Avaliação Laboratorial da Hemostasia

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Avaliação Laboratorial da 
Hemostasia 
Silmara Montalvão 
Farmacêutica Bioquímica 
Laboratório de Hemostasia - Hemocentro Unicamp 
Sumário 
• Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica 
 
• Principais exames na investigação laboratorial e sua 
interpretação: 
 - Limitações e considerações dos testes clássicos da avaliação laboratorial 
da hemostasia 
 
• Laboratório de hemostasia x Hemofilia 
 
 
 Modelos para o entendimento da Hemostasia 
 
Introdução 
Cedido por De Paula, 2012 
Integridade da amostra e variabilidade 
pré-analítica 
  Fontes de erros mais comuns: 1. Não utilizar citrato de sódio como anticoagulante 
2. Tubos utilizado em sistema a vácuo incompletos 
3. Inadequada homogeneização 
4. Estocagem de sangue total em gelo ou ambiente refrigerado 
 
 Amostra ideal para teste de hemostasia 
1. Coleta não traumática com mínimo tempo de torniquete 
2. Tubos com correta proporção de anticoagulante ( > 90%) 
3. Transporte em temperatura ambiente 
4. Tempo máximo de uma hora entre coleta e processamento da amostra 
 
 Causas de rejeição de amostra 
1. Amostra não coletada com citrato de sódio como anticoagulante 
2. Amostras que contenham coágulo 
3. Amostras que não apresentam a proporção de 9:1 (sangue/anticoagulante) 
4. Amostras com hematócrito > 55% 
5. Amostras hemolizadas 
 
Steve K, Quality in laboratory Hemostasis 2009 
Principais exames na investigação 
laboratorial e sua interpretação 
 
Grupo I 
 
• Avaliação do paciente com 
história de sangramento 
 
• Avaliação do paciente com 
história de trombose 
 
 
 
História Clínica 
 
Grupo II 
 
• Avaliação do paciente 
assintomático pré 
procedimentos (triagem) 
 
 
• Avaliação do paciente 
assintomático após alteração 
dos exames de triagem 
Modelo Clássico da Investigação 
Laboratorial 
Hillarp, IHTC- Basic in vivo Coagulation 
Modelo Clássico da Investigação 
Laboratorial 
Hemostasia 
Primária 
TS e PFA 
Teste de 
função 
plaquetária 
Quantidade 
e função do 
FVW 
Hemostasia 
Secundária 
Testes de 
triagem: TP, 
TTPA, TT 
Fatores da 
Coagulação 
Fibinólise 
Dímero D 
Lise de 
euglobulina 
Tromboelato
metria 
Testes de triagem 
TP 
TTPA 
Hillarp, IHTC- Basic in vivo Coagulation 
Testes de triagem 
Cedido por De Paula, 2012 
TTPa normal e TP prolongado 
Repetir 
com mistura 
50:50 
Sem correção 
com mistura 
Inibidor de FVII (raro) 
Deficiência isolada de fator VII hereditária 
Deficiência de múltiplos fatores: hepatopatia, 
uso de Varfarina, deficiência de vitamina K 
(Fator VII tem a meia-vida mais curta) 
 
 
 
Correção com 
mistura 
Teste de triagem 
TP normal e TTPa prolongado 
Repetir 
com mistura 
50:50 
Sem 
correção 
do TTPa 
Pesquisar inibidores: 
Inespecíficos (ac. Lúpico) 
Específicos (FVIII, FIX, FV) 
Deficiência de fatores da via intrínseca 
FVIII, FIX, FXII, FXI, PK, HMWK 
Deficiência de fator de von Willebrand 
Pesquisa de inibidor especifico para FVIII 
 
 
Correção do 
TTPa 
 
Teste de triagem 
Considerações: TTPA incubado a 37ºC/ 2h em pacientes com inibidor adquirido 
KICHEN S, WFH 2010 
Coagulopatia adquiridas 
TP e TTPa normais 
Contagem de plaquetas normal 
Paciente com sangramento 
Teste de triagem 
 
Deficiência de F XIII 
Hiperfibrinólise 
Trombopatia 
 
Ferramentas disponíveis para a 
investigação ? 
Hemostasia 
Primária 
TS e PFA 
Teste de 
função 
plaquetária 
Quantidade 
e função do 
FVW 
Fibinólise 
Dímero D 
Lise de 
euglobulina 
Tromboelato
metria 
Hemostasia 
Secundária 
Testes de 
triagem: TP, 
TTPA, TT 
Fatores da 
Coagulação 
Doença de von Willebrand 
 
Procedimentos Laboratoriais para o diagnóstico da DvW 
•Tempo de sangramento (TS) ou PFA-100 *Dade 
•Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) 
•Contagem de plaqueta 
Testes de 
triagem 
•Atividade de fator VIII (F VIII) 
•Antígeno de fator de von Willebrand (FvW:Ag) 
•Atividade de co-fator de Ristocetina (FvW: Rco) 
•Capacidade de ligação do FvW ao colágeno (FvW:CB) 
Testes 
confirmatórios 
• Aglutinação plaquetária induzida pela ristocetina ( RIPA) 
• Padrão Multimérico do FvW 
•Capacidade de ligação ao FVIII (FvW: FVIIIB) 
Testes especiais 
 
Avaliação dos distúrbios do FvW 
 
 Teste para avaliação da atividade de FVW X Variabilidade de 
técnicas atualmente disponíveis: Utilizar ou não a ristocetina? 
 
