Enzimas cinetica

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Márcia Soares
Enzimas
•Fatores que Alteram a Atividade de
Enzimas
•Cinética Enzimática
–Michaeliana
–Não-Michaeliana (enzimas alostéricas)
Márcia Soares
Introdução à Cinética Enzimática
Estudo da velocidade da reação (V): S  P
V
Quantidade de produto formado
Quantidade de substrato transformado
(em unidade de tempo)
Atividade enzimática pode ser medida pela 
velocidade da reação catalisada
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Márcia Soares
Fatores que alteram a atividade de 
uma enzima
E + S ES E + P
• Fatores decorrentes da natureza protéica das enzimas
- pH
- temperatura
• Fatores decorrentes da formação do complexo ES
- concentração do substrato
- concentração da enzima
- afinidade da enzima pelo substrato
• Presença de inibidores
Márcia Soares
Influência da temperatura do meio sobre 
a atividade enzimática
Mantidas fixas as condições: 
- pH ótimo
- concentração de substrato
- concentração de enzima
Ativação
térmica
Desnaturação 
térmica
Temperatura ótima
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Márcia Soares
Importância Biomédica
Alterações de temperatura
Febre Hipotermia
Perturbam a homeotase
Alterar velocidade de muitas reações
Márcia Soares
Importância Biomédica
Hipotermia
Pode ser útil para reduzir a demanda metabólica
Durante uma cirurgia cardíaca
Transporte de orgãos para transplante
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Márcia Soares
Influência do pH do meio sobre a 
atividade enzimática
• Mantidas fixas as condições de
-temperatura
-concentração de substrato
-concentração de enzima
pH ótimo pH
Márcia Soares
Influência do pH do meio sobre a 
atividade enzimática
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Márcia Soares
Influência da concentração da enzima sobre 
a atividade enzimática
Mantidas fixas as condições de: 
- temperatura ótima
- pH ótimo
- [substrato] em excesso
[E]
Márcia Soares
Influência da concentração de substrato 
sobre a atividade enzimática
Mantidas fixas as condições de:
- temperatura ótima
- pH ótimo
- [enzima]
[S]
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Márcia Soares
Influência da concentração de substrato 
sobre a atividade enzimática
E E
E E
S
+
E E
E E
S E E
E E
P
P
+
Baixa concentração de substrato
Formação do produto é PROPORCIONAL à 
concentração de substrato
Márcia Soares
Influência da concentração de substrato 
sobre a atividade enzimática
3/4 de saturação do centro ativo da enzima
S
S
S
+
E E
E E
E E
E E
S S
S
E E
E E
+
P
P
P
P
P
P
Formação do produto é PROPORCIONAL à 
concentração de substrato
100 % de saturação do centro ativo da enzima
S
S
S
S
+
E E
E E
E E
E E
S S
S S
E E
E E
+ P
P
P
P
P
P
P
P
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Márcia Soares
Influência da concentração de substrato 
sobre a atividade enzimática
[Substrato] em excesso
S
S
S
S
S
S
S
S
+
E E
E E
E E
E E
S S
S S
E E
E E + P
P
P
P
P
P
P
P
S
S
S
S
S
S
S
S
Velocidade da reação independe da [S]
Márcia Soares
Influência da concentração de substrato sobre a 
atividade enzimática
Em baixas concentrações de 
substrato a velocidade de reação 
é de primeira ordem – isto é, é 
proporcional a concentração de 
substrato
Em altas concentrações de 
substrato, a velocidade da reação 
é de ordem zero – isto é, é 
constante e independente da 
concentração de substrato
[S]
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Márcia Soares
Atividade Enzimática
• Depende também:
– presença e concentração do cofator
– poder catalítico da enzima
• capacidade da enzima de transformar o substrato ligado 
ao complexo ES em produto por unidade de tempo
ES  E + P
– afinidade da enzima pelo substrato (Km)
• maior ou menor capacidade da enzima de se ligar ao 
substrato
E + S  ES
poder catalítico da enzima
Márcia Soares
Enzimas 
Poder catalítico
• Capacidade de converter substrato em 
produto em unidade de tempo
– QUIMIOTRIPSINA - 1,9 x 102 móis/s
