Microscopia I

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02/08/2013 
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA 
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, AMBIENTAIS E BIOLÓGICAS 
CCA 480 – BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR 
MICROSCOPIA 
Docente: Eliana Maria Rocha Sousa 
Com a ajuda do microscópio não há nada tão pequeno que 
possa escapar às nossas investigações; portanto há um 
novo e visível mundo descoberto a ser entendido. 
 
 
 
 
 
 Robert Hookie (Micrographia, 1664). 
O que faz parte desse mundo novo, 
descoberto que deve ser entendido? 
Célula 
HISTÓRICO DA MICROSCOPIA 
• Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) 
 
• Aperfeiçoou um instrumento e o utilizou na observação de 
seres vivos. 
 
• Seu microscópio era composto por uma lente de vidro, 
permitindo um aumento de 200 a 300 vezes. 
Com este instrumento Leeuwenhoek 
estudou os glóbulos vermelhos do 
sangue e constatou a existência dos 
espermatozoides 
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HISTÓRICO DA MICROSCOPIA 
• Diversos microscópios com diferentes lentes 
HISTÓRICO DA MICROSCOPIA 
• Desenhos de Antonie 
van Leeuwenhoek 
 
 
• Publicado em 1684 
 
 
• Formas de bactérias 
- Bacilos 
- Cocos 
 
HISTÓRICO DA MICROSCOPIA 
• Robert Hooke (1635 – 1703) 
 
• 1665 livro intitulado “Micrographia” 
 
• Descrição do microscópio e 
descoberta da circulação do sangue 
nos peixes. 
 
• Microscópio de Robert Hooke 
apresentava um ajuste melhor, pois 
existia mais uma lente. 
HISTÓRICO DA MICROSCOPIA 
 Examinou um pedaço de cortiça, observou diversos 
casulos que pareciam um favo de mel, e denominou de 
“CÉLULAS”. 
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HISTÓRICO DA MICROSCOPIA 
• Após aproximadamente 200 anos o microscópio deixou de 
se ser um instrumento exótico e pouco acessível para ser 
usado de forma mais ampla. 
 
 
 
• Século XIX  Microscópios ópticos de boa qualidade 
começaram ficar acessíveis. 
 
 
 
• Botânico Schleiden (1804-1881) e o fisiologista Schwann 
(1810-1882) 
 
Schleiden 
Todos os tecidos vegetais e animais são agregados de células 
individuais 
1838 – Doutrina celular 
Nascimento formal da Biologia Celular 
Schwann 
Os conhecimentos sobre as células foram desenvolvidos 
paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de 
investigação 
Conhecer a estrutura celular é essencial para posteriormente 
entender o funcionamento da célula 
VISUALIZAÇÃO 
Existem 
especificações 
para os 
microscópios 
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Escala da célula ao átomo, passando por mitocôndria e ribossomo. 
VISUALIZAÇÃO DAS CÉLULAS 
• A maioria das células animais são pequenas e transparente 
 
• Visualização do interior começou a existir a partir do 
desenvolvimento de corantes 
 
• Século XIX, variedade de corantes e visualização de 
características 
 
• 1940–introdução do microscópio eletrônico, maior 
necessidade de preservar e corar células 
 
• Importância do instrumento (microscópio) e da preparação da 
amostra 
Corantes 
básicos 
COLORAÇÃO DE CÉLULAS 
Azul de 
tuluidina 
Hematoxilina 
Corantes 
ácidos 
Eosina 
Células nervosas 
Células do pâncreas 
Células do 
estômago 
Células do rins 
COLORAÇÃO DE CÉLULAS 
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CORTES 
Cortes muitos finos: maioria dos materiais antes de corar 
• Material cortado é desidratação 
 
• Incluso em parafina, cortes de fatias muito finas 
 
 
 
Uso do micrótomo 
Lâmina de barbear 
CORTES 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
A = Parte óptica B = Parte mecânica 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
• Parte óptica 
Condensador 
Objetiva 
Ocular 
Imagem percebida 
pela retina ou por 
fotografia 
- Condensador: projeta cone de luz sobre a amostra no 
microscópio. 
 
- Objetiva: projeta uma imagem aumentada para a ocular. 
 
- Ocular: amplia novamente a imagem. 
 