 
 Muitos trabalhos mostram alta correlação entre os resultados 
entre FVW:Ag por técnica de ELISA e Imunotubidimertria, bem como 
alta concordância clínica. 
KITCHEN. S, Quality in Laboratory Hemostasis and thrombosis, 2009. 
Atividade 
Proteína 
F V W :A g
M é d ia /D P
U
/d
L
E L IS A G r ifo ls IL
-5 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
p = 0 .9 5
 
Avaliação dos distúrbios do FvW 
 
Montalvão SAL, Hemo 2012 
Ferramentas disponíveis para a 
investigação ? 
Hemostasia 
Primária 
TS e PFA 
Teste de 
função 
plaquetária 
Quantidade 
e função do 
FVW 
Fibinólise 
Dímero D 
Lise de 
euglobulina 
Tromboelato
metria 
Hemostasia 
Secundária 
Testes de 
triagem: TP, 
TTPA, TT 
Fatores da 
Coagulação 
 
Avaliação dos distúrbios da fibrinólise 
 Há poucas evidências associado alterações da fibrinólise com 
quadros hemorrágicos ou trombóticos. 
 
 
 • CIVD grave 
 
• Coagulopatia pós-transplante hepático 
 
• leucemia promielocítica 
 
 D dímero 
 
Tromboelastometria 
(tPA) 
 
Teste de euglobulina 
(baixa sensibilidade) 
 
 
Avaliação Convencional x Global 
 Método tradicional da hemostasia compartimentaliza um processo que na 
prática ocorre simultaneamente, dependendo de plaquetas, endotélio, fatores da 
coagulação e até mesmo de outros elementos como hemácias e leucócitos 
 
 Medem a Cinética da formação do coágulo e podem prover a exatidão do 
estado hemostático in vivo: 
 
São mais efetivos para : 
 
 Avaliar a geração de trombina 
 Capacidade hemostática individual 
 Polimerização da fibrina em sangue total 
 Estrutura e estabilidade do coágulo 
 
MEERA CHITLUR, Thrombosis Research. 2012 
Questões laboratoriais da Hemofilia 
1. Diagnóstico 
2. Quantificação de inibidor 
3. Avaliação da Farmacocinética 
 3 questões laboratoriais que interferem 
 no diagnóstico e tratamento das hemofilias 
Favaloro Ej, Soltani S.McDonald J. Potencial Laboratory Misdiagnosis of Hemophilia and von 
Willebrand Disorder Owing to Cold Activation of Blood Samples for Testing. Am J Clin Pathol 
2004; 122: 686-692. 
 
Amostras para o teste de 
FVIII e FvW em tubo fechado 
e conservado entre 18º e 
24º devem ser centrifugados 
e processados em 4 horas. 
Estocagem de 2º a 4º pode 
resultar em baixa atividade 
de FVIII e FvW. 
FVIII:C 
1. Diagnóstico - Condição pré-analítica 
1. Diagnóstico - Reagentes 
1. Diagnóstico – Método 
Montalvão SAL, Hemo 2011 
1. Diagnóstico – Método 
Montalvão SAL, Hemo 2011 
• 1/3 pacientes com HA leve causado por mutação missense tem discrepância de resultados entre 
o ensaio cromogênico e o de coagulação de uma etapa 
 
• Normalmente a atividade do ensaio crormogênico é menor em relação ao de uma etapa 
 
•17 mutações até agora foram descritas com esta informação de discrepância 
 
• A discrepância pode ser parcialmente explicada pelo aumento da instabilidade da molécula que 
sofreu mutação 
 
• A diferença significativa entre osmétodos é que o tempo de incubação necessário para o teste 
cromogênico é maior 
 
1. Diagnóstico – Método 
Bethesda Teste Padrão-Ouro: Bethesta Clássico (Kasper.C 1975) e Bethesda Modificado 
(Verbruggen 1995)-ISTH (2001) 
 
