Diagnóstico molecular em doenças infecciosas

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Prof. Dr. Antonio Carlos Pignatari
Laboratório Sergio Franco-DASA
Hospital 9 de Julho
Material biológico
• Sangue
• Líquor
• Urina
• Secreção respiratória
• Secreção de pele, subcutâneo e mucosas
• Fezes
• Líquido articular, pleural, pericárdico, ascite, humor 
aquoso e vítreo
• Biópsias
Testes rápidos para detecção do 
agente etiológico
� Microscopia
� Antígeno
� Anticorpo
� Acido nucleico: RNA, DNA
� Espectometria: Proteínas 
Testes rápidos
� Dengue
� HIV
� Influenza 
� Adenovirus
� Sincicial respiratório
� Estreptococo do grupo A
� Antígenos de meningococo, pneumococo, e haemophilus em líquor
� Pneumococo em urina e líquido pleural
� Estreptococo do grupo B em secreção vaginal
� Toxina A e B de Clostridium difficile
� Legionela em urina
� Monotest – mononucleose infecciosa
Microbiologia molecular 
diagnóstica
� Custo benefício para os pacientes 
� Custo benefício para o hospital 
� Custo benefício para o laboratório clínico 
� Custo benefício para o sistema de saúde público e 
privado 
Vantagens
� Alta sensibilidade e especificidade
� Possibilidade de quantificação
� Rapidez no processamento laboratorial
Pre-requisitos
� Necessidade de laboratório especializado em biologia 
molecular
� Equipe tecnica especializada
� Com exceção do GeneXpert
Plataformas de amplificação e 
detecção de ácidos nucleicos
� PCR convencional – gel de agarose, in house
� Real-time PCR – varios marcadores para emissão de 
sinal, curvas de amplificação com detecção 
computadorizada, formato simples ou multiplex, in 
house ou kits comerciais
� Microarray – multiplex
� Luminex – multiplex
� GeneXpert
� Sequenciadores – 16 S, 18 S
REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM 
CADEIA - PCR
�1983 - Kerry Mullis – Thermus aquaticus
�Oligonucleotideos iniciadores – primers
�Termocicladores – amplificação das cópias de DNA – 2n
T 94° C 72° C
52°C a 65° C
Saiki et al., 1988
Konena et al., 2006
Multiplex-PCR
Detecção de MβL
Mendes et al. J Clin Microbiol. 2007.
Diagnóstico Molecular 
em Amostras Clínicas
Kit comerciais In House
PLATAFORMA ROCHE PLATAFORMA APPLIED BIOSYSTEM
Amplificação do DNA - PCR EM TEMPO REAL
Equipamentos 
METODOLOGIA
SYBR GREEN
TAQMAN
FRET
METODOLOGIA
SYBR GREEN
TAQMAN
LightCycler® 7500 REAL TIME PCR SYSTEM
www.roche.com www.appliedbiosystems.com.br
Multiplex RT-PCR
Detecção de MβL
� SPM – 798 bp; 83,5° C
� SIM – 569 bp; 80,4° C
� VIM – 382 bp; 88,5° C
� IMP – 188 bp; 77° C
� GIM – 72 bp; 72° C
Mendes et al. J Clin Microbiol. 2007.
