Eletroforese - Killarney

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Eletroforese, Imunoeletroforese e 
Cromatografia
Prof. Dr. Killarney Ataide Soares 
Eletroforese
- Envolve a separação de compostos
carregados por meio da carga elétrica.
Eletroforese
- Carga elétrica: varia de substância para
substância e do meio (básico, ácido, neutro).
1 – Generalidades
- Aplica-se carga elétrica de alta voltagem.
a) Fonte de energia (“Power supply”);
Eletroforese
b) Cuba eletroforética: acrílico ou outro
plástico. Contém 2 pólos metálicos;
2 – Componentes sistema eletroforético
c) Aplicadores: da amostra. Pipetas, tubos
capilares;
d) Corantes: brometo de etídio (cancerígeno)
e nitrato de prata;
e) Densitômetro: mede as frações de
proteínas separadas
Eletroforese
f) Fotocolorímetro ou espectrofotômetro: mede
as frações na solução eluída*;
2 – Componentes sistema eletroforético
* Eluído é qualquer substância retirada com o auxílio
de outra substância num sistema de eletroforese;
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g) Suporte da amostra: papel (especial) ou
géis (amido, agarose). É o local onde a
amostra será “corrida” e separada.
Eletroforese
h) Tampão: solução que mantém o pH
constante.
2 – Componentes sistema eletroforético
- Formada por um ácido fraco e um sal desse ácido
ou uma base fraca e seu sal. Ex: ácido fosfórico
(H3PO4) e fosfato de sódio (NaH2PO4).
Eletroforese
Se adicionado HCl:
H+Cl- + Na+H2PO4-→ H3PO4 + NaCl
2.1 – Solução tampão
Se adicionado NaOH:
Na+OH- + H3PO4→ NaH2PO4+ H2O
1) Submissão de uma solução à um campo
elétrico.
Eletroforese
Cátions (+) se dirigem ao polo negativo (cátodo) 
e Ânions (-) vão para o polo positivo (anodo).
2.1.1 – Princípio
2) As substâncias são levadas pela corrente
elétrica em função da sua carga elétrica.
Figura 1: Componentes do sistema de
eletroforese: cuba (A), suporte do gel com os
polos (B), vidros do suporte do gel (C), pentes
(D), borrachas de vedação dos vidros do suporte
(E), tampa (F) e cabos de força (G)
A
B
C D E
F
G
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Figura 2: Cuba de eletroforese.
Gel de agarose
(transparente) no interior
da cuba eletroforética.
A amostra é 
inserida nos 
poços formados 
pelos dentes do 
“pente” (plástico 
branco)
Figura 3: Sistema de eletroforese: cuba e fonte de
energia.
Cuba de eletroforese para
separação das frações
protéicas de uma amostra.
Gel de agarose no interior
da cuba eletroforética.
Figura 4: Gel de agarose (contendo trechos de
DNA), após corrida eletroforética e coloração pelo
brometo de etídio. O gel é visualizado dentro de
um aparelho transiluminador que emite luz
ultravioleta (UV).
Figura 5: Gel de agarose (contendo as proteínas
diversas separadas), após corrida eletroforética e
coloração pelo nitrato de prata.
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- Separação e quantificação de frações das
proteínas do organismo humano.
Eletroforese
- Síndromes renais, estados nutricionais,
doenças hepáticas, alguns tipos de câncer
etc…
3 – Usos 4 – Propriedades das proteínas
4.1 - Cargas elétricas
Resultado da somatória das cargas de cada
aa;
Grupamentos laterais também participam;
Quando a carga líquida = zero num
determinado pH, têm-se o ponto isoelétrico
(pI).
Eletroforese
4.1 – Carga elétrica das proteínas
- Proteínas com pI > 7� básicas (-);
- Proteínas com pI < 7� ácidas (+);
- A carga elétrica total define a forma de
separação;
- Existem 4 frações protéicas separáveis:
albumina, α, β e γ.
Eletroforese
Peso molecular
Fração globulínica Albumina
Eletroforese
HDL
LDL
VLDL
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Zona albumina
Eletroforese de proteínas
• Função da albumina: manter a pressão oncótica e
transportar substâncias endógenas e exógenas
(PM 66.000). Marcadora de funcionamento
glomerular e da barreira hematoencefálica.
• Hipoalbuminemia: hepatopatias; perdas renais;
perdas intestinais; subnutrição. Seus níveis podem
ser influenciados por: hemoconcentração, postura
e idade.
• Coloração evidente na eletroforese a partir de 2,5
g/dL
• Referência: 3,2 a 5,0 g/dL
Zona albumina
Eletroforese de proteínas
Inter-zona albumina-alfa1
Eletroforese de proteínas
Inter-zona albumina-αααα1 globulina
• α1–Alfa-fetroproteína: Aumento: defeitos do tubo
neural; carcinoma hepatocelular, tumores de células
germinativas, hepatoblastoma e cólon.
Deficiência: S. de Down.
Metodologia: Imunofluorometria.
• α1–antitripsina: proteína de fase aguda (artrites e
vasculites). Deficiência (genética): associada a
doenças hepáticas e pulmonar (enfisema).