– ANIDRASE CARBÔNICA - 1 x 106móis/s
NÚMERO DE RENOVAÇÃO
(TURNOVER NUMBER)
nº de mols de substrato convertido em 
produto por mol de enzima em unidade de 
tempo
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Márcia Soares
Enzimas 
Poder catalítico
Poder catalíticonº de renovação
Velocidade máxima da reação
Márcia Soares
Atividade Enzimática 
• Depende também:
– presença e concentração do cofator
– poder catalítico da enzima
• capacidade da enzima de transformar o substrato ligado ao 
complexo ES em produto por unidade de tempo 
ES  E + P
– afinidade da enzima pelo substrato (Km)
• maior ou menor capacidade da enzima de se ligar ao 
substrato
E + S  ES
afinidade da enzima pelo substrato (Km)
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Márcia Soares
Enzimas 
Cinética enzimática
1913 
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maude Menten - Pediatra
Representaram uma reação 
enzimática em 2 etapas
E + S
K1
K2
ES
K3
K4
E +P
K= constante de velocidade=
[produto]
[substrato]
Márcia Soares
Enzimas 
Cinética enzimática
E + S
K1
K2
ES
K3
K4
E +P
KM =
K2+ K3
K1
Estabilidade do complexo ES pode ser 
expressa pela relação entre as velocidades 
de dissociação e de formação do complexo
Específico para 
cada enzima
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Márcia Soares
Enzimas - Cinética enzimática
KM
Constante de Michaelis
Medida da afinidade do complexo 
enzima-substrato (ES)
Específico para cada enzima
Márcia Soares
Cinética enzimática
KM= [S]
Numericamente, KM pode ser expresso como a 
[substrato] necessária para que a velocidade da 
reação seja metade da velocidade máxima
V máx
[S]
V
Vmax
2
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Márcia Soares
Cinética enzimática
Michaelis e Menten expressaram matematicamente a velocidade da 
reação pela fórmula:
V=
Vm . [S]
Km +[S]
Onde Vmáx é velocidade 
máxima da reação
Km+ [S]= [S]. Vm 
V
Quando V =Vm/2
KM= [S]
Km= [S] . Vm . 2 [S] 
Vm
E + S
K1
K2
ES
K3
E +P
Márcia Soares
Conclusões sobre KM
KM
Afinidade da enzima pelo substrato
Pequena [substrato] é 
necessária para a reação 
atingir metade da Vmáxima
KM
Grande [substrato] é 
necessária para a reação 
atingir metade da Vmáxima
Afinidade da enzima pelo substrato
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Márcia Soares
Conclusões sobre KM
KMKM
Afinidade da 
enzima pelo 
substrato
Afinidade da 
enzima pelo 
substrato
Márcia Soares
Conclusões sobre KM
• Característico de cada enzima
• Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato
• É numericamente IGUAL a [substrato] na qual a 
velocidade da reação é metade de Vmáx
KM =
K2+ K3
K1
E + S
K1
K2
ES
K3
K4
E +P
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Márcia Soares
Conclusões sobre a Cinética Michaeliana
Quando a
[S] for menor que o KM (até 
atingir a saturação da enzima)
a velocidade da reação é 
proporcional à [S]
Reação de 1a ORDEM
Quando a [S] é muito maior 
que KM a velocidade da 
reação é constante e igual 
a Vmax
Reação é de ORDEM ZERO
[S]
Gráfico característico é uma hipérbole
Márcia Soares
Cinética Enzimática
[S]
Devido à ascenção 
gradual da curva 
hiperbólica é
difícil determinar 
quando foi atingida a 
Vmáx
Não se pode 
calcular com 
exatidão os valores 
de Km e Vmáx
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Márcia Soares
Cinética Enzimática
Lineweaver e Burke Curva DUPLO-RECÍPROCA
Márcia Soares
Cinética Enzimática
Lineweaver e Burke Curva DUPLO-RECÍPROCA
1
V Vmax
= KM . 1 1+
[S] Vmax
Equação da reta
y= ax + b
a= inclinação da reta
b= intercepto em y
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Márcia Soares
Capaz de 
metabolizar mais 
glicose conforme o 
aporte
SaturadaCinética Enzimática
Importância de conhecer o KM das enzimas
• Hexoquinase
Presente em todas as 
células
KM=30 M(>0,1mM)
• Glicoquinase
Presente no fígado
KM=10 mM
Após refeições [glicose] na veia porta 
hepática é da ordem de mM 
Márcia Soares
