Protocolo de Prova Prática III (Ação Enzimática Influência da concentração de substrato) Bioquimica I

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Protocolo de Prova Prática III – Bioquímica I
 
Objetivos: Estabelecer a influência da concentração de sacarose sobre o velocidade inicial da reação enzimática promovida pela enzima Invertase e, a partir disso, calcular os parâmetros cinéticos KM e VM. Por Atiles Reis
Metodologia geral: Será feito um experimento fixando parâmetros como temperatura, pH, concentração da enzima e tempo e feito um gradiente de concentração de substrato em 5 tubos, cada um contando com seu respectivo Branco de reação. Após o tempo fixado de reação será adicionado DNS nos tubos, o qual para a ação da invertase por ser alcalino. Após a reação desse último composto será feita a leitura da absorvância de cada tubo e calculado a concentração do produto formado e concentração do substrato. A partir disso, será feito um gráfico de uma reta e a partir dos parâmetros estabelecidos por ele, será calculado KM e VM. 
Passo a passo 
Preparando a mesa
Colocar sobre a bancada uma estante com 10 tubos. Cinco desses tubos serão reatores de reação, sendo um para cada concentração de substrato, e os outro cinco servirão para preparação dos brancos de cada uma das reações. ( )
Colocar uma pipeta P1000 (pipeta azul), a qual servirá para a adição do substrato e do tampo, e uma pipeta P200, a qual servirá para adição da enzima. Colocar também as caixas de ponteiras correspondentes a cada uma delas. ( )
Marcar os tubos com uma caneta específico nomeando de 1 a 5 (1, 2, 3, 4 e 5). Fazer também a marcação correspondente aos brancos, marcando de B1 a B5 (B1, B2, B3, B4 E B5). Não esqueça de identificar a dupla/trio. ( )
Colocar em um canto da mesa uma pipeta de 20 ml e um becker de água destilada cheio. Pode ser feito posteriormente, enquanto ocorre o aquecimento para a reação do DNS. ( )
Caso possível, deixe os vidros de reagente próximos de você. Será utilizado nessa prática os seguintes reagentes: Sacarose ([ ] = 0,02M; 0,03M; 0,05M; 0,1M; e 0,2M), tampão e Invertase (enzima que converte sacarose em glicose + frutose). Também será utilizado DNS para a dosagem, mas provavelmente ele estará já setado em 1 ml na bancada. 
Preparação das reações (Tubos 1 a 5)
Adicione no tubo 1 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,02 M. ( )
Adicione no tubo 2 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,03 M. ( )
Adicione no tubo 3 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,05 M. ( )
Adicione no tubo 4 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,1 M. ( )
Adicione no tubo 5 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,2 M. ( )
OBS: LEMBRE-SE DE TROCAR AS PONTEIRAS AO MUDAR AS CONCENTRAÇÕES DA SACAROSE! ISSO PODE AFETAR NO RESULTADO. TAMBÉM TOME CUIDADO COM AS BOLHAS!
Adicione em cada tubo 0,3 ml (300 na pipeta P1000) de solução tampão ( )
Pegue o cronometro e esteja preparado para acioná-lo a qualquer instante
Sete a pipeta P200 para 200, quantidade equivalente a 0,2 ml de solução.
Acione o cronometro e nesse imediato momento adicione ao tubo 1 0,2 ml de enzima. ( )
Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 20 segs, adicione ao tubo 2 0,2 ml de enzima. ( )
Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 40 segs, adicione ao tubo 3 0,2 ml de enzima. ( )
Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 1 min, adicione ao tubo 4 0,2 ml de enzima. ( )
Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 1 min e 20 segs, adicione ao tubo 5 0,2 ml de enzima. ( )
Aguarde 4 minutos e 30 segundos e vá para a bancada do DNS ( )
Quando o cronometro marcar 5 min, adicione 1 ml de DNS no tubo 1 e vortexize ele rapidamente ( )
Quando o cronometro marcar 5 min e 20 segs, adicione 1 ml de DNS no tubo 2 e vortexize ele rapidamente( )
Quando o cronometro marcar 5 min e 40 segs, adicione 1 ml de DNS no tubo 3 e vortexize ele rapidamente ( )
Quando o cronometro marcar 6 min, adicione 1 ml de DNS no tubo 4 e vortexize ele rapidamente( )
Quando o cronometro marcar 6 min e 20 segs, adicione 1 ml de DNS no tubo 5 e vortexize ele rapidamente ( )
Esse gradiente de tempo garante que você tenha exatos 5 minutos de reação a cada tubo, fixando o tempo o qual já se sabe de aulas anteriores, que a invertase ainda está em velocidade inicial. A adição do DNS, por ser um composto alcalino, paraliza a reação. 
Antes de aquecer as amostras, prepare os brancos. 
Preparação dos Brancos (Tubos B1 a B5)
O procedimento é praticamente o mesmo da preparação das reações, só que nesses tubos você não quer que a invertase funcione então, a adição dela será depois da adição do DNS. Dessa forma:
Adicione no tubo B1 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,02 M. ( )
Adicione no tubo B2 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,03 M. ( )
Adicione no tubo B3 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,05 M. ( )
Adicione no tubo B4 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,1 M. ( )
Adicione no tubo B5 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com concentração igual a 0,2 M. ( )
Adicione em cada tubo 0,3 ml (300 na pipeta P1000) de solução tampão ( )
Caso prefira, ou até por motivos de economia de ponteiras, a adição da sacarose e do tampão dos brancos podem ser feita simultaneamente com a adição nos tubos de reação. Seja cuidadoso para não confundir os tubos.
Adicione 1ml de DNS em cada um dos tubos ( )
Sem se preocupar com o tempo, adicione 0,2 ml de enzima em cada um dos tubos. Por o DNS já estar em solução, não haverá reação. ( )
Reação do DNS
Após a adição do DNS em todos os tubos, tal como todos os reagentes, coloque os 10 tubos para ferver a 100°C por exatamente 5 minutos. ( )
Retire os tubos do bequer no qual eles estão sendo aquecidos e deixe esfriar. ( )
Pegue a pipeta de 20 ml e o bequer com a água destilada e, quando os tubos estiverem frios, adicione 13 ml em cada um dos tubos. ( )
Faça a homogeneização dos tubos. Não será possível vortexizar então, cuidadosamente, homogenize com as mãos. Tenha cuidado com o dedo que você está utilizando no processo pois não pode haver contaminação. ( )
Leitura das absorvâncias
ESPECTOFOTÔMETRO UTILIZADO [ ]
Verifique se o espectofotômetro está regulado para a leitura a 540 nm. Caso não, ajuste para tal valor ( )
Adicione o Branco 1 e tare o espectofotômetro ( )
Leia a absorvância do Tubo 1 ( )
Lave bem a cubeta e repita a operação com os restantes dos tubos. B2 ( ) 2 ( ) B3 ( ) 3 ( ) B4 ( ) 4 ( ) B5 ( ) 
5 ( )
Anote as absorvâncias na tabela a seguir:
	TUBO
	ABS A 540 nm
	1
	
