Protocolo de Prova Prática II (Dosagem de Proteínas ou glicídeos) Bioquimica I

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Protocolo de Prova Prática II – Bioquímica I 
 
Objetivos: fazer a dosagem de açúcares ou proteínas, a partir da 
espectrometria de luz visível e comparando com curvas-padrões já 
estabelecidas préviamentes. 
Assinale aqui o composto a ser dosado: 
(1) Açúcar [ ] 
(2) Proteína [ ] 
 
Passo a passo 
 
 Colocar sobre a bancada uma estante com 7 tubos. 2 tubos 
para diluição (para dois valores de diluição (ex: 10x e 20x) e 
4 para as duplicatas (2 para diluição de 10x e 2 para a 
diluição de 20x). Cada tubo de diluição servirá para fazer a 
diluição do material. Já nos tubos de duplicata colocaremos 
1 ml dessa diluição já feita e esse material que será 
analisado. Por isso a diluição deve totalizar mais que 2 ml 
para que hajam 1 ml certos em cada duplicata. Aconselhável 
5ml de solução final no tubo de diluição. O 7° tubo será 
para o branco de análise. 
 
 Definir valores de diluição a serem utilizados. É 
aconselhável usar duas diluições, com valores como 10x e 
20 x de diluição. Caso ambos não caibam na curva, será 
necessária uma terceira diluição. 
 
 Escrever nos tubos de diluição os valores de diluição a 
serem feitos neles e também identificar os tubos que 
servirão como duplicatas. 
 
 Definir a quantidade de solução problema a ser colocar. 
Para isso é necessário fazer a relação: 
 
Diluição = Volume final/volume de solução problema 
 
Ex: uma diluição de 10x: 
10 (valor de diluição) = 5 ml (volume final da solução) 
 X (volume de solução problema) 
X = 0,5 ml de solução problema. 
 
 Pegar um bequer com água destilada e outro com solução 
problema, além de uma pipeta automática P5000, P 1000 e 
P 200 e suas respectivas ponteiras. 
 
 Fazer a diluição 1 ( x): 
 
- Quantidade de solução problema ( ) 
- Quantidade de água destilada ( ) 
OBS: água + solução problema devem totalizar volume final 
desejável de 5ml (pode ser alterar, mas sempre mais que 2ml). 
Lembrando que se esse volume se alterar, a conta de quantidade 
de solução problema deve ser alterada!!! 
 
Por Atiles Reis 
 
 
 - Deve se inserir as quantidades de água e solução problema com 
as respectivas pipetas. É necessário lembrar que se o volume for 
de 0,5 ml, NÃO SE DEVE UTILIZAR A PIPETA P200 3 VEZES, 
POIS ISSO AUMENTARÁ O ERRO DA PIPETA EM 3 VEZES! O 
mesmo se aplica ao resto. Para esse volume, utilizariamos a 
P1000 ajustado ao valor. Para completar com água, que, seguindo 
ao exemplo, adicionaríamos 4,5 ml, poderíamos utilizara P5000, 
pipeta de maior capacidade na sala ou utilizar uma pipeta de vidro. 
- Homogenizar o tubo calmamente. 
- Adicionar 1ml de solução homogeizada a duplicata 1 e 2. Deixar 
os 3ml restantes de estoque. 
 Fazer a diluição 2 ( x) 
 
- Quantidade de solução problema ( ) 
- Quantidade de água destilada ( ) 
- Homogenizar o tubo calmamente. Dessa vez, é aconselhável que 
a outra dupla faça ou que a pessoa que fez a da diluição 1 limpe as 
mãos antes de fazer a da 2 para que não haja contaminação. 
- Adicionar 1ml de solução homogeizada a duplicata 3 e 4. Deixar 
os 3ml restantes de estoque. 
OBS: os mesmos cuidados devem ser tomados nessa diluição. 
 Faça o branco de reação adicionando 1ml de água 
destilada no tubo vazio 
Agora, siga o protocolo específico de seu composto.. 
(1) Açúcar pelo método de DNS (Glicose) 
 Adicionar a cada tubo de duplicata com 1 ml de solução 
problema diluída em água destilada e no branco, 1ml de 
DNS (o composto laranja), que já deve estar setado para 
esse volume. 
 Vortexizar a solução com cuidado para que ela seja 
homogeinizada 
 Adicionar em banho-maria por 5 minutos com cuidado. 
Ajustar o timer assim que adicionar os tubos forem 
colocados. 
 Retirar os tubos e deixar esfriar por uns 5 a 10 minutos, até 
quando for possível pegar com as mãos 
 Completar o volume dos tubos com água ate que eles 
totalizem volume final de 15 ml. Ou seja adicionar 13 ml 
de água em cada tubo. 
 Homogeinizar com cuidado utilizando as mãos tomando 
cuidado com a contaminação. 
 Fazer a análise espectofotométrica no especfotômetro 
utilizado em aula (Espectrofotômetro [ ]) a 540 nm. 
Começando pelo branco para tarar o espectrofotometro. 
 Anotar a absorvância de cada duplicata 
 Abs a 540nm 
Branco 
D1 ( x) 
D2 ( x) 
D3 ( x) 
D4 ( x) 
 
Agora parta para a parte teórica para analisar os dados. 
 
