Análise Molecular

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CENTRO DE ESTUDOS SUPERIORES DE MACEIÓ – CESMAC
Prof. MsC. Moezio de Vasconcellos Costa Santos Filho
Maceió - 2014
TÉCNICAS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE MOLECULAR
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Análise Molecular
	
	Eletroforese
	→ Eletroforese em gel;
	→ Eletroforese Capilar.
	
	Técnicas de Hibridização
	→ Southern Blot; 
	→ Northern Blot;
	→ Western Blot.
	
	
		
	 
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Análise Molecular
	
	Eletroforese:
	→ Separação de moléculas conforme o tamanho, a forma e a carga;
	→ Primeiro passo antes do Sequenciamento de DNA ou de técnicas Blot.
	Componentes básicos:
	
	→ Cuba de Eletroforese;
	→ Fonte liberando carga elétrica;
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Análise Molecular
	 → Componentes básicos:
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Agarose:
	→ Minigéis;
	→ Rede de polimerização (%);
	→ Horizontais;
	→ Submarinos;
	→ DNA, RNA e Proteína.
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Agarose (componentes/reagentes):
		
		→ Amostra (extraída, amplificada, purificada);
		→ Marcador de peso molecular (100pb, 50pb, 25pb);
		→ Controle positivo;
		→ Controle negativo;
		→ Azul de bromofenol / Xileno cianol (traçadores);
		→ BrEt (mutagênico);
		→ Transluminador UV.
	Obs.: Análise de fragmentos de maior peso molecular.
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Transluminador UV
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Análise Molecular
 Eletroforese em gel de Agarose (quantificação - DNA extraído):
		→ Amostra apenas extraídas;
		→ Objetivo de quantificação não específica;
		→ Teste de eficiência de extração;
		→ Nível de degradação do DNA.
	
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
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Análise Molecular
Eletroforese em gel de Agarose (diagnóstico - DNA amplificado):
		→ Amostra apenas amplificadas;
		→ Objetivo de rastreamento de DNA específico;
		→ Teste de eficiência de extração e amplificação;
		→ Identificação do peso molecular pelo marcador.
	
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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“Amplificação de uma única região.”
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Análise Molecular
 Eletroforese em gel de Agarose (quantificação - DNA purificado):
		→ Amostra purificadas;
		→ Objetivo de quantificação específica e ensaio de diluição;
		→ Teste obrigatório para Sequenciamento genético;
		→ Comparação por intensidade das bandas com o marcador;
		→ Low DNA Mass Ladder .
	
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Espectofotômetro 
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Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Poliacrilamida (Prata):
		→ Acrilamida + Bis-acrilamida (rede de polimerização [%] );
		→ Géis maiores;
		→ Verticais
		→ DNA, RNA e Proteínas;
		→ Não são submersos;
		→ Método complexo e longo;
		→ Utilizado para identificação Humana. 
	Obs.: Análise de fragmentos de menor peso molecular.
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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 Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Poliacrilamida (Componentes/reagentes):
		→ Amplicons (Marcadres para identificação Humana); 
		→ Marcador de peso molecular (100pb, 50pb, 25pb);
		→ Controle positivo;
		→ Controle negativo;
		→ Azul de bromofenol / Xileno cianol (traçadores);
		→ Nitrato de prata (neurotóxico);
		→ Placa de luz reveladora.
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Análise Molecular
 Genoma
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13 Marcadores Recomendados pelo FBI
CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539
D18S51
D8S1179
D3S1358
FGA
VWA
AMEL
AMEL
D16S539
D18S51
D13S317
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/
Human Genome
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Marcadores genéticos do Cromossomo Y
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“Amplificação de várias regiões.”
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Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Poliacrilamida (Vínculos genéticos):
		→ Identificação de paternidade;
		→ Compartilhamento de alelos;
		→ Estudo dos locus gênicos;
		→ Identificação de pessoas desaparecidas.
		
		
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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→ Amostras de referência;
→ Amostras questionadas.
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Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Poliacrilamida (Casos criminais):
		→ Identificação de um possível agressor;
		→ Obtenção do perfil genético;
		→ Inocentar pessoas falsamente acusadas;
		
		
		
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Primeiro caso criminal solucionado utilizando Eletroforese em gel de Poliacrilamida e DNA.
Colin Pitchfork
Linda Mann – 1983
Dawn Ashworth – 1985
Leicester - Inglaterra
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DNA fingerprinting – Allec Jeffreys
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Análise Molecular
	Eletroforese em gel de Poliacrilamida 
	(Tipagem genética de microorganismos):
	→ Endonucleases de restrição (RFLP):
	 	- Pst I, Dde I, Rsa I e Hae III;
	 	- 1h a 37º C.
	→ Vantagens:
 	
		 - Fornecimento de informações complementares;
	 	 - Permite a diferenciação de co-infecções simples e múltiplas. 		
		
		
		
	
	
	
	
	
	
	
		
	 
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Análise Molecular
 Eletroforese em gel de Poliacrilamida
 → Endonucleases de restrição (RFLP):
	
	 
	 
	 
	
		
	 
Extremos rombos
Extremos coesivos
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	Algoritmo de Genotipagem Original
	
	- Genotipagem do microorganismo;
	- Identificação de tipos freqüentes;
	- Identificação de co-infecções.
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HPV
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