Metodologia: Nefelometria.
Eletroforese de proteínas
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• α1-Glicoproteína ácida: proteína de fase aguda.
- Aumentada em artrite reumatóide, LES,
neoplasia malignas e IAM;
- Diminui por má nutrição, estrogenoterapia, grave
lesão hepática e gastroenteropatias com grave
perda de proteínas.
Metodologia: Nefelometria
Inter-zona albumina-αααα1 globulina
Eletroforese de proteínas
Zona alfa2
Eletroforese de proteínas
• α2-macroglobulina: inibidora de proteases.
Aumentada na CID; diabetes, estrogenoterapia e
gravidez. Diminuída em hepatopatias crônicas e s.
nefrótica.
Metodologia: nefelometria.
• Haptoglobina: proteína hepática. Transporta Hb livre
até o SRE. Aumentada durante os processos
inflamatórios e diminuída em síndromes hemolíticas.
Metodologia: Nefelometria.
Inter-zona albumina-αααα2 globulina
Eletroforese de proteínas
• Ceruloplasmina: é fixadora de cobre. Está diminuída
nas anemias e Doença de Wilson. Aumentada em
neoplasias malignas; proteína de fase aguda tardia.
Nefelometria.
Inter-zona albumina-αααα2 globulina
Eletroforese de proteínas
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Zona beta 1
Eletroforese de proteínas
• Transferrina: transporta o Ferro do intestino até os
tecidos. Está aumentada na depleção de Fe e
diminuída nas perdas protéicas e hepatopatias
crônicas.
Metodologia: Indireta (cálculo) ou Imunoprecipitação
enzimática.
• C4-complemento: mediador de resposta imune;
Diminuição: deficiência imunitária. Aumento: LES e
glomerulonefrite. Monitoração em transplantados.
Peculiaridade: soro deve ser congelado
imediatamente. Metodologia: Nefelometria.
Zona β1-globulina
Eletroforese de proteínas
Zona beta 2
Eletroforese de proteínas
• β2-microglobulina: encontrada na superfície das
células nucleadas. Pertence complexo HLA 1.
Aumentada: na IR, mieloma e neoplasias (ligadas
a linfócitos B).
Metodologia: Quimioluminescência.
• C3-complemento: mediador de resposta imune;
indicador de reações de fase aguda ou de
deficiência imunitária. Monitorização em
transplantados.
Metodologia: Nefelometria. Soro congelado deve ser
congelado rapidamente.
Eletroforese de proteínas
Zona β2-globulina
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• Fibrinogênio: origem hepática. Conversão à
fibrina.
Diminuído: deficiências hereditárias e CID.
Aumentado: fase aguda e terapias hormonais
(estrogênicas e androgênicas).
Metodologia: Coagulométrico.
Eletroforese de proteínas
Zona β2-globulina
• IgG, IgA, IgM, IgD, IgE:
- Aumentadas em hepatopatias, mielomas,
sarcoidose, parasitoses e alergias.
-Diminuídas na AIDS, síndrome nefrótica.
Metodologia: Nefelometria.
• Proteína C-reativa: Aumentada: doenças agudas
(bacterianas, reumáticas), doença arterial
coronariana (prediz IAM) e Doença de Chron.
Zona γ-globulina
Eletroforese de proteínas
• Proteína C-reativa: 2 tipos: Normal (0,4-0,5
mg/dL) e Ultrasensível* (a partir de 0,09 mg/dL).
Aumentada: doenças agudas (bacterianas,
reumáticas), doença arterial coronariana* (prediz
IAM e AVC) e Doença de Chron.
Zona γ-globulina
Eletroforese de proteínas
• Proteína C-reativa:
- DAC: deposição gordura e formação de placas
em vasos � � PCR US
- IAM: já ocorrido � � PCR US, de acordo com
área afetada.
- Risco cardiovascular: Baixo (PCRUS < 1mg/dL),
Médio (entre 1 e 3) e Alto (> 3 mg/dL).
- Considera-se o risco em conjunto c/ outras
dosagens: Col. Total, Relação CT/HDL,
homocisteína e Apo-B100) e AUSÊNCIA DE
OUTRAENFERMIDADE INFLAMATÓRIA!)
Zona γ-globulina
Eletroforese de proteínas
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Perfis eletroforéticos patológicos:
a) Mau fornecimento protéico: albumina↓ , α1 e
α2↑, β↓, γ↑
b) Perdas protéicas – Síndrome Nefrótica: albumina
↓↓ , α1↑, α2↑↑, β↓, γ (varia)
c) Hepatite crônica: albumina↓, γ↑
d) Hepatite aguda: albumina↓ ou normal, α1↑, α2
normal ou ↓, β e γ↑
e) Cirrose: albumina↓↓ , α1↓,α2 normal ou ↓, β↓,
fusão das frações β e γ
Eletroforese de proteínas
- Separação das proteínas transportadoras de
lipídios: HDL, LDL e VLDL.
- Usos: diagnóstico de dislipidemais.
DESVANTAGENS:
- Limitações metodológicas;
- Alto custo;
- Substituição por: perfil lipídico, lipoproteína A, A-
1 e B-100.
