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Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 1 FAMENE NETTO, Arlindo Ugulino. MICROBIOLOGIA GENOMA BACTERIANO – MECANISMO GENÅTICOS DA RESISTÇNCIA (Professora Socorro Vieira) Para se discutir os mecanismos genÉticos da resistÑncia antimicrobiana, deve-se antes conhecer o genoma bacteriano, uma vez que a multiresistência de uma bactéria está ligado à genes cromossomais da mesma. O genoma representa o conjunto do material genético que uma célula apresenta. A organização genômica das bactérias é dinâmica e composta por diferentes modalidades de moléculas de DNA: cromossomo, plasmídios, transposons e bacteriófagos. O cromossomo bacteriano contém todos os genes requeridos para o metabolismo e ciclo vital da bactéria. Plasmídios, transposons e bacteriófagos são entidades moleculares independentes que ocorrem indistintamente em diferentes grupos bacterianos e que funcionam como elementos genéticos acessórios. Os genes que transportam não são essenciais à sobrevivência da bactéria, mas podem condicionar características tais como fatores de virulência, resistência a agentes antimicrobianos, bacteriocinas, toxinas, fixação de nitrogênio e utilização de fontes não usuais de carbono. Tais características adicionais podem ter importância adaptativa em determinadas situações. Todo material genético de uma bactéria, seja constitutivo ou acessório, está em contato direto com o citoplasma. Em processos de divisão (a cada 20 minutos), uma bactéria copia totalmente seus genes para a nova bactéria, o que explica a dificuldade de se controlar processos infecciosos. Cromossomos e plasmídios constituem replicons, ou seja, unidades moleculares capazes de replicação autônoma. Transposons e bacteriófagos não são capazes de replicação autônoma e precisam estar inseridos em um replicon para se duplicarem. A figura acima mostra um mapa gênico de uma célula procariótica. A célula bacteriana tem cerca de 2400 genes codificantes de proteínas necessárias para sua sobrevivência. CÅLULA PROCARIÇTICA X CÅLULA EUCARIÇTICA Enquanto a célula eucariótica apresenta todo seu genoma organizado e compartimentalizado por um núcleo (lembrando, é claro, do material genético mitocondrial), o cromossomo bacteriano existe na forma de uma molécula circular única de DNA de cadeia dupla, altamente enovelada e livre no citoplasma. CÉlulas ProcariÖticas CÉlulas EucariÖticas 1. Contém apenas um cromossomo (único e circular) 2. Consiste de uma única molécula de DNA de fita dupla na forma circular 3. Não possui membrana nuclear: o cromossomo se localiza em uma região denominada nucleóide (em que o cromossomo se associa a proteínas). 4. É enrolado, espiralado e de forma altamente compacta - é cerca de 1200 vezes maior que o tamanho da célula 5. É rara a presença íntrons 1. Há mais do que um cromossomo por célula 2. Cada cromossomo consiste em uma única molécula longa de DNA de fita dupla enrolado em agregados de proteínas histonas em intervalos regulares 3. Possui membrana nuclear 4. Apresenta forma linear, e a molécula de DNA é cerca de 10 vezes mais longa 5. Presença marcante de íntrons 6. Mitocôndrias e cloroplastos apresentam material genético. Além do cromossomo uma célula bacteriana pode conter uma ou mais estrutura de DNA chamados plasmídeos - moléculas de DNA de fita dupla menores que os cromossomos e que podem replicar-se independentemente destes. Outra diferença é o cromossomo da célula eucariótica, que é predominantemente constituído por íntons (sequencias não codificadoras) do que por éxons (sequencia codificadora). Já o cromossomo bacteriano apresenta uma grande maioria de exons em relação aos introns (que são quase raros). As bactérias, como já foi dito e será discutido, possuem, além do seu cromossomo único e circular imerso no citoplasma, os seguintes elementos: plasmídeos, vírus e transposons. Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 2 PROCARIOTOS O Reino Monera reúne os organismos procariontes, unicelulares, coloniais ou não, de vida livre ou parasita, autótrofos (fotossintetizantes ou quimiossintetizantes) ou heterotróficos que se alimentam por absorção. Mesmo possuindo uma estrutura e organização celular rudimentar, uma tendência evolutiva desde o primórdio dos seres vivos, essas demonstram um grande potencial biológico, coexistindo em todos os tipos de ambientes, seja terrestre, aéreo ou aquático. Esse Reino compreende as bactérias e algas azuis (atualmente denominadas de cianobactérias). Devido à contribuição da Biologia molecular esse Reino passou a ser classificado em dois sub-reinos de organismos procarióticos bem diferentes: Eubactérias e Arqueas (Archaeobactérias). As arqueobactérias são muito semelhantes às eubactérias e só foram diferenciadas destas há poucas décadas, graças ao desenvolvimento das técnicas de análise molecular. Uma dirença importante entre arqueas e bactérias é quanto a constituição química da parede célular. As arqueas não apresentam, em sua parede celular, o peptidoglicano, constituinte típico das bactérias. As arqueobactérias podem ser dos seguintes tipos: Arqueobactérias metanogênicas Termófilas extremas: vivem em condições extremas de temperatura (600ºC) Halófilas extremas: vivem em condições extremas de salinidade (NaCl a 25%). PLASMÉDIOS São moléculas extracromossomais circulares de DNA autoreplicativo encontradas em muitas espécies bacterianas e em algumas espécies de eucariotos (ex: o anel de 2-micra em Saccharomyces cereviesiae). São geralmente moléculas de DNA de fita dupla em forma de círculos fechados e passam às células-filha durante a divisão celular. Quando o plasmídio está integrado ao cromossomo, recebe outro nome: epíssomo. OBS1: Os epissomas são plasmídeos que conseguem se integrar no DNA cromossómico do hospedeiro Por esta razão, podem permanecer intactos durante muito tempo, ser duplicados em cada divisão celular do hospedeiro, e transformar- se numa parte básica da sua constituição genética. A maioria das bactérias conhecidas transporta um ou mais tipos de plasmídios. Os genes que transportam não são essenciais à sobrevivência da bactéria, mas podem condicionar características adicionais tais como fatores de virulência, resistência a agentes antimicrobianos, bacteriocinas, toxinas, fixação de nitrogênio e utilização de fontes não usuais de carbono. Muitas das características condicionadas por genes plasmidianos contribuem para a adaptabilidade da bactéria em condições especiais. As bactérias não constroem seus próprios plasmídios, mas os adquirem através do fenômeno da conjugação bacteriana, na qual uma bactéria transportando um plasmídio o transfere para uma outra bactéria, mantendo para si uma cópia deste. REPLICAÇÃO DO PLASMÍDIO A replicação dos plasmídeos pode ser de dois tipos: por replicação de entidades independentes ou por replicação de epíssomo integrado. A replicação do plasmídeo também pode ocorrer em dois momentos: (1) quando a célula bacteriana se divide, o DNA plasmidal também se divide, assegurando que cada célula filha receba uma cópia deste; (2) durante o processo de conjugação, a molécula de DNA replicada pode entrar na célula receptora. TIPOS DE PLASMÍDIO Existem dois grupos básicos de plasmídeos: os conjuntivos e os não-conjuntivos. Os plasmídeos conjuntivos contém um gene chamado tra-gene, que pode iniciar a conjugação, isto é, a troca sexual de plasmídeos com outra bactéria. Os plasmídeos não-conjuntivos são incapazes de iniciar a conjugação e, por esse motivo, o