condições de análise. 
A desvantagem prende-se com o facto da quantidade de padrão adicionado 
influenciar os resultados. 
D - Método do padrão externo: Preparam-se e analisam-se quantidades conhecidas de 
padrões e calcula-se a resposta absoluta do detector para cada padrão com base na 
relação entre a área e a concentração, referente a cada um. Como vantagem deste 
método destaca-se o facto de apenas se considerarem a eluição e detecção dos 
compostos que interessam. No entanto, tem que se controlar com grande exactidão, 
quer o tamanho, quer a concentração da amostra injectada. 
3 - Validação de Métodos Cromatográficos 
A validação de um método analítico é o processo que, baseado em estudos de 
laboratório, permite garantir a qualidade dos resultados obtidos por esse método. O 
protocolo é composto geralmente por 3 passos: (Ver ANEXO 1) 
A - Aferição de instrumentos e calibração do equipamento. 
 
 
B - Padronização analítica (linearidade, especificidade, limite de detecção, limite de 
quantificação, exactidão, precisão, recuperação, estabilidade). 
C - Controlo de qualidade. 
 
4 - Análise de álcoois por Cromatografia Gás-Líquido (GC) 
 
5 - Análise de pesticidas por Cromatografia Líquida de Alta Pressão 
(HPLC) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DETERMINAÇÃO DE ÁLCOOIS POR CROMATOGRAFIA 
GASOSA 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
O diagnóstico e tratamento de envenenamentos acidentais ou intencionais, após ingestão 
de metanol, isopropanol, etanol ou etilenoglicol requerem métodos de análise rápidos e 
sensíveis. 
Existem na literatura numerosos métodos para a determinação de etanol em amostras 
biológicas, desde químicos, enzimáticos, cromatográficos, assim como os de detecção 
electroquímica (utilizados nos aparelhos para detecção da taxa de alcoolémia em 
condutores de veículos). 
A cromatografia gasosa é a mais utilizada e considerada como o método de referência. 
A injecção directa e de fase de vapor (head-space) são as técnicas mais comuns na 
determinação de compostos voláteis, sendo a de fase vapor a de maior precisão e 
exactidão. 
A cromatografia gasosa é igualmente uma técnica bastante utilizada na determinação do 
“teor alcoólico” de bebidas alcoólicas e na verificação de contaminações ou fraudes. 
Duma maneira geral, as metodologias utilizadas para a sua determinação requerem a 
escolha da amostra, a sua colheita e armazenamento adequado bem como a melhor 
metodologia analítica. 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
Equipamento 
 
 Cromatógrafo gasoso Varian 
 Detector de ionização de chama (FID) 
 Integrador/ registador Spectra Physics 
 Coluna de empacotamento com enchimento Porapack Q 150-200 mesh 
 Seringa Hamilton de 10 µL 
 
Reagentes 
 
Etanol, metanol, isopropanol, acetaldeído, acetona e n-propanol – Merck 
 
 
Padrões: 
Solução aquosa de etanol - 0,1 mL/100 mL 
Solução aquosa de isopropanol - 0,125 mL/100 mL 
Solução aquosa de metanol - 0,125 mL/100 mL 
Condições cromatográficas 
 
Ƈ Coluna analítica Porapack Q 150-200 mesh 
Ƈ Temperatura do injector (manual) 210ºC 
Ƈ Temperatura do forno 158ºC/ temperatura constante ou isotérmica 
Ƈ Temperatura do detector 220ºC 
Ƈ Gás transportador – Azoto – com um fluxo de 30 mL/min 
Ƈ Fluxo para os gases do detector foi de 300 mL/min para o ar e 30 mL/min para o 
hidrogénio 
 
Procedimento 
 
1- Injectar 2 µL de cada um dos padrões 
2- Injectar 2 µL da amostra 
3- Analisar os tempos de retenção para identificação dos componentes da amostra 
4- Escolher o melhor processo de quantificação (Método do padrão interno e/ou 
método do padrão externo) 
5- Programar o integrador para o método escolhido 
6- Injectar novamente padrões e amostra 
 
Validação 
 
ĺ Linearidade – Curva de calibração determinada com soluções aquosas de etanol 
num intervalo de concentrações de 0,08 a 1,0 g /L, utilizando a 
relação área de pico/concentração 
ĺ Especificidade, recuperação, exactidão e precisão 
ĺ Limite de detecção, limite de quantificação e estabilidade 
 
RESULTADOS/CONCLUSÃO 
 
ſ Identificação do etanol existentes na amostra a partir dos cromatogramas obtidos. 
ſ Determinação da quantidade de etanol na amostra pelos diferentes métodos de 
quantificação. 
 