Eletroforese de lipoproteínas
Peso molecular
Fração globulínica Albumina
Eletroforese de lipoproteínas
HDL
LDL
VLDL
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Interações 
antígeno-anticorpo
Detecção, quantificação e
caracterização dos anticorpos e
seu uso como ferramenta para
pesquisa e diagnóstico.
1) Reagentes não marcados
• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA 
• Imunofluorescência
• Western Blotting
Interações 
antígeno-anticorpo
PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Contra-imunoeletroforese
AGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
IMUNOENSAIOS
- RIE
- ELISA 
- Imunofluorescência
- Citometria de Fluxo
- Western Blotting
Interações 
antígeno-anticorpo
Definição: técnica que emprega uma combinação de
eletroforese de proteínas e interação antígeno-
anticorpo.
Características:
- Uma reação Ag-Ac forma precipitado;
- Ag e Ac devem ser bivalentes;
- Deve existir equivalência entre Ag e Ac (visando o
máximo de precipitado).
Imunoeletroforese
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Definição: tipo de imunoeletroforese na qual Ag e Ac
tem cargas opostas e migram em sentido contrário
em meio gel quando submetidos à carga elétrica.
Características:
- Alta sensibilidade (97%) e especificidade (95%);
- Teste qualitativo;
- Rápidez;
- Utilizado para diversas situações clínicas em que se
deseja a detecção de anticorpos.
Contra-imunoeletroforese
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Etapas:
1) Um determinado antígeno é colocado em tampão
sob influência de um campo elétrico;
2) Em outro poço (perpendicular ao Ag) é colocado o
anti-soro;
3) Ao serem submetidos à corrente elétrica, Ag e Ac
migram em direções opostas;
4) Ag e Ac formam arcos de precipitação ao se
encontrarem.
Contra-imunoeletroforese
Interpretação:
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Contra-imunoeletroforese
Ag
Ac
Paraproteínas (imunoglobulinas
monoclonais)
• Definição: polímeros, monômeros ou fragmentos
de moléculas de imunoglobulinas (proteínas de
Bence Jones);
• Usos: diagnóstico de mieloma múltiplo ou
macroglobulinemia de Waldenström;
• Dosagens: eletroforese em agarose (soro ou urina
concentrada), imunoeletroforese ou eletroforese de
imunofixação).
Contra-imunoeletroforese
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Eletroforese de
proteínas séricas em
gel de agarose,
(1) hipergamaglo-
bulinemia em
processo inflamatório;
(2) e (3):
fracionamento
normal;
(4) gama monoclonal
no mieloma múltiplo.
- Definição: método analítico que permite a
identificação das diferentes frações normais e
patológicas da hemoglobina.
- Princípio: A Hb é separada, de acordo com
sua migração, em um meio sólido (acetato de
celulose), quando submetida a um campo
elétrico.
Eletroforese de hemoglobinas
- Usos:
a) Investigar a presença das hemoglobinas anormais
como a hemoglobina S e C.
b) Nas talassemias que podem cursar com aumento da
HbA2 e com a presença da HbH.
c) Quantificação das frações normais da hemoglobina
como A, A2 e Fetal.
- Peculiaridade: É realizada em pH alcalino e pode ser
realizada, de forma complementar, também em pH
ácido: melhor separação entre hemoglobinas S e C
das HbD e HbE.
Eletroforese de hemoglobinas Eletroforese de
hemoglobinas em gel
de agarose (alcalina):
(1)Hb AF de talassemia
beta maior;
(2)Hb S/beta talassemia
(3)Hb AA2 e Fetal em
talassemia beta menor;
(4)Hb AS (traço
falciforme);
(5)Hb AA (normal).
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Cromatografia
• Definição: método físico-químico de separação.
• Princípio: baseada na migração diferencial dos
componentes de uma mistura, que ocorre devido
a diferentes interações, entre duas fases
imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária.
• Tipos (quanto à forma):
1) Planar: Cromatografia em Papel (CP), Centrífuga
e Camada Delgada (CD);
2) Coluna.
Cromatografia
• Tipos (quanto à fase móvel empregada):
1) Gasosa (CG)
2) Líquida: subdividida em
a) Cromatografia líquida clássica (CLC): fase
móvel “corre” por gravidade.
b) Cromatografia líquida de alta performance
(HPLC): fase móvel é submetida à alta pressão.
3) Supercrítica (vapor altamente aquecido – CSC)
Cromatografia Cromatografia
• Usos:
a) Cromatografia em coluna líquida clássica:
hemoglobina glicada.
b) Cromatografia líquida de alta performance:
- Metabólitos: ácido 5-hidróxi-indolacético (tumores
neuroendócrinos), ácido homovanílico e ácido
vanil-mandélico (neuroblastoma, feocromocitoma),
beta-caroteno (precursor Vit. A), Homocisteína
(aterosclerose) e Vitaminas A, C, D e E.
- Quantificação: aminoácidos e hemoglobinas.
c) Cromatografia em camada delgada:
- Qualitativo: carboidratos na urina (desordem
metabolismo).