LUMINEX MULTIPLEX
Virus Respiratórios
Infecções intestinais - virus, bactérias, 
protozoários e toxinas (E. coli, Clostridium difficile, 
Toxina shiga-like)
Liquor - bactérias, vírus , fungos
Sangue – bactérias e fungos
Sequenciamento do gene blaKPC
Seqüência Editada Pesquisada no Banco do NIH utilizando o programa BLAST
Principais testes disponíveis para 
infecções virais
� Carga viral para HIV
� Carga viral para virus das hepatites B e C
� PCR qualitativo e quantitativo para CMV
� PCR para Influenza H1N1
� Painel Viral Respiratório
� PCR para Enterovirus
� PCR para Herpes virus : Herpes simples, Varicela 
zoster EB virus e CMV
� PCR para Parvovirus
� PCR para adenovirus
Principais testes disponíveis para 
infecções bacterianas
� PCR para Clostridium difficile
� PCR para Mycobacterium tuberculosis
� PCR para detecção de genes de resistência a
antimicrobianos : mecA, vanA, KPC, New Dehli, 
� PCR para Clamídea (trachomatis e pneumoniae) 
� PCR par Mycoplasma pneumoniae
� PCR para meningococo, pneumococo e haemophilus 
(liquor)
GENES DE RESISTÊNCIA A 
ANTIMICROBIANOS
� Bactérias Gram positivas:
• mecA – resistência a Betalactâmicos - Staphylococcus
• vanA; vanB – Resistência a Vancomicina - Enterococcus
� Bactérias Gram negativas:
• ESβL: blaCTX-M; blaTEM; blaSHV: Resistência aos Betalactâmicos com
excessão de Cefoxitina, Cefotetan e Carbapenêmicos
• Carbapenemases: blaKPC : Resistência a Carbapenêmicos
• Metalo-β-Lactamases: blaIMP; blaVIM; blaSPM : Resistência a 
Carbapenêmicos e Betalactâmicos (exceto monobactâmicos)
Silveira et al., 2006
Bush, 2010
Hackbarth et al., 1989
Background
Acute respiratory tract infection in children represents a high number on the World Health Organizations statistics data, the high incidence of respiratory tract infection is highly observed in developing countries including
Brazil. Viruses are recognized as the major cause of these infections and usually suspected in clinical practice. Emerging virus and new stains is well detected by Molecular Biology methods, the sensibility and specificity
allows Molecular Biology to detect more than one virus of the panel from the same sample allowing specific treatment.
Laboratory diagnosis of viral respiratory tract infections in a Children’s Hospital in São Paulo, Brazil, one year study.
Pignatari, A. C. C.; Cruz, S. E. M; Faro, L. B.; Gaburo, N.; Bousso, A.; Sapieza, A.; Lora, F. M.; Almeida, L. R.
References
1. Diniz, E.M.A; Vieira R.A; Ceccon M.E.J; Ishida M.A; Flávio Adolfo Costa Vaz F.A.C. Incidence of
respiratory viroses in preterm infants submitted to mechanical ventilation.
Methods
All results of respiratory virus panel of all pacients of a children´s hospital in the city of São Paulo Brazil from January to December 2013 were collected using the laboratory system Motion ®. The respiratory virus panel is
done by RT-PCR Microarray: CLART® Pneumovir. The molecular biology panel detects Influenza A, Influenza A H1N1 strain 2009, Influenza B, Parainfluenza1, 2, 3 and 4, Syncycial Respiratory Virus (SRV) A and B,
Adenovirus, Bocavirus, Metapneumovirus, Coronavirus, Enterovirus and Rhinovirus.
Results
1325 samples were tested on the respiratory virus panel, 1437 tests were positive Tab1,2,3 considering samples
with more than one positive virus. The months with higher positivity were from march to june these months
represent the colder seasons the begin of autumn and the begin of winter in Brazil. April showed the major
positivity, 28% when compared with the other months Tab2. The most frequent viruses identified were, SRV
36%, Bocavirus 14%, Methapneumovirus 7,2% and Adenovirus 6,3%. The samples analyzed were collected from
Children from 0 to 14 years old and the positivity in young children under 2 years old is observed in 80% of the
positive samples and on April that showed the highest positivity, 94%, the samples were from children under 2
yeas old.
Conclusion
The molecular panel detected a wide range of respiratory virus, including 2 stains of Influenza A
H3N2, this shows that molecular biology keeps the best methodology to identify respiratory tract
viruses. The results is given in two or three days, for over 90% of the samples the rapid test to
detect SRV were realized which is helpful for the primary clinical practice but the rapid test does not
have precise identification and it detects only one virus, the most important pathogen, other
important virus are only detected by the molecular panel.