Cinética Enzimática
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Márcia Soares
Enzimas
•Inibidores
Importância Biomédica
Toxicologia e Farmacologia
Venenos metabólicos
Inibir ou abolir reações 
metabólicas essenciaisInibir a atividade de enzimas 
Drogas terapeuticamente 
importantes
Utilizadas no tratamento de 
inúmeras patologias
Descoberta do mecanismo de 
ação de enzimas
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Inibição Enzimática
Quanto ao tipo:
competitiva
não-competitiva
incompetitiva
inibidor  a atividade de uma 
única enzima ou de um grupo 
restrito de enzimas
irreversível
reversível
inibidor  a atividade de todas 
as enzimas 
ex: agentes desnaturantes
inespecífica -
específica -
Inibição Enzimática
– Inibição Enzimática Irreversível 
• inibidor se combina com um grupo 
funcional (sítio ativo) da enzima
• inibidor se liga à enzima formando 
um complexo ESTÁVEL
• forma-se uma ligação COVALENTE
entre o inibidor e a enzima
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Inibição Enzimática Irreversível
Inibição Enzimática
Inibição Enzimática Reversível
• inibidor forma com a enzima um complexo 
INSTÁVEL
• inibição NÃO envolve modificação 
COVALENTE
• Tipos de inibidores reversíveis
• competitivos
• não competitivos
• acompetitivos
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Inibição Competitiva
Inibidor competitivo
Estrutura semelhante à do substrato
Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima
E + S ES E + P
EI 
+
I
Inibição Competitiva
Enzima
Sítio Ativo
IC
S
S
IC
IC
IC
IC
S
P
P
SS
S
S
S S
S
P
P
P
P
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Inibição Competitiva
[substrato] necessária para que a enzima 
funcione normalmente
afinidade da enzima pelo substrato
Na presença do inibidor competitivo
KM aparente da enzima
Inibição Enzimática
Competitiva
• Inibidor tem semelhança estrutural com o 
substrato 
• O inibidor se liga no sítio ativo da enzima
• Aumento da [substrato] diminui a inibição 
• KM aparente da enzima AUMENTA
• Em uma concentração suficientemente alta de 
substrato a VELOCIDADE da reação atinge a Vmáx 
observada na ausência do inibidor
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Inibição Competitiva
Análise Gráfica
Inibição Competitiva
Terapias com drogas
Conceitos de inibição enzimática
Drogas projetadas para inibirem uma enzima específica
ANTIMETABÓLITOS
Antivirais, antibacterianos, antitumorais
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Inibição Competitiva
Exemplo
antibacteriano
PABA Ácido fólico 
Diidropteroato
sintetase
bacteriana
Essencial para o 
crescimento bacteriano
Sulfanilamida
Produzem vasoconstrição, 
elevando a pressão arterial e 
promovem a síntese de 
aldosterona (hormônio esteróide) 
que promove a retenção de sódio
Inibidores da ECA
(Enzima Conversora de Angiotensina)
Captropil
Enalapril
Exemplo:
Tratamento de hipertensão
Inibição Competitiva
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Inibição Não-Competitiva
E + S ES E + P
EI + S
+
I
+
I
EIS
• Inibidor não-competitivo
NÃO se liga ao sítio ativo da enzima 
Inibição Enzimática
Não-Competitiva
• Inibidor não tem semelhança estrutural com o 
substrato 
• NÃO se liga no sítio ativo da enzima
• Aumento da [substrato] não diminui a inibição 
• KM aparente da enzima NÃO se altera
• A VELOCIDADE máxima DIMINUI na presença do 
inibidor
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Inibição Não-Competitiva
Diminui a concentração 
de enzima ativa
Velocidade Máxima 
da Reação
Exemplos: Metais pesados - Pb+2
Inibição Não-Competitiva
Análise Gráfica
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Inibição acompetitiva
É observada quando 
um inibidor pode ligar-
se somente ao 
complexo ES
Márcia Soares
Cinética Enzimática
• Enzimas Michaelianas
• Enzimas Alostéricas
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Márcia Soares
Cinética Enzimática
Não-Micheliana Enzimas ALOSTÉRICAS
