Aula 08 Extração e Quantificação de Ácidos Nucleicos (DNA e RNA)

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Docente: Dyego Miranda
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Todo procedimento laboratorial envolvendo análise de DNA ou RNA tem que passar pelo processo de extração;
Diferentes etapas são necessárias para se obter o DNA ou o RNA purificado.
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No geral, toda extração de DNA se baseia em 4 etapas básicas, presentes em qualquer protocolo de extração;
Etapas:
Lise das membranas lipídicas
Purificação do DNA
Precipitação do DNA
Reidratação do DNA
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Lise das membranas lipídicas
Membranas: fosfolipídios + proteínas
Rompimento da membrana celular e dos compartimentos membranosos (organelas);
Provocada por uma solução detergente 
Ex.: dodecil sulfato de sódio (SDS)
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Purificação do DNA
Remoção dos componentes celulares  Proteínas e organelas e restos celulares;
Proteinase K  Desnaturação das proteínas
Fenol  Remove proteínas e outros contaminantes da solução aquosa do DNA;
Clorofórmio  Ajuda a desnaturar proteínas e a remover o fenol residual;
NaCl2  O sal ajuda a manter as proteínas dissolvidas no líquido extraído, impedindo que elas precipitem com o DNA.
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Precipitação do DNA
DNA é solúvel em água, mas é insolúvel em álcool;
Usa-se etanol para precipitar o DNA;
Quanto mais gelado o etanol, menos solúvel o DNA vai estar;
Retira-se o álcool para a formação do pellet 
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Reidratação do DNA
Após a retirada do álcool, o DNA precisa se solubilizar em algum solvente: H2O ultra-pura ou TE;
O solvente de reidratação servirá para armazenamento do DNA extraído;
Deve ser livre de contaminantes e enzimas capazes de destruir o DNA (DNASE-free);
Armazenar o DNA a -20℃ (RNA  -70℃).
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Após a extração, é necessário determinar a concentração de DNA extraído;
Geralmente feito por espectrofotometria ou algum outro equipamento mais avançado (nanodrop, picodrop)
O DNA possui leitura de absorbância em um comprimento de onda na faixa de 260nm;
As proteínas possuem uma leitura de absorbância na faixa de 280nm;
Razão 260/280nm mostra a pureza do material extraído:
≥1,75 – 1,8 = material de boa qualidade (puro)
<1,75 = contaminação por lipídeos e/ou proteínas
Na extraçao de RNA a razão 260/280nm ideal = 2 
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