Temporary Number: 958
Permanent Number: B-048
Title: Laboratory diagnosis of viral respiratory tract infections in a Children’s Hospital in São Paulo, Brazil, 
one
year study
Session: 10/Infectious Disease
JAN FEB MAR APR MAY JUN JUL AGU SEP OCT NOV DEC Total %
Adenovirus 5 2 14 19 18 10 4 2 3 4 5 3 89 6,30%
Bocavírus 4 6 17 54 47 35 8 10 8 6 3 3 201 14,00%
Enterovírus (echovírus) 4 6 17 24 8 8 3 0 0 3 3 2 78 5,50%
Influenza A 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 3 0,30%
Influenza A H1N1/2009 0 0 3 15 12 3 2 0 0 0 0 0 35 2,50%Influenza B 0 0 1 4 5 6 0 1 2 1 0 0 20 1,40%
Influenza C 0 0 2 3 o 2 0 0 1 0 0 0 8 0,60%
Methapneumovírus A 4 2 5 7 6 4 3 4 3 2 0 0 40 3,00%
Methapneumovírus B 3 2 11 5 6 10 6 4 2 8 2 0 59 4,20%
Parainfluenza 1 0 0 1 2 5 1 1 0 0 0 0 0 10 0,70%
Parainfluenza 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0%
Parainfluenza 3 2 3 2 7 7 3 3 2 4 2 1 4 40 3,00%
Parainfluenza 4 1 5 7 5 6 2 0 4 0 0 0 4 34 2,50%
Rhinovírus 10 18 43 67 37 39 18 26 7 8 5 9 287 20%
RSV A 4 19 75 165 84 33 28 10 1 6 1 4 430 29%
RSV B 1 1 23 37 27 5 3 1 2 3 0 0 103 7%
Total 38 64 221 414 269 162 79 64 33 43 20 30 1437 100,00%
JAN FEB MAR APR MAY JUN JUL AGU SEP OCT NOV DEC
Total of panel 60 69 175 288 252 181 132 56 38 46 22 75
Positive 34 (56%) 54 (78%) 149 (85%) 251 (87%) 174 (69%)102 (56%) 58 (43%) 31 (55%) 26 (68%) 27 (58%) 12 (54%) 20 (26%)
Number of Virus/ positive JAN FEB MAR APR MAY JUN JUL AGU SEP OCT NOV DEC
1 virus/ positive panel 31 45 92 131 107 56 37 22 19 14 5 13
2 virus/ positive panel 2 9 42 86 46 36 21 8 7 11 6 4
3 virus/ positive panel 1 0 14 26 14 7 0 1 0 2 1 3
4 virus/ positive panel 0 0 1 8 6 2 0 0 0 0 0 0
5 virus/ positive panel 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
Tab1. Number of processed panel and positive results
Tab2. Identified virus by RT-PCR Microarray – CLART Pneumovir
Tab3. Positive panel according with the number identified by test
GeneXpert®: The Molecular Lab in 
a Cartridge
�3 areas of assays
� Infectious Disease
�Oncology
�Genetic Disease
�All Testing Done Within Cartridge
� Sample Prep
� Amplification
�Detection
�Same Basic Cartridge 
Works With all Tests and GeneXpert®
Systems
GeneXpert cartridge: High 
complexity lab in a small package 
(FDA Moderate complexity)
A Better Way to Platform Design
GX-1 GX-4
GX-16
GeneXpert 
Infinity-48
GeneXpert®
Module
http://www.cepheid.com
Diagnóstico Molecular 
em Amostras Clínicas
Xpert SA Nasal Complete
Xpert vanA
Xpert C. difficile
Xpert MRSA/SA SSTI
Xpert MRSA/SA BC
Xpert MRSA
Xpert EV
Xpert GBS
Xpert HemosIL
Smart GBS
Kit comerciais - Cepheid’s Xpert 
27
Sample =vaginal swab
Solution: Rapid, reliable intrapartum test for GBS 
colonization
2. Reagent 1 into port 1
3. Reagent 2 into port 2
1. Break off swab in port 
labeled S for sample
Results starting at 35 min !
GGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTG TCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG
507
rpoB gene
533
* ** * * *** **** * *
81 base pair core region
** *** ** ****
*** **
**
Insertion
TTC
Insertion
TTCATG
Deletion
CCATTC
Deletion
GGCACC
Del
AAC
Deletion
CAGAAC
Deletion
GACCAG
Deletion
AATTCATGG
Deletion
GAACAA
Genetics of Rifampin Resistance 
in M. tuberculosis
Majority of mutations associated with rifampin resistance
Occur in 81 base pair (27 amino acid) region of rpoB (RNA polymerase gene)
Cepheid Gene Xpert® C difficile Assay
Place swab with stool into buffer vial, vortex, pipette into cartridge.
Close top and place into instrument.
• Rapid detection of toxin B gene in 
47 minutes
• 99% Sensitive, 91% Specific vs 
Direct Toxigenic culture
• Detects the 027 epidemic strain
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Inter-relatedness of Healthcare Associated 
Pathogens
Which is often treated with
clindamycin Which selects for
Which selects for
Which can donate
the vanA resistance
gene
Which may lead to
Clostridium 
difficile
VRE
MRSA
Which is treated with
oral vancomycin
VRSA (or VISA)
Surveillance Methods
Microbiology
Culture
• Least cost
• Medium labor
• Slowest TAT
BD Gene-Ohm
Conventional
Real time PCR
• Medium cost
• Most labor
• Run in batches
• Medium TAT
GeneXpert®
Real time PCR
• Highest cost
• Least labor
• Random access
• Rapid TAT
Previous gold standard (2+ day TAT)
Detection of Cytotoxin B direct from stool in cell culture
Normal, negative 
or toxin + antitoxin = 
neutralized (no effect)
Positive - CPE
Stool supernatant
<1% of U.S. labs doing this 
test and it takes at least 2 
days
Cell culture cytotoxin neutralization (CCCN)
Emergence of an epidemic strain 
BI/NAP-1/027
• Associated with hospital outbreaks of severe disease
• Associated with severe morbidity (toxic mega-colon, sepsis-
like syndrome)
• High case-fatality rate
• Fluoroquinolone resistant
• Produces >20x more toxin B (due to a deletion in TcdC toxin 
production regulatory gene) & a binary toxin
• Produces larger #s of spores, leading to larger inocula and 
easier transmission
REA PFGE PCR Ribotype
Toxinotype III
Enzyme immunoassays for toxins A&B
97% of U.S. labs doing this test !!
Takes < 2 hrs
Glutamate Dehydrogenase (GDH)
Clostridium difficile “common antigen” 
thought to be present in all strains
Cepheid Gene Xpert® C difficile Assay
Place swab with stool into buffer vial, vortex, pipette into cartridge.
Close top and place into instrument.
• Rapid detection of toxin B gene in 
47 minutes
• 99% Sensitive, 91% Specific vs 
Direct Toxigenic culture
• Detects the 027 epidemic strain
Phoenix ®
BD
MicroScan Walkaway ®
Dade Behring
Identificação 
Bacteriana
Vitek 2®
BioMérieux
Api ®
BioMérieux
RT-PCR
16s
MALDI-TOF na Microbiologia
Bactéria
(Amostra)
Proteínas
Carboidratos
Lipídios
DNA
RNA
…
MALDI-TOF
Espectro de Massa
Característica da
espécie
Impressão Digital
“fingerprint”
MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
Ionização Dessorção Laser 
Processo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz
Formação de íons 
Espécies químicas 
eletricamente carregadas
Liberação de uma 
substância de uma 
superfície ou através dela
Matriz 
Amplificação da luz 
estimulada por 
radiação
Molécula orgânica 
envolvida no processo 
de ionização e 
dessorção
Energia (comp. de onda) para o 
processo de dessorção
MALDI-TOF
Time of Flight
Tubo sob vácuo
Tempo de Vôo
+
MALDI-TOF
Time of Flight
Tubo sob vácuo
+
Tempo de Vôo
1 µL de matriz 
(ácido alfa-ciano-4 
hidroxicinamico)
10 mg/mL)
900 µL etanol 
absoluto
300 µL H2O
50µL ácido fórmico 
70% + 50µL 
acetonitrila
1 µL 
sobrenadante
2 min/13.000 
rpm
2 min/13.000 
rpm
MALDI Biotyper 2.0
Microflex LT MALDI-TOF Tempo de Análise:
1 minuto por amostra
Tempo de extração da amostra:
5 minutos
Alça
Transferência
direta da colônia
Ponteira Swab
Tempo de preparo:
segundos
+ 1 µL de matriz 
Carbonnelle et al. Clin Biochem. 44:104-109, 2011.