seu movimento para outra bactéria, mas podem ser transferidos com plasmídeos conjuntivos durante a conjugação. Plasmídeos de Fertilidade (F): contém apenas tra-genes. A sua única função é a iniciação da conjugação bacteriana. A bactéria que apresenta o plasmídio F (chamada de F+ ou macho) tema capacidade de produzir fímbrias associadas na reprodução sexuada com outras bactérias. A bactéria receptora é denominada F-. Plasmídeos de Resistência (R): contém genes que os tornam resistentes a antibióticos ou venenos, ou seja, é responsável pela resistência da bactéria a antimicrobianos. Plasmídeos Col: contém plasmídeos que codificam (determinam a produção de) colicinas, proteínas que podem matar outras bactérias, inibindo o crescimento de outras células que não possuem esse plasmídio. Plasmídeos Degradativos: permitem a digestão de substâncias pouco habituais, como o toluole ou o ácido salicílico, ou até mesmo derivados do petróleo (sendo usados para limpar poluições causadas por vasamento destes produtos). Plasmídeos de Virulência: transformam a bactéria num agente patogénico, estando associado então, a patogenicidade da bactéria. Como por exemplo o plasmídeo Ti, da bactéria Agrobacterium tumefaciens, que é usado atualmente na genética para a produção de plantas transgênicas. Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 3 TRANSPOSONS Transposons sÄo fragmentos de DNA linear. Os transposons sÄo elementos genÅticos mÇveis capazes de se inserirem em diferentes pontos do cromossomo bacteriano. ApÇs inserir-se em um determinado sÉtio do cromossomo, o transposon pode deixar uma cÇpia neste sÉtio e inserir-se em outro ponto do cromossomo, um fenÑmeno denominado transposiÖÄo. A transposiÖÄo ocorre devido Ü presenÖa, no transposon, de seqáàncias especÉficas de DNA denominadas seqáàncias de inserÖÄo (IS). As IS sÄo pequenas sequàncias de DNA que codificam a enzima transposase, responsâvel pela transposiÖÄo. Quando o transposon se liga ao cromossomo da bactÅria, isso a confere uma maior mutagenicidade (por induzir mutaÖäes) bem como o isolamento de parte de seu material genÅtico (“DNA egoÉsta”). Os transposons codificam uma ou mais proteÉnas que conferem caracterÉsticas como resistància a drogas antimicrobianas, enterotoxinas e enzimas degradativas. Os transposons possuem genes de resistàncias, como por exemplo, a TN1AMP (resistente Ü ampicilina). RECOMBINAÑÖO: TRANSFERÜNCIA GÜNICA BACTERIANA A maioria das bactÅrias possui uma çnica cadeia de DNA circular. As bactÅrias, por serem organismos assexuados, herdam cÇpias idànticas do genes de suas progenitoras (ou seja, elas sÄo clonais). Algumas bactÅrias tambÅm transferem material genÅtico entre as cÅlulas. A transferància de genes Å particularmente importante na resistància Ü antibiÇticos. A resistància a antibiÇticos acontece devido Ü "colocaÖÄo" de um plasmÉdio que vai dar essa resistància ao antibiÇtico. A maioria das batÅrias nÄo apresentam reproduÖÄo sexuada, mas podem ocorrer misturas de genes entre indivÉduos diferentes, o que Å chamado de recombinação genética. Esse processo leva Ü formaÖÄo de novos indivÉduos com caracterÉstias genÅticas diferentes, resultando na mistura de material genÅtico. Uma bactÅria pode adquirir genes de outra bactÅria e mistura-la aos seus de tràs maneiras diversas: TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA Ocorre pela absorÖÄo de molÅculas ou fragmentos de molÅculas de DNA que estejam dipostos no ambiente, proveniente de bactÅrias mortas e decompostas; a cÅlula bacteriana transformada (receptora) passa a apresentar novas caracterÉsticas hereditârias, condicionadas pelo DNA incorporado. Este nÄo precisa ser de bactÅrias da mesma espÅcie; em princÉpio, qualquer tipo de DNA pode ser capturado se as