Afinidade da enzima 
pelo substrato 
Modifica com a variação da 
concentração do substrato
Curva sigmóide 
Característica das enzimas 
alostéricas
Márcia Soares
Enzimas Alostéricas
Centro Alostérico
Substrato
Mudança de conformação
Alteração na atividade
Oligômero
Protômeros (cada subunidade)
Formado por 
subunidades idênticas
Centro Ativo
Moduladores ou Efetores Positivos
Negativos
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Márcia Soares
Enzimas
•Regulação da Atividade Enzimática
Regulação da Atividade Enzimática
Clivagem Proteolítica
Enzima Ativa
Pró-Enzimas
Zimogênios
Clivagem Proteolítica
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Enzimas digestivas - Proteases
Pepsinogênio  Pepsina
Tripsinogênio Tripsina
Quimiotripsinogênio  Quimiotripsina
Regulação da Atividade Enzimática
Clivagem Proteolítica
Regulação da Atividade Enzimática
Controle à Nível Gênico 
Mensagem genética
RNAm
PROTEÍNA
(ENZIMA)
Algumas enzimas não são sintetizadas 
continuamente pelas células
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Enzimas Constitutivas
• Organismos possuem independente da 
constituição do meio
• Organismos sintetizam quando em presença 
do substrato
Enzimas Induzidas ou Adaptativas
Indução enzimática
Exemplo:  galactosidase (Lactase)
Regulação da Atividade Enzimática
Controle à Nível Gênico
INDUTOR
presente
Síntese da 
proteína
INDUTOR
ausente
NÃO ocorre 
a síntese da 
proteína
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lac operon (E. coli)
RNA 
polimerase
Genes estruturais 
NÃO serão 
transcritos
Proteína NÃO
será sintetizada
Gene regulador
Regulação da Atividade Enzimática
Modificação Covalente
Fosforilação de enzimas 
Mediada por intervenção hormonal
Regula inúmeros processos metabólicos
Proteínas quinases e fosfatases
(ENZIMAS)
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Regulação da Atividade Enzimática
Modificação Covalente 
Fosforilação
Enzima-OH Enzima-OPO3
-
ATP ADP
H2OHPO4
-
Quinase
Fosfatase
EX:
A fosforilação de uma enzima pode aumentar ou diminuir a sua atividade
Adrenalina
Glucagon
Adenilato Ciclase
Inativa
Adenilato Ciclase
Ativa
ATP AMPc
PKA inativa
Proteína quinase 
dependente de AMPc
PKA ativa
Fosforilase 
quinase inativa
Fosforilase 
quinase ativa
P
Glicogênio 
Fosforilase
ativa
P
Glicogênio
Fosforilase
inativa
Degradação 
do glicogênio
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Enzimas e a Clínica Médica
Além do papel central das enzimas na bioquímica, 
a atividade das enzimas no sangue fornece 
informações importantes para o diagnóstico de 
doenças.
O perfil da atividade de enzimas no soro está 
relacionado à processos patológicos.
Enzimas e a Clínica Médica
As enzimas podem ser classificadas em
dois grupos
Plasma-específicas
secretadas ativamente no plasma por 
certos órgãos, tendo papel funcional no 
plasma
Não-plasma específicas
produzidas pelas células durante o
metabolismo celular normal. São enzimas
intracelulares, sem função fisiológica no
plasma.
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Liberação de enzimas a partir de células 
normais e de células doentes ou expostas 
a um trauma
Enzimas com função adicional 
não enzimática
Proteínas multifuncionais
Proteína Função Função adicional 
Fosfoglucose isomerase Enzima glicolítica Citocina
EF-1 Fator de elongação Agrupa actina
Ciclofilina Peptidil-prolil cis-trans isomerase Regulador de calcineurina
Fator inibitório de macrófago (MIF) Ativador de macrófagos e células T Fenilpiruvato tautomerase
PutA Prolina dehidrogenase Repressor transcricional
Aconitase Enzima do ciclo de TCA
Tioredoxina Mantem grupos SH reduzidos Subunidade do fago T7 DNA isomeraseTrombina Protease na coagulação Ligante para receptor de superfície celular
Timidilato sintase Enzima na síntese de DNA Inibidor de translação
FtsH Chaperona em bactéria Metaloprotease
LON Protease mitocondrial Chaperona
Metionina aminopeptidase 2 Peptidase Protege elF2 de fosforilação