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Arlindo Ugulino Netto –IMUNOLOGIA I – MEDICINA P3 – 2008.2 1 FAMENE NETTO, Arlindo Ugulino. IMUNOLOGIA ATIVAÇÃO DOS LINFÓCITOS T (Professora Karina Karla) Da mesma forma que acontece com a clula B, os linfcitos T tambm participam da resposta imune, seja ela humoral ou celular. A ativao e fases efetoras das respostas imunes adquiridas medidas pelas clulas T so desencadeadas pelo reconhecimento do antgeno especfico pelos LT. ESTGIO DE MATURAO DO LINFCITO T Assim como os LB, o LT oriundo da linhagem linfide originada a partir de uma stem cell, presente na medula ssea, que apresenta marcadores fenotpicos prprios que a caracterizam como uma clula imatura e indiferenciada: presena do CD44 e aus ncia do CD25. Em um prximo passo do desenvolvimento, j no timo, h um ganho do CD25, diferenciando-se na chamada Célula Pró-T que, com o passar de um certo tempo, diferencia-se em Célula Pré-T. Se a clula apresenta CD25 (que um receptor de IL-2, principal citocina de ativao de LT), significa dizer que esta se encontra no timo. No timo, inicia a expresso das molculas co-estimuladoras nessas clulas (que eram previamente “duplo negativa”) e passam a ser designadas como células T duplo-positivo, apresentando CD8 e CD4. Esse carter duplo positivo determina a sua semi-maturao. Nesta fase, h o incio da expresso do TCR e do CD3. Em seguida, com os processos de seleo positiva e negativa do timo, h a perda de um dos grupos de diferenciao do LT, tornando-o LT uno- positivo ou Linfócito T imaturo (LT citotxico: CD8+CD4-; ou LT auxiliar: CD8-CD4+). No momento em que o LT imaturo cai na corrente sangunea, ele sofre sua maturao final, tornando- se Linfócito T maduro. Estando maduro, j como LTc ou LTa, estas clulas seguem na corrente sangunea. A ativao destas clulas necessita somente do reconhecimento dos complexos peptdeo-MHC pelo receptor da clula T (TCRαβ ou TCRγδ, sendo o primeiro mais comum) e as interaes das molculas acessrias das clulas T com seus ligantes nas APCs. OBS: A maturao dos timcitos (LT) pode ser seguida de alteraes na expresso dos co-receptores CD4 e CD8. A figuda ao lado mostra a anlise de fluxo citomtrico (FACS) de duas cores do timcito pelo uso de anticorpos anti-CD4 e anti-CD8, cada um deles marcado com um diferente flurocromo. As porcentagens de todos os timcitos que contriburam para cada populao principal so mostradas nos quatro quadrantes e as porcentagens das subpopulaes so indicadas nos colchetes. A subsrie menos madura a das clulas CD4-CD8- (duplo-negativas). Esses timcitos amadurecem em CD4+CD8+ (duplo-positivas) que representam a populao mais numerosa do timo, e essas clulas amadurecem em clulas CD4+CD8- uno-positivas ou em CD4-CD8+. Arlindo Ugulino Netto –IMUNOLOGIA I – MEDICINA P3 – 2008.2 2 RECEPTORES E CO-ESTIMULADORES DOS LINFCITOS TCR: sintetizado por genes altamente polimrficos. O TCR responsvel pelo reconhecimento do antgeno restrito ao MHC. CD3: molcula que caracteriza os LT e est ligada no-covalentemente ao TCR. Compe o complexo TCR juntamente a cadeia ζ e TCR e particpa da transduo do sinal. Cadeia ζ (zeta): tambm est ligada ao TCR, assim como o CD3, por meio de uma ponte de dissulfeto. Tambm responsvel em parte pelos eventos bioqumicos que induzem a ativao funcional dos LT. CD4/CD8: so co-receptores envolvidos na ativao de clulas T restritas ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC). CD28: co-estimulador de membrana que transduz sinais que funcionam em conjunto com os sinais liberados pelo complexo TCR para ativar as clulas T virgens. Integrinas: so protenas heterodimricas expressas nos leuccitos, cujos domnios citoplasmticos ligam-se com o citoesqueleto da outra clula que compe a sinapse imunolgica, aumentando assim a durao do tempo de interao. ATIVAO DE LT VIRGEM E LT EFETOR Aps ser produzida na medula, amadurecida no timo e chegar aos tecidos perifricos e linfonodos, a clula T virgem encontra-se pronta e com os marcadores adequados para ativar-se por meio da interao com antgenos. Para isso, a APC, aps captar e processar o antgeno, realiza a apresentao antignica, via MHC-peptdeo, apresenta e ativa o LT. Essa apresentao deve ter o mximo de eficcia possvel, uma vez que o LT ainda virgem. Para tanto, a APC mais qualificada para esta tarefa a clula dendrtica que, de fato, realiza esse papel. Aps este processo de apresentao e ativao no linfonodo, o LT ativo deve migrar para os possveis focos de infeco por este antgeno e sofre outra apresentao