 
 
DETERMINAÇÃO DE ALDRINA, ENDRINA E DDT POR HPLC-
UV NUMA AMOSTRA DE ÁGUA 
 
INTRODUÇÃO 
 
Os pesticidas organoclorados são insecticidas que foram usados extensivamente na 
década de 50/60 contra os parasitas que atacavam sobretudo as culturas. Dividem-se em 
três grupos: isómeros do hexaclorobenzeno (e.g. lindano), ciclodienos (endrina, 
dieldrina, aldrina, endosulfão,...) e o DDT e análogos. Destacam-se as principais 
propriedades que caracterizam este grupo de compostos: baixa volatilidade, estabilidade 
química, biotransformação e degradação ambiental lentas, baixa solubilidade na água e 
a elevada solubilidade em solventes orgânicos e lípidos. Existem pois várias razões para 
a sua bioacumulação nos sistemas biológicos e persistência no meio ambiente. 
A determinação deste tipo de compostos seja em águas, solos, alimentos ou em fluidos 
biológicos continuam a justificar a grande preocupação que os POP (Persistent Organics 
Pollutants) actualmente apresentam. Duma maneira geral, as metodologias utilizadas 
para a sua determinação requerem numa primeira fase a preparação da amostra seguida 
da aplicação de processos cromatográficos (LC, GC) com detecçãode UV, MS, DAD.... 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
Equipamento 
 
 Sistema de filtração de solventes por vácuo Millipore® com membrana de 0,45µm 
 Banho de ultra-sons 
 Cromatógrafo Gilson equipado com injector Rheodyne e loop de 10 µL 
 Detector Gilson de UV 
 Integrador/ registador Spectra Physics 
 Seringa Hamilton de 10 µL 
 Coluna cromatográfica de fase reversa Varian MCH10, 30x4 mm e 10 µm de 
tamanho de partícula, precedida de um pré-filtro metálico 
 
 
 
Reagentes 
 
Acetonitrilo, Lichrosolv, Merck® 
Metanol, Lichrosolv, Merck® 
Água Milli-Q, Resistividade 18 Mȍcm 
 
Padrões: 
Solução trabalho do Padrão DDT- 0,02 mg/mL 
Solução trabalho do Padrão Aldrina- 0,02 mg/mL 
Solução trabalho do Padrão Endrina- 0,01 mg/mL 
 
Preparação da amostra 
 
Partindo de 500 mL de água de um rio, na proximidade de um campo de cultivo da 
região centro, procedeu-se à concentração dos pesticidas utilizando SPE (coluna Sep-
Pak® C18) com vácuo. O DDT ficou retido na coluna e foi eluído com 1 mL de metanol. 
O factor de enriquecimento da amostra foi de 500. 
 
Condições cromatográficas 
 
Ƈ Uso de uma coluna de fase reversa C18 para separar, identificar e quantificar 
pesticidas 
Ƈ Uma eluição isocrática/ Temperatura ambiente 
Ƈ A fase móvel escolhida para a eluição destes pesticidas foi uma mistura de metanol: 
acetonitrilo: água (73:10:17 v/v), previamente filtrada e desgaseificada. 
Ƈ O fluxo utilizado durante a análise cromatográfica foi de 1,3 mL/min 
Ƈ Detecção com UV/VIS a 224 nm com uma sensibilidade de 0.05 AUFS 
 
Procedimento 
 
1- Injectar 10 µL de cada um dos padrões 
2- Injectar 10 µL da amostra 
3- Analisar os tempos de retenção para identificação dos componentes da amostra 
 
 
4- Escolher o melhor processo de quantificação (Método do padrão interno e/ou 
método do padrão externo) 
5- Programar o integrador para o método escolhido 
6- Injectar novamente padrões e amostra 
 
Validação 
 
ĺ Linearidade – Curva de calibração com concentrações de DDT entre 0,01 e 0,2 
mg/L, utilizando a relação altura de pico/concentração 
ĺ Especificidade, recuperação, exactidão e precisão 
ĺ Limite de detecção, limite de quantificação e estabilidade 
 
 
RESULTADOS/CONCLUSÃO 
 
ſ Identificação dos pesticidas existentes na amostra a partir dos cromatogramas 
obtidos. 
ſ Determinação da quantidade de pesticida na amostra pelos diferentes métodos de 
quantificação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BIBLIOGRAFIA 
 
CASSARETT E DOULL,S 
“Toxicologia – Ciência Básica dos Tóxicos” 
MacGraw-Hill de Portugal 
5ª edição. 2001 
 
ERVIN JUNGREIS 
"Spot Test Analysis" 
Clinical, Environmental, Forensic, and Geochemical Aplications 
John Wiley & Sons, Inc. - USA 
2ª ed. - 1997 
 
H. J. CHAVES das NEVES; A. M. COSTA FREITAS 
"Introdução à Cromatografia Gás - Líquido de Alta Resolução" 
Dias de Sousa Lda - Portugal 
1996 
 
CHAMBERLAIN, JOSEPH 
"Analysis of Drugs in Biological Fluids" 
C. R. C. Press, Inc. - USA 
1985 
 
SUNSHINE, IRVING 
"Methodology for Analytical Toxicology" 
Vol. I, II, e III 
C. R. C. Press,.Inc. - USA 
1985 
 
BASELT, RANDALL C. 
"Analytical Procedures for Therapeutic Drug Monitoring and Emergency 
Toxicology" 
Biomedical Publications - USA 
1980 
 
H. J. CHAVES das NEVES 
"Introdução à Prática da Cromatografia Gás - Líquido" 
Universidade Nova de Lisboa, F.C.T.L. - Portugal 
1980