 
 
Valores da curva padrão: 
(Feita por Isabel Wilmer e Bárbara Almeida utilizando 
Espectofometro F em 05/05/2017) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Y= 0,0786x R²= 0,9926 
Os valores de absorvância tem que ser menores que 0,810nm 
para caber na curva. Caso não seja, fazer outra dilução. 
Determinando a concentração 
Para determinarmos a concentração, devemos seguir a seguinte 
fórmula: 
[ ] = abs * f * diluição 
 
Onde: 
[ ] = Concentração do composto 
Abs = absorvância em 540 nm 
F = fator (equivale a 1/K ou 1/Y nesse caso) 
Diluição = diluição utilizada (utilizar 1 caso não haja diluição) 
Ex: uma solução diluída 2x e apresentou absorvância de 0,602: 
[ ] = abs * f * diluição 
[ ] = 0,602 * (1/0,0786) * 2 
[ ] = 0,602 * 12,89 * 2 
[ ] = 15,51 mM de glicose 
Deve-se fazer essa conta para cada duplicata: 
 [ ] em D1 = 
 [ ] em D2 = 
 [ ] em D3 = 
 [ ] em D4 = 
Média das concentrações: nm (desconsiderar caso haja valor 
muito discrepante em uma das duplicatas) 
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 2 4 6 8 10 12
Absorvância x Concentração 
Pontos Concentração Absorvância 
1 0 0 
2 2 0,14 
3 4 0,292 
4 6 0,429 
5 8 0,645 
6 10 0,81 
 
 
(2) Proteínas pelo método de Biureto (Caseína) 
 
 Adicionar a cada tubo de duplicata com 1 ml de solução 
problema diluída em água destilada e no branco, 4ml de 
Biureto (o composto azul), que já deve estar setado para 
esse volume. 
 
 Vortexizar a solução com cuidado para que ela seja 
homogeinizada. 
 
 
 Colocar no escuro por 30 minutos. Ajustar o timer assim 
que adicionar os tubos forem colocados no armário. 
 
 Fazer a análise espectofotométrica no especfotômetro 
utilizado em aula (Espectrofotômetro [ ]) a 550 nm, 
começando pelo branco para tarar o espectrofotometro. 
 
 
 Anotar a absorvância de cada duplicata 
 
 Abs a 550nm 
Branco 
D1 ( x) 
D2 ( x) 
D3 ( x) 
D4 ( x) 
 
Agora parta para a parte teórica para analisar os dados. 
 
Valores de curva-padrão: 
(Feita por Atiles Reis em 12/05/2017 utilizando espectofotômetro F) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Y= 0,0452x R²= 0,9995 
Os valores de absorvância tem que ser menores que 0,448 nm 
para caber na curva. Caso não seja, fazer outra dilução. 
 
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 2 4 6 8 10 12
Absorvância x Concentração 
Pontos Concentração Absorvância 
1 0 0 
2 2mg/ml 0,095 
3 4mg/ml 0,179 
4 6mg/ml 0,276 
5 8mg/ml 0,362 
6 10mg/ml 0,448 
 
 
Determinando a concentração 
Para determinarmos a concentração, devemos seguir a seguinte 
fórmula: 
[ ] = abs * f * diluição 
Onde: 
[ ] = Concentração do composto 
Abs = absorvância em 550 nm 
F = fator (equivale a 1/K ou 1/Y nesse caso) 
Diluição = diluição utilizada (utilizar 1 caso não haja diluição) 
Ex: uma solução diluída 5x e apresentou absorvância de 0,323: 
[ ] = abs * f * diluição 
[ ] = 0,323 * (1/0,0452)* 5 
[ ] = 0,323 * 22,124 * 5 
[ ] = 35,73 mg/ml de caseína 
Deve-se fazer essa conta para cada duplicata: 
 [ ] em D1 = 
 [ ] em D2 = 
 [ ] em D3 = 
 [ ] em D4 = 
Média das concentrações: mg/ml (desconsiderar caso haja 
valor muito discrepante em uma das duplicatas) 
Considerações finais: 
Discutir os valores encontrados mostrando que a partir dos 
valores de absorvância e do coeficiente angular de uma curva 
padrão utilizada, podemos estabelecer também os valores de 
concentração de uma determinada solução. É necessário deixar 
claro que essa dosagem não apresenta muita sensibilidade em 
proteínas mas que ainda assim é largamente utilizada. É 
necessário mencionarmos ainda o fato de que nas condições 
experimentais dos laboratórios de aulas práticas, não é possível 
estabelecer um valor preciso, pois muitas vezes os equipamentos 
como pipetas e espectofotometros estão ajustados de forma 
correta.