ao agente invasor, mas esta apresentao no necessita ser to eficaz, podendo ser realizada por qualquer tipo de APC (macrfago, clula dendrtica ou LB), ativando ainda mais o LT o qual exercer a sua funo efetora. O fato do LT estar ativo, faz com que ele possa seguir duas funes distintas: (1) agir e realizar a sua funo citotxica (LT CD8+) ou sua funo auxiliar e ativadora de LB e macrfagos (LT CD4+); (2) reconhecer e diferenciar-se em clulas de memria para que, na prxima infeco por este antgeno, haja uma resposta de forma mais rpida e eficaz. Na ativao da clula T, h uma transduo do sinal que tem como uma de suas respostas efetoras, uma maior expresso do CD25, receptor de IL-2 (esta citocina tambm passar a ser produzida pelo prprio LT). Isso gera, cada vez mas, uma maior e mais eficaz ativao desses linfcitos T, desencadeando uma expanso clonal, para uma resposta mais eficaz contra o agente invasor. PAPAEL DOS CO-ESTIMULADORES NA ATIVAAO DOS LT A proliferao e diferenciao das clulas T requer sinais que as molculas co-estimuladoras enviam para as APCs, alm dos sinais induzidos pelo antgeno. H, como j vimos, um mecanismo envolvendo dois sinais: (1) o primeiro sinal expedido pelo MHC-peptdeo e TCR (e ao co-receptor CD4 ou CD8), culminando no sinal 1; (2); o segundo sinal para a ativao da clula T fornecido por molculas chamadas co-estimuladoras, porque funcionam em conjunto com o antgeno para estimular as clulas. Arlindo Ugulino Netto –IMUNOLOGIA I – MEDICINA P3 – 2008.2 3 A via co-estimuladora mais bem caracterizada na ativao da clula T envolve o CD28, uma molcula de superfcie das clulas que se liga s molculas co-estimuladoras B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), expressas nas APCs ativadas. O CD28 libera sinais que facilitam muitas respostas das clulas T ao antgeno, incluindo a sobreviv ncia da clula, a produo de citocinas (tais como a IL-2 que vai ativar a mesma clula que o produziu via CD25), e a diferenciao das clulas T virgens em clula efetoras. Quando o LT ativado, h a expresso de CD40L por ele, que se liga ao CD40 que j estava expresso na APC. Quando ocorre a interao do CD40-CD40L, h um sinal para a APC para que ela expresse mais co-estimuladores, como o B7, que interage com o CD28 pr-existente no LT, aumentando ainda mais a interao na sinapse imunolgica. Este conjunto de interaes, somado secreo de IL-2 e citocinas (que ativam ainda mais o LT), o suficiente para a ativao extrema e efetiva das clulas T. TRANSDUO DE SINAL NA ATIVAO DOS LT A transduo de sinais pelo TCR estabelece a relao entre o antgeno e as repostas funcionais. O reconhecimento do antgeno inicia uma seq ncia de sinais bioqumicos nas clulas T que resultam na ativao transcricional de genes especficos e a entrada das clulas no ciclo celular. A resposta celular das clulas T aos antgenos consiste de distintos estgios: eventos de membrana, que ocorrem dentro de segundos aps o reconhecimento do antgeno; vias de transduo de sinais citoplasmticas, que so ativadas dentro de minutos; e transcriode novos genes, que detectvel dentro de algumas horas. Inicialmente, h a apresentao antig nica: MHC-peptdeo-TCR. O CD4/CD8, por sua vez, liga-se a uma regio especfica no-polimrficas do MHC da APC por sua extremidade extra-citoslica, ao passo em que a sua extremidade citoslica (cauda) apresenta uma protena tirosina- quinase (representada na figura pela Lck, da famlia da Src). Esta Lck colocada ento na proximidade dos ITAMs nas cadeias CD3 e da ζ, fosforilando as tirosinas desses ITAMs. A tirosina fosforilada das ITAMs na cadeia ζ torna-se local de ancoramento especfico para uma tirosina quinase chamada de ZAP-70 (semelhante ao Syk os LB), uma protena tirosina-quinase diferente da famlia da Src. Esta ZAP-70 contm dois domnios conservados, designados como domnios Src de homologia-2 (SH2), que podem se ligar s fosfotirosinas. Cada ITAM da cadeia ζ deve possuir pelo menos dois resduos de tirosina fosforilada para servir de doca para uma molcula de ZAP-70. Ao sofrer interao por estes resduos fosforilados, a ZAP-70 se fosforila e adquire sua prpria atividade de tirosina-quinase e ento capaz de atuar sobre um certo nmero de molculas citoplasmticas sinalizadoras. Dentre elas, a ZAP-70 ativa fosforilando duas protenas adaptadoras que serviro como chave para vrias outras cascatas de sinalizaes dentro da ativao dos LT: a LAT e a SLP-76. Do-se incio, ento, as cascatas bioqumicas intermedirias para a produo dos fatores de transcrio: Vias da protena quinase Cγ (PKCγ): a