aula pratica cultivo

Prévia do material em texto

Cultivo
Para o desenvolvimento da virologia no âmbito da ciência isso foi muito necessário para que se pudesse obter quantidade de vírus nos laboratórios e permite estudos biológicos,físico químicos e bioquímicos nesses agentes de modo a propiciar essas conclusões e obter conhecimento.Com o avanço tecnológico pode se fazer uma virologia que precinde o tipo de vírus,mas existem varias substancias que é imprescindível.Esse slide algumas das finalidades gerais mais freqüentes para o cultivo para produção de vírus em laboratório.Essa produção de antígenos virais pode ser usada para testes sorológicos,para pesquisarum anticorpo num animal usamos um antígeno viral.Essa produção de antígenos virais evidentemente também poderia ser justificada para produção de vacina,ficou separado no slide porque quem fez pensou dessa maneira. Mas alem de poder utilizar o antígeno viral como imunógeno,a gente pode utilizar também como um antígeno num teste sorológico por exemplo.Essa multiplicação,esse cultivo de vírus em laboratório pressupõe um meio de cultura para se fazer esse cultivo de vírus,só que na verdade não existe um meio de cultura para cultivar vírus e não existe porque os vírus são ametabolicos e não podem se desenvolver fora de uma célula que ele precisa.Para cultivar vírus há necessidade de um sistema hospedeiro e não de um meio de cultura.Do ponto de vista histórico,o primeiro sistema hospedeiro para cultivo de vírus que foi desenvolvido ou que foi selecionado foram os animais de laboratório,os animais de laboratório que são usados para sistema hospedeiro para cultivo de vírus são os mesmo animais de laboratório que foram tidos na imunologia,aquelas espécies de animais,aquelas linhagens pertencentes aquelas determinadas espécies que podem sermantidas num ambiente controlado laboratorial,um laboratório especifico que recebe o nome de biotério.Aquelas subdivisões,aquelas categorias de animais de laboratório,as quais refletem o controle biológico ao qual esses animais são submetidos,aquelas categorias de animais convencionais,animais notobioticos são todas elas validas para essa situação em que os animais são utilizados como sistema hospedeiro para todo tipo de vírus.Animais SPF apresentam um subgrupo dos animais de laboratório que são testados para serem certificados quanto estarem isentos de alguns patogenos característicos daquela espécie animal,SPF,livre de agentes patogênicos determinados.Então é um animal de laboratório criado num ambiente controlado de biotério que é testado laboratorialmente para ser certificado quanto a ausência de alguns agentes patogênicos de natureza viral ou bacteriana ou parasitaria que sejam peculiares e relevantes para aquela espécie animal.
A inoculação nesses animais de laboratório pode ser feita por essas razões :Detecção de vírus em animal suspeito,produção de vacinas,prova biológica,bioterismo e questões éticas.O ultimo item fala de uma questão geral sobre todo trabalho com animal de laboratório que é da bioéticaBioterismo:nome da disciplina que se da para estudar o trabalho no biotério,o cuidado do animal no biotério.
O bioterista não é exclusivamente medico veterinário,pode ser qualquer profissional da área biomédica que se especializepara tal.O que é exclusivo do veterinário é a medicina do animal de experimentação .Um aspecto do bioterismo é o controle sanitario,o aspecto medico disso,isso é exclusivo do medico veterinário ,mas fazendo uma comparação é como se pensasse o zootecnista dentro da fazenda e o veterinário dentro da mesma fazenda,tem espaço para ambos,um se ocupa dos aspectos gerais de criação e de prevenção a doença,na medida em que o manejo contribui a prevenção de doença dos animais e o veterinário que trabalha preventivamente também na prevenção da doença ,mas ai muito exclusivamente no processo de cura,do tratamento,dos agravos a saúde.Isso existe aqui nessas proporções para fazer o manejo ,o cuidado do animal de laboratório pode ser qualquer profissional da área biomédica com especialidade para isso,mas o aspecto medico inerente a isso é o medico veterinário.