	2
	
	3
	
	4
	
	5
	
Cálculo da velocidade de reação 
O primeiro parâmetro a ser definido é a velocidade de reação, a qual é uma razão entre o produto formado pelo tempo de ação da enzima – que, nesse experimento, foi fixado em 5 minutos –. Dessa forma, para fazermos essa conta é preciso fazer o cálculo da quantidade de produto formado, que é feito da seguinte forma:
Produto formado = Absorvância K 
A unidade do cálculo do produto é Micromolar (µmol)
Para fazer esse cálculo, utilize o K da curva padrão estabelecida na aula de Influência do tempo e da [E]. 
Valor de K obtido na curva-padrão realizada por Atiles Reis e Tainah Mattos em 02/06/2017: 0,0786
Anote os resultados a seguir
Produto formado (Abs/K) 
Tubo 1:
Tubo 2: 
Tubo 3:
Tubo 4: 
Tubo 5:
Agora é possível calcularmos a velocidade de reação. Ela é dada pela seguinte fórmula:
Velocidade de reação = Produto formadoTempo
A unidade do cálculo do produto é Micromolar por minuto (µmol/min)
Anote os resultados a seguir:
Velocidade de reação
Tubo 1:
Tubo 2: 
Tubo 3:
Tubo 4: 
Tubo 5:
Agora que você já obteve a velocidade de reação, é necessário calcularmos a concentração de substrato em cada tudo. A conta a ser realizada é a mesma dos métodos de diluição, ou seja, concentração inicial (Ci) multiplicada pelo volume inicial (Vi) igualada a concentraçãofinal (CF) multiplicada pelo volume final (VF). Resumidamente
Ci . Vi = CF. VF
A concentração a ser calculada é a da sacarose, dessa forma, caso as concentrações molares sejam as mesmas descritas aqui, os resultados seriam os seguintes:
Tubo 1: 0,02 . 0,5 = X . 1
X = 0,01 mol/ml
Tubo 2: 0,03 . 0,5 = X . 1
X = 0,015 mol/ml
Tubo 3: 0,05 . 0,5 = X . 1
X = 0,025 mol/ml
Tubo 4: 0,1 . 0,5 = X . 1
X = 0,05 mol/ml
Tubo 5: 0,2 . 0,5 = X . 1
X = 0,1 mol/ml
Depois do calculo desses dois parâmetros, ainda é necessário mais um passo antes da confecção do gráfico: a inversão dos valores, ou seja, 1/V e 1/[S]. Isso é necessário estamos realizando o plot de Lineweaver-Burk, que representa a equação de Michaelis e Menten de forma linearizada. Dessa forma, com a inversão dos valores conseguimos obter uma reta e fazer uma análise mais apurada dos valores. Anote os valores a seguir
Caso sejam os valores demonstrados acima
Tubo 1
1/V = 1/[s] = (100 M)
Tubo 2
1/V = 1/[s] = (66,67 M)
Tubo 3
1/V = 1/[s] = (40 M)
Tubo 4
1/V = 1/[s] = (20 M)
Tubo 5
1/V = 1/[s] = (10 M)
Plotagem do gráfico
Crie duas colunas no computador: uma para a velocidade e outra para a concentração do substrato. Marque a primeira coluna como 1/[S] e a segunda como 1/V e adicione os respectivos valores a elas.
Selecione as duas colunas e clique em inserir. Depois clique em Gráfico. Quando a janela de seleção abrir, selecione a opção Dispersão (XY) e prossiga dando OK até o final. O gráfico gerado será parecido com esse:
Clique em um dos pontos com o botão direito do mouse e selecione a opção adicionar linha de tendência. Abrirá um Box como esse. Selecione as duas caixas de equação de gráfico e sete a retrospectiva para 30 unidades. Caso esse número ainda não seja o suficiente para que você consiga ver o momento que a reta corta o eixo X, ajuste para mais unidade. Geralmente 30 é um número suficientemente bom.
O gráfico gerado será igual a esse:
Anote a equação da reta. Ela será necessária para fazer os próximos cálculos. Nesse gráfico exemplo ela está representada por “Y= 0,0264x + 0,2025”. Preste atenção também em seu R2. Ele deve estar o mais próximo de 1 possível. Dessa forma, caso a reta esteja com um R² < que 0,99XX, tente tirar algum ponto para verificar se há mudanças. Obtendo ou não mudanças no final, não esqueça de discutir isso na prova.
Calculando KM e Vm
Uma equação de uma reta pode ser representada pela seguinte fórmula genérica: Y = ax + b. Na equação “Y= 0,0264x + 0,2025” o a é igual a 0,0264 e o b é igual a 0,2025. Defina o a e o b de sua reta
A velocidade máxima (Vm) é representada por 1/B. Dessa forma é fácil calcular esse parâmetro.
Vmax = 1B
Anote aqui o valor de VM: µmol/min
Agora que você já possui o valor de VM, é possível calcular o valor de Km. A fórmula para o cálculo desse parâmetro é representada por:
KM= a . VM
Anote aqui o valor de KM obtido: M
Agora discuta os dados obtidos. Lembre-se que Vmax é a velocidade inicial da enzima a qual é definida por um tempo X limitado (no caso da invertase, cerca de 12 minutos). Temos nesse momento um comportamento linear da reta pois não há reação inversa (conversão do produto em substrato) ainda. Km representa a equação da reta e pode ser definida como a afinidade de uma enzima por um substrato X. Quanto menor esse valor, melhor. 
Observações
A enzima invertase tem como temperatura ideal 55°C, por isso, o experimento deverá ser realizado sem nenhuma refrigeração. Pelo menos até o momento de adição do DNS. Lembre-se de discutir isso na prova.