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MICROSCÓPIO ÓPTICO 
• Poder de resolução: capacidade de separar detalhes 
 
• Poder de resolução é expresso pelo limite de resolução 
 
• Limite de resolução: menor distância que pode existir entre 
dois pontos para que apareçam individualizados 
 
0,3 µm de distância 
Sistema óptico com 
limite resolutivo de 
0,2 µm 
0,3 µm de distância 
Sistema óptico com 
limite resolutivo de 
0,5 µm 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
O que determina a riqueza de detalhes da imagem 
fornecida por um sistema óptico é o seu limite de 
resolução, e não seu poder de aumentar o tamanho do 
objeto. 
Responsáveis pelo limite 
de resolução 
Apenas aumenta de 
tamanho a imagem oriunda 
da objetiva 
Poder de aumentar + poder de resolução = 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Qual o aumento de cada objetiva? 
MICROSCÓPIO ÓPTICO: MODELOS 
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MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Microscópio de polarização 
• Permite estudar alguns aspectos moleculares dos constituintes celulares 
 
• Feixe de luz passa por moléculas alongadas (birrefringentes ou 
anisotrópicos), dividem o feixe de luz em dois 
 
• Uso de dois prisma ou filtros - polarizador e analisador - promovem a 
seleção de apenas um plano de direção de ondas luminosas 
 
• Componentes birrefringentes apresentam brilho colorido, esses 
materiais se destacam em detrimento a outros não birrefringentes 
 
• Imagem vai ser formada 
 
 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Microscópio de polarização 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Microscópio de contraste de fase 
• Sistema óptico que transforma diferença de fases (atrasos) dos raios 
luminosos ao atravessarem as estruturas biológicas. 
 
• Estruturas celulares claras (negativo) ou escuras (positivo) 
 
• Não precisa usar corante 
 
• Observação de células e tecidos vivos – mitose em células cultivadas 
Microscópio 
comum 
Microscópio de 
contrate positivo 
Microscópio de 
contrate negativo 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Microscópio de fluorescência 
• Luz utilizada é originada de uma fonte muito 
potente 
 
 
• Passa por dois conjuntos de filtros – um filtra 
a luz antes de atingir a amostras o segundo 
é para filtrar a luz obtida da amostra 
 
 
• As moléculas fluorescentes absorvem luz 
em um comprimento de onda e emitem em 
outro comprimento de onda mais longo 
 
 
• Detectar proteínas em células e tecidos 
 
 
• Uso de corante fluorescente 
 
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MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Microscópio confocal 
• Iluminação por meio de raio laser 
 
• Varredura de ponto por ponto de um determinado plano da célula 
 
• Corte óptico 
 
• Componentes celulares em outro plano de foco não contribui na 
imagem 
 
• Imagens nítidas – armazenagem em computador – formação de 
imagem tridimensional 
 
• Formação de imagem digital 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Microscópio confocal 
Microscópio de 
fluorescência 
Microscópio 
confocal 
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
• Possível obter com nitidez imagem de estruturas muito 
menores do que as possíveis com o microscópio de óptico 
• Fonte luminosa  feixe de elétrons 
canhões de emissão de campo 
 
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
Princípios para construção do microscópio 
eletrônico 
1924: Louis de Broglie, 
demonstrou que os 
elétrons têm propriedades 
ondulatórias, semelhantes 
da luz visível, ultravioleta e 
raios x. 
Campo magnético, 
adequadamente 
estruturado, poderia ser 
usado como lentes de 
aumento para um feixe de 
elétrons. 
Lentes do microscópio eletrônico: eletromagnética, constituídas por uma 
bobina, formada por milhares de voltas de fio, através da qual passa 
uma corrente elétrica 
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
Aquecimento do catodo e formação de 
elétrodos.Partículas são aceleradas devido a diferença 
de potencial entre o catodo e o anodo, que é 
perfurado no centro e só permite a passagem 
de parte dos elétrons formando um feixe. 
 
Os elétrons têm que interagir com o objeto 
para gerar a imagem, o objeto tem que ser 
extremamente fino para permitir a passagem 
de elétrons. 
As lentes eletromagnéticas ficam disposta 
em uma coluna, um sistema de alto vácuo, 
pois a presença do ar com suas partículas 
podem desviar os elétrons e o feixe não seria 
formado. 
Os elétrons saem da fonte geradora, são 
encaminhados para a lente condensadora 
dos feixes, que os direciona para o objeto. A 
lente intermediária e a lente projetora 
ampliam o padrão de transparência dos 
elétrons. 
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
Amostras 
• Preservado pela fixação 
 
 - Glutaraldeído e tetróxido de ósmio (fixadores e corantes) 
 - Soluções de urânio ou chumbo (melhora o contraste) 
 
• Desidratação 
 
• Tecido morto cortado em secções extremamente finas, 50 a 
100 nm 
 
• Bloco com resina – cortes em micrótomos especiais – navalha 
de vidro ou diamante 
 
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
Microscópio eletrônico de varredura (MEV) 
• Fornece imagens tridimensionais 
 
• Objetos de 1cm podem ser analisados inteiros 
 
• Material depois de fixado é recoberto com uma camada de 
ouro ou platina (condutores de eletricidade) para posterior 
análise 
Diatomácea 
• Limite de resolução menor que o 
microscópio eletrônico de transmissão 
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