Espectros de Massa
Diferentes 
Microorganismos
Diferentes Espectros 
de Massa
Identificação da espécie
Seleção da colônia
Inoculação
na placa de MALDI-TOF
Microrganismo 
desconhecido
?
Interpretação dos dados
Geração de um
Espectro protéico
MALDI-TOF em Etapas
Limitações
� Banco de Dados
� Fungos filamentosos
�Microorganismos com parede espessa
� Testes de sensibilidade
� Número de células (mínimo 104)
Vantagens
� Custo
� Fácil implementação
� Fácil manuseio
� Tempo
� Confiável
� Paciente
�R$ 0,40 por amostra
�Somente instalação elétrica
�Não gera resíduos
�Simples preparação da amostra
�Software – simples operação
�Não precisa de especialista em massas
�Apresenta ¼ do custo de outras metodologias
� Preparo de placa e resultados 
(entre 1 - 2 horas / 96 amostras)
� Acima de 98% de acurácia
� Diminui o custo
� Diagnóstico e terapia em menor tempo
Identificação (MALDI-TOF MS) + Teste de Sensibilidade
Painéis para uso comunitário
� Infecções respiratórias
� Infecções intestinais
� Infecções de SNC
Painéis para usohospitalar
� Infecções respiratórias
� Infecções intestinais
� Infecções de SNC
� Infecções de corrente sanguínea
� Culturas de vigilância
Pneumonia bacteriana
Acinetobacter baumannii
Bordetella pertussis
Chlamydophila pneumonia
Haemophilus influenza
Haemophilus influenza (Type B)
Klebsiella pneumonia
Legionella pneumophila
MRSA - Meth. resistant S. aureus
PVL gene
Moraxella catarrhalis
Mycoplasmapneumonia
Neisseria meningitides
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumonia
Streptococcus pyogenes Group A
Virus respiratórios
Coxsackie viruses/echovirus
Adenovirus types 3, 4, 7, 21
Human Bocavirus
Human Coronavirus
Human metapneumovirus
Influenza A - Human influenza
Influenza A - H1N1-09
Influenza B 
Parainfluenza virus type 1,2,3,4
Respiratory syncytial virus A
Respiratory syncytial virus B
Rhinoviruses
Pneumonia atípica:
Bordetella pertussis
Chlamydophila pneumonia
Legionella pneumophila
Mycoplasma pneumoniae
� Infecções em ambiente hospitalar
� Acinetobacter baumannii
� Enterobacter aerogenes
� Enterobacter cloacae
� Enterococcus faecalis
� Enterococcus faecium
� Escherichia coli
� Klebsiella pneumonia
� Proteus mirabilis
� Pseudomonas aeruginosa
� Serratia marcescens
� Stenotrophomonas maltophilia
� Streptococcus pyogenes Group A
� MRSA - Meth. resistant S. aureus
� Staphylococcus aureus
PVL gene
� Methicillin resistant coag. neg. Staph
� Coagulase negative Staphylococcus
� Staphylococcus epidermidis
�
Cultura de Vigilância
�MRSA
�ESBL
�VRE
Is repeat test needed for the diagnosis of Clostridium difficile 
infection if PCR is the method?
Robert F. Luo, Niaz Banaei (Stanford UMC)
J. Clin. Microbiol. 2010. 48:3738-
Result following 
the first test with a 
negative result
293 patients (24% of all pts)
406 repeat tests (ave. 1.5/pt)
PCR Sens 87.2%; Spec 98.6%
7 new TP’s at ≥7 
days
<1% repeat tests 
gave + result <7 
days