condiÖäes forem adequadas. Entretanto, um DNA capturado sÇ serâ introduzido no cromossomo bacteriano se for semelhante ao DNA da bactÅria receptora. TRANSDUÇÃO BACTERIANA Consiste na transferància de segmentos de molÅculas de DNA de uma bactÅria para outra. Isso ocorre porque, ao formarem-se no interior das cÅlulas hospedeiras, os bateriÇfagos (vÉrus) podem eventualmente incorporar pedaÖos do DNA bacteriano. Depois de ser liberados a infectar outra bactÅria, os bacteriÇfagos podem transmitir a ela os genes bacterianos que transportavam. A bactÅria infectada eventualmente incorpora em seu cromossomo os genes recebido do fago. Se este nÄo destruir a bactÅria, ela pode multiplicar-se e originar uma linhagem "transduzida" com novas caracterÉsticas, adquiridas de outras bactÅrias via fago. CONJUGAÇÃO BACTERIANA Consiste na transferància de DNA diretamente de uma bactÅria doadora para uma receptora atravÅs de um tubo de proteÉna denominado pêlo sexual ou pili, que conecta duas bactÅrias. Os pili estÄo presentes apenas em bactÅrias doadoras de DNA. Quando a recombinaÖÄo genÅtica foi descoberta pelo biÇlogo Joshua Lederberg, pensou-se que se tratava de um processo sexual comparâvel ao dos seres eucariontes . Por isso, na Åpoca, as bactÅrias doadoras de DNA foram denominados machos e as receptoras, fàmeas. A continuidade dos estudos mostrou que a capacidade de doar DNA estâ ligada Ü presenÖa de um plasmÉdio denominado F (de fertilidade); bactÅrias portadoras do plasmÉdio F, Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 4 denominadas F + , atuam como doadoras de DNA e as que nÄo possuem o plasmÉdio F atuam como receptoras, sendo chamadas de F - . Hoje sabe-se que o DNA transferido de uma bactÅria para outra, na conjugaÖÄo, Å quase sempre o plasmÉdio F. Algumas vezes, porÅm, um pequeno pedaÖo de DNA cromossÑmico une-se ao plasmÉdio e Å transferido junto com ele na conjugaÖÄo. Na bactÅria receptora pode ocorrer recombinaÖÄo genÅtica entre o cromossomo e o fragmento de DNA unido ao plasmÉdio recebido da bactÅria doadora. ASPECTOS GENÅTICOS DA RESISTÜNCIA BACTERIANA A DROGAS O genoma procarioto e sua funÖÄo determina um dos maiores problemas de saçde pçblica atual: mecanismo de resistància Ü antibiÇtico. Para isso, devemos iniciar definindo os seguintes termos: quimioterâpicos e antibiÇticos. Quimioterápico: substéncia com aÖÄo antimicrobiana produzida por sÉntese em laboratÇrio. Antibiótico: substéncia de aÖÄo antimicrobiana produzida naturalmente por fungos e pelas prÇprias bactÅrias. Ex: Penicillium Penicilinas Cephalosporium Cefalosporina Streptomyces Estreptomicina, neomicina, canamicina, tobramicina, eritromicina, etc. Micromonospora Gentamicina, sisomicina Bacilus Polimixinas, bacitracina Chromobacterium Aztreonam OBS2: Admite-se que o “cheiro de chuva” que predomina na terra apÇs a chuva Å resultado de geoprodutos liberados pelas bactÅrias Streptomyces presentes no solo. AÇÃO DOS ANTIMICROBIANOS Bacteriostática: inibe o processo de multiplicaÖÄo do microorganismo. Bactericida: inibe o crescimento do microorganismo. HISTÓRICO Como se sabe, antibiótico Å uma substéncia que tem capacidade de interagir com microorganismos unicelulares ou pluricelulares que causam infecÖäes no organismo. Os antibiÇticos interferem com estes microorganismos, matando-os ou inibindo seu metabolismo e ou sua reproduÖÄo, permitindo ao sistema imunolÇgico combatà-los com maior eficâcia. O primeiro antibiÇtico fabricado pelo homem foi a penicilina. Alexander Fleming, bacteriologista do St. Mary's Hospital, de Londres, jâ vinha havia algum tempo pesquisando substéncias capazes de matar ou impedir o crescimento de bactÅrias nas feridas infectadas, pesquisa justificada pela experiància adquirida na Primeira Grande Guerra 