Resultados do método Bethesda modificado apresenta menor CV% quando comparado ao Bethesda 
Clássico, sendo mais fidedignos em resultados de baixo título de inibidor ( 0 a 3 UB-mL) 
2. Quantificação de inibidor 
Montalvão SA, dado não publicado, 2013 
2. Quantificação de inibidor 
A presença de FVIII na amostra do paciente viola o princípio do teste de Bethesda, onde a 
amostra do paciente e o controle devem ser equivalentes antes da incubação da amostra. 
3. A importância da utilização da 
farmacocinética do FVIII e FIX na prática 
clínica 
 Parâmetros farmacocinéticos (PK) pode ser útil para: 
 
 
 (1) Profilaxia: calcular a dose mínima necessária para manter 
o pacientes > 1 UI/dL de fator 
 
 
 (2) Protocolo de ITI: critério de avaliação de sucesso 
(1) Profilaxia: Dose mínima x Farmacocinética 
 Profilaxia: o aumento do nível mínimo de fator VIII e IX > 1 UI/dL, com o objetivo de 
transformar um paciente com hemofilia A ou B grave para moderado, melhorando a 
condição clínica do paciente 
 
 Dose escalonada x Uso de parâmetros farmacocinéticos: 
 
 
 
 
 
Vantagens da utilização de PK 
 Considera o padrão de sangramento individual do paciente, ou seja, o uso racional do 
concentrado de fator 
 Com a dose ajustada corretamente o paciente apresenta menor risco de sangramento 
Desvantagens da utilização de PK 
 Disponibilidade da apresentação dos frascos 
 Quantidade de amostras requeridas (pediátricos) 
 
3. A importância da utilização da 
farmacocinética do FVIII e FIX na prática 
clínica 
O sucesso da ITI é considerado levando-se em conta quatro parâmetros 
 
• Título de inibidor negativo (< 0,6 UB/mL) 
 
• Teste normal de recuperação in vivo (IVR) de FVIII:C (> 66%) 
 
• Vida-média de FVIII normal (> 6 horas após 72h com ausência de fator exógeno) 
 
• Ausência de resposta anamnésica em futura reexposição do fator 
 
 
DI MICHELE et. al , Haemophilia2007 
(2) Avaliação do sucesso de ITI: Farmacocinética 
3. A importância da utilização da 
farmacocinética do FVIII na prática clínica 
Amostras necessárias para avaliação da farmacocinética 
 
Parâmetros da 
farmacocinética 
Método 
convencional 
ISTH (2001) 
Método 
utilizado no 
Brasil 
MS (2011) 
Método em 
avaliação 
ISTH (2012) 
Amostragem 8 6 5 
Teste de 
recuperação in 
vivo 
15 minutos 15 minutos 15 minutos 
30 minutos 30 minutos 30 minutos 
3 horas 1 hora 4 horas 
 
Teste de vida - 
média 
6 horas 3 horas 24 horas 
9 horas 6 horas 48 horas 
24 horas 24 horas 
28 horas 
32 horas 
 
 Modelo convencional: 
Cálculo do Teste de recuperação do FVIII in vivo 
Cálculo da vida-média de Fator VIII (T1/2) 
Modelo convencional 
Conclusão 
 A condição pré-analítica deve ser observada no momento da análise, pois 
70% dos casos de erros no laboratório de hemostasia acontecem nesta 
etapa 
 
 Embora os principais testes que avaliam a hemostasia no modelo 
convencional esteja bem padronizados. Deve-se considerar as suas 
limitações para uma adequada interpretação dos resultados 
 
 
 A utilização dos parâmetros da farmacocinética do FVIII e FIX na pratica 
clinica são relevantes, sobreduto para o seguimento da profilaxia e na 
avaliação de sucesso do protocolo de ITI 
Referências 
1. FAVALORO, E.J. Diagnosis and classification of von Willebrand disease: a review of the differential 
utility of various functional von Willebrand factor assays. Blood Coagul. 
Fibrinolysis, London, v. 22, n. 7, p. 553-564, 2011 
 
2. HAY, C. R. et al. The diagnosis and management of factor VIII and IX inhibitors: a guideline from 
the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization. Br. j. haematol., Oxford, v. 111, n. 1, p. 78-90, 
2006 
 
3. KITCHEN, S. ; MCCRAW, A.; ECHENAGUCIA, M. Diagnosis of hemophilia and other bleeding 
disorders: a laboratory manual. 2. ed. Montreal: WFH, 2010. 
 
4. BRASIL. Ministerio da Saude. Manual de diagnóstico e tratamento da doença de von Willebrand. 
Brasilia, Ministerio da Saude, 2006. 
 
5. BRASIL. Ministerio da Saude. Hemofilia congênita e inibidor, manual de diagnóstico e tratamento 
de eventos hemorrágicos. Brasilia: Ministerio da Saude, 2009 
 
6. VERBRUGGEN, B. et al. The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C 
inhibitors: improved specificity and reliability. Thrombosis and haemostasis, Sttutgart, v. 73, n. 2, p. 
247-251, 1995 
Obrigada !