sinalizao do TCR induz a ativao da isoforma γ1 da enzima fosfolipase C (PLCγ1), e os produtos da hidrlise dos lipdeos de membrana mediada pela PLCγ1 ativam enzimas que geram fatores de transcrio adicionais nas clulas T. Dentre os produtos finais, temos o IP3 (que produz um rpido aumento do Ca2+ citoslico livre, dentro de minutos de ativao de ativao do LT) e o DAG Arlindo Ugulino Netto –IMUNOLOGIA I – MEDICINA P3 – 2008.2 4 (segundo produto da degradao do PIP2, ativa a enzima PKC, que tambm participa na gerao de fatores de transcrio ativos). Via das MAP-quinases: tambm denominada da via de sinalizao Ras e Rac nos linfcitos T. Esta via nas clulas T ativada depois da ligao da protena Ras s molculas adaptadoras que foram fosforiladas pela agregao do TCR, e a ativao de Ras finalmente leva ativao dos fatores de transcrio. VIA DA MAP-QUINASE NA ATIVAÇAO DO LT A protena adaptadora LAT fosforila e ativa, inicialmente, a Grb-2, segunda protena adaptadora presente na cascata da MAP-quinase. Esta Grb-2, uma vez ativada, recruta e ativa uma protena Sos, responsvel por trocar uma molcula inativa (Ras•GDP) em uma molcula ativa (Ras•GTP). A Ras, uma vez ativa (na forma de Ras•GTP), atua em outras protenas que entram no ncleo e atuam em fatores de transcrio. O Ras•GTP age, indiretamente, sobre a protena ERK citoslica que, quando fosforilada, tem a capacidade de entrar no ncleo da clula. Esta ERK tem a capacidade de fosforilar outra protena denominada ELK. Uma vez fosforilada, a ELK entra no ncleo da clula e ter e funo de atuar diretamente sobre o gene da protena Fos. Esta Fos, quando transcrita, compe (juntamente a protena Jun, oriunda da cascata da Rac•GTP) o fator de transcrio chamado de AP-1. Esta AP-1 se associa com outros fatores de transcrio (NFAT e NF-κB, associados a Via da PKCγ) para transcrever IL-2 (ver mais adiante: Fatores de transcrição na ativação do LT). VIA DA PLC NA ATIVAÇÃO DE LT A protena adaptadora LAT recruta protenas citoslicas para suas redondezas no intuito de dar incio a esta via de ativao por meio da PLC. Inclusive esta, a PLCγ1, recrutada na forma inativa, fosforilada (tanto pela LAT quanto pela ZAP-70) e ativada. Uma vez ativa, a PLCγ (como o prprio nome j indica: fosfo-lipase C) quebra lipdios PIP2 (bifosfato inositol) da prpria membrana plasmtica, gerando como subprodutos o IP3 (trifosfatidilinositol) e o DAG (diacilglicerol). O IP3, depois de se dirigir ao citoplasma, responsvel por ativar o retculo endoplasmtico celulares e faz -lo liberar ons Ca2+, aumentando a concentrao desse on no meio citoslico, importante para a ativao da clula. O DAG lipoflico, permanecendo na membrana lipdica, para ativar a PKC. O DAG capaz de ativar a PKC quando se liga ao Ca2+ citoplasmtico, o que demonstra a importncia da interao dessas duas vias. Quando o PKC est ativo, torna-se responsvel pela estimulao de outras vias (como as que foram vistas previamente) que, em conjunto, auxiliam na ativao do LT. Esta via da PLC de extrema importncia para a sntese dos fatores de transcrio NFAT e NF-κB, responsveis por formarem um complexo com o AP-1 (que j foi estudado anteriormente) para a formao do fator de transcrio da IL-2. FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA ATIVAÇAO DO LT Via AP-1: como vimos previamente, a AP-1 produzida por meio da via das MAP-quinases. Arlindo Ugulino Netto –IMUNOLOGIA I – MEDICINA P3 – 2008.2 5 Via NF-κB: Existe uma protena citoslica inativa chamada de iNF-κB (κ=kappa), sendo constituda de um trade: o IκB (inibidor de κB+NF-κB). Com a ao de uma PKC, que fosforila o inibidor da κB, a NF-κB torna-se capaz de se desprender de seu inibidor e se tornar ativo. Dessa forma, o NF-κB capaz de atravessar a membrana nuclear e alcanar o ncleo para tambm constituir (juntamente ao AP-1) o fator de transcrio da IL-2, responsvel pela ativao efetiva do LT. Via NFAT: por esta via, h a formao do NFAT, o terceiro fator de transcrio da IL-2. A protena citoplasmtica NFAT encontra-se inativa quando fosforilada. Com isso, ela deve ser desfosforilada pela enzima calcineurina (que ativa quando associada ao complexo Ca2+-Calmodulina) formando a NFAT ativa. Esta capaz de penetrar no ncleo do LT, se unir ao AP-1 e ao NF-κB, para constituir o fator de transcrio do IL-2. A maioria dos medicamentos imunossupressores atua inibindo esta via (inativando a ao desfosforiladora da calcineurina). OBS: A trade de transcrio da IL-2 composta: NF-κB + NFAT + AP-1 (Fos e Jun)
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