1914- 1918, na qual muitos combatentes morreram em conseqáància da infecÖÄo em ferimentos profundos e mal-tratados por falta de tratamento adequado. No ano de 1922 Fleming descobre uma substéncia antibacteriana na lâgrima e na saliva, a qual dera o nome de lisozima. E em 1928 Fleming desenvolveu pesquisas sobre estafilococos, quando descobriu a penicilina. A descoberta da penicilina deu-se em condiÖäes peculiarÉssimas, graÖas a uma seqáància de acontecimentos imprevistose surpreendentes. No màs de agosto de 1928 Fleming tirou fÅrias e, por esquecimento, deixou algumas placas com culturas de estafilococos sobre a mesa, em lugar de guardâ-las na geladeira ou inutilizâ-las, como seria natural, ao retornar ao trabalho, em setembro do mesmo ano, observou que algumas das placas estavam contaminadas com mofo, fato este relativamente freqáente. Colocou-as entÄo, em uma bandeja para limpeza e esterilizaÖÄo com lisol. Neste exato momento entrou no laboratÇrio um seu colega, Dr. Pryce, e lhe perguntou como iam suas pesquisas. Fleming apanhou novamente as placas para explicar alguns detalhes ao seu colega sobre as culturas de estafilococos que estava realizando, quando notou que havia, em uma das placas, um halo transparente em torno do mofo contaminante, o que parecia indicar que aquele fungo produzia uma substéncia bactericida. O assunto foi discutido entre ambos e Fleming decidiu fazer algumas culturas do fungo para estudo posterior. O fungo foi identificado como pertencente ao gànero Penicilium, de onde deriva o nome da penicilina dado Ü substéncia por ele produzida. Fleming passou a empregâ-lo em seu laboratÇrio para selecionar determinadas bactÅrias, eliminando das culturas as espÅcies sensÉveis Ü sua aÖÄo. A descoberta de Fleming nÄo despertou inicialmente maior interesse e nÄo houve a preocupaÖÄo em utilizâ-la para fins terapàuticos em casos de infecÖÄo humana atÅ a eclosÄo da Segunda Guerra Mundial, em 1939. Nesse ano e em decorrància do prÇprio conflito, a fim de evitarem-se baixas desnecessârias, foram entÄo ampliadas as pesquisas a respeito da penicilina e seu uso humano. Em 1935, Gerhard Domark cria em laboratÇrio a sufa, substéncia com atividade antimicrobiana. Em 1940, Sir Howard Florey e Ernst Chain, da Universidade de Oxford, retomaram as pesquisas de Fleming e conseguiram produzir penicilina com fins terapàuticos em escala industrial, inaugurando uma nova era para a medicina denominada a era dos antibiÇticos. Para a II Guerra Mundial, os antibiÇticos eram vistos como “Balas Mâgicas”. Ainda nesse perÉodo, menos que 1% dos S. aureus estudados eram resistentes a penicilina. Em 1946, 60% dos S. áureos jâ se apresentavam resistentes Ü penicilina: apresentavam genes produtores de penicilinases, enzimas que quebram o anel β-lactamico da penicilina (responsâvel por matar a bactÅria). Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 5 RESISTÊNCIA BACTERIANA A DROGAS A resistência bacteriana pode ser dar por duas formas: resistência natural (toda a espécie bacteriana é naturalmente resistente a um certo antibiótico. Ex: Escherichia coli não pode ser tratada com benzilpenicilina por ser resistente à essa droga) e resistência adquirida (ao longo de seu desenvolvimento, adquire resistência devido a processos de conjugação, transformação, etc.). O antibiótico não induz resistência. A resistência adquirida é um fenômeno espontâneo da bactéria, sendo os antimicrobianos apenas agentes seletores de amostras resistentes. Isso demonstra que antibióticos devem ser administrado da maneira e intervalos corretos. CAUSAS DA RESISTÊNCIA A capacidade de adaptação ao novo ambiente garante à bactéria variabilidade genética gerada por mutação e mecanismos de transferência. As condições que favorecem a seleção e disseminação de genes de resistência aos antibióticos são: Uso abusivo dos antimicrobianos nos hospitais Venda livre/Aquisição direta pelo doente (Automedicação) Indicação indiscriminada por médicos Uso como aditivo em ração animal A tecnologia do DNA recombinante, que gera organismos transgênicos, pode criar vetores plasmídios resistentes Pressão seletiva natural de muitos antibióticos (fungos e bactérias) Exposição a outros agentes seletivos como mercúrio Fatores atuais: Maior imunodepressão (decorrente da AIDS, quimioterapia anticâncer e maior freqüência de transplantes) Modernos meios de transportes, o que facilita o transporte de pessoas ao redor do mundo, carregando consigo bactérias de variados meios de resistência. OBS3: Mecanismo de Resistência: Versatilidade Genética Aquisição de Novo Dna Mutação e Recombinação Mecanismos ee Tranferência do Material Genético COMO SALVAR OS ANTIMICROBIANOS Para evitar cada vez mais a resistência dos micróbios aos medicamentos, deve-se tomar algumas medidas, tais como: A busca de novos antimicrobianos Modificar ou rejuvenescer drogas já existentes Obtenção de Vacinas por Técnicas Convencionais ou Moleculares Admitir que a resistência bacteriana é um sério problema de saúde pública (Fenótipo=Genótipo + Ambiente) Adotar ações que reduzam o uso dos antimicrobianos: Só usá-los se indispensável (Diagnóstico); Realizar antibiogramas; Programas de vigilância hospitalar e comunitária; Usar vacinas que aumentem as defesas do organismo e reduzam as necessidades de drogas. OBS4: A Anvisa, com o intuito de evitar a prescrição de antibióticos sem parcimônia, instituiu, desde 2010 (por meio da RDC Nº 44, DE 26 DE OUTUBRO DE 2010), preconiza no DOU, que a prescrição de antibióticos seja feita a partir do preenchimento de Receituário de Controle Especial, o que exige duas vias, dados gerais do paciente e carimbo do médico responsável. Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 6 ANTIBIOGRAMA Um antibiograma é um ensaio que mede a susceptibilidade/resistência de uma bactéria a um ou mais agentes antimicrobianos. Seu objetivo é tanto a análise do espectro de sensibilidade/resistência a drogas de uma bactéria quanto a determinação da concentração mínima inibitória. O Ágar de Mueller Hinton é recomendado pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para o teste de sensibilidade/resistência a antibióticos de bactérias Gram positivas e Gram negativas, aeróbicas ou anaeróbicas facultativas, comumente encontradas em alimentos e espécimes clínicos. O teste, denominado antibiograma, é feito utilizando-se discos de difusão antibióticos depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou, por espalhamento, uma amostra de uma cultura bacteriana previamente crescida em meio líquido. Material: Pipetador com volume fixo de 100 µl, ponteiras esterilizadas, alça de Drigalski esterilizada, placas de Petri contendo meio Mueller Hinton, discos de difusão de antibióticos, cultura bacteriana em Caldo Nutriente ou meio LB. Procedimento : Semear, por espalhamento com alça de Drigalski ou com uma zaragatoa esterilizada, uma alíquota de 100 µl da cultura bacteriana em uma placa de Petri contendo meio Ágar de Mueller Hinton. Em seguida, depositar discos de papel filtro impregnados, separadamente, com quantidades determinadas de um antibiótico específico sobre a superfície do meio em disposição ordenada. Incubar a placa, invertidas, a 37ºC por cerca de 24 horas. Resultados: A formação de um halo transparente sobre a superfície do meio, ao redor de um disco de antibiótico, indica uma região com ausência de crescimento bacteriano, revelando a ação inibitória do agente antimicrobiano sobre a bactéria ensaiada.
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