Prova biológica: Feita no contexto do diagnostico,imagina utilizar a inoculação de um vírus no animal de laboratório para fazer um diagnostico,fundamentalmente isso é uma prova biológica,é como um desafio,exemplo:estou testando uma vacina e depois que considero que essa vacina está pronta aplico num lote de animais e depois desafio esses animais inoculando o vírus patogênico,é uma prova biológica,vou ver se a vacina faz efeito,protetor.Tento reproduzir a doença no animal,mas utilizando alguma coisa que me permita tirar alguma conclusão sobre prevenção ou diagnostico,tem outra aplicação de prova biológica que é para diagnostico de raiva ,uma das maneiras de diagnosticar raiva é inocular material do cérebro do animal suspeito de ter a raiva num camundongo susceptível se ele desenvolver a doença eu concluo que o animal de onde proveio esse material que eu inoculei nesse animal de laboratório tinha mesmo o vírus da raiva,isso também é uma prova biiologica,Esse aspecto da prova biológica só posso fazer em animal,não existe um sistema hospedeiro de vírus que tenha conseguido suprir esse tipo de necessidade,a gente precisa diminuir o uso de animais na experimentação cientifica,é uma questão ética mais relevante,mas não em todas as situações,essa daqui é uma delas que por enquanto não foi possível.Para produção de antígenos vacinais ou produção de antígenos para kits de diagnostico dependendo do caso posso usar outros sistemas hospedeiros que não os animais,mas em alguns casos ainda assim eles tem importância.
Mas como utiliza o animal como sistema hospedeiro para cultivar vírus?
Evidentemente precisa se eleger uma via de inoculação,um animal de laboratório nos da um numero razoalvelmente grande de vias de inoculação diferente.Qual a via escolhemos para calcular vírus? Depende do vírus que estamos querendo calcular no animal e o conhecimento prévio que temos sobre aquele vírus ,quero inocular um vírus que sei que vai encontrar células permissivas no encéfalo do animal,então nesse caso está fazendo uma via intracerebral ou pode encontrar células permissivas para o vírus no tecido subcutâneo e ai está fazendo via subcutânea.(Nas imagens do slide 4 subcutânea e intradermica),pode se pensar numa via intraperitoneal,endovenosa,intramuscular,uma enstilação nasal,são possibilidades de inoculação do vírus,mas como elege qual é essa via de inoculação? De acordo com o conhecimento do vírus que deseja se cultivar e do tipo de permissividade que ele encontra,que tipos celulares são os melhores para replicar esse vírus? Essas é umas das coisas a se pensar quando calcular vírus.Quando inoculo material suspeito de ter vírus,eu querendo produzir massa de vírus,se produzir massa de vírus não se tem duvida que o vírus está presente naquele material ,mas eu quero só aumentar a quantidade de vírus para uma finalidade qualquer de laboratório ou de industria,então inocula-se sabendo qual é o vírus só para aumentar a quantidade,ai se chama produzir massa de vírus,se pode fazer ISSo em animal de laboratório. Então se quer que o animal durante o processo de inoculação e após a inoculação ele não tenha nenhum agravo importante a sua saúde ou de maneira nenhuma para que o sistema orgânico desse animal consiga produzir ao Maximo o vírus que está sendo inoculado nele.Quero evitar que o animal durante o processo de inoculação sofra lesões em tecidos adjacentes ou inerentes a via de inoculação que estou praticando ,não vou querer que esse animal no local da inoculação tenha infecções secundarias,eu não vou querer que junto com meu inoculo eu introduza outros patogenos no organismo do animal,tudo isso poderia mascarar a quantidade de vírus produzido ou eventualmente num caso extremo poderia diminuir a próximo de zero a produção de vírus se o animal morre muito rápido.Então para eu atender a esse tipo de demanda ,é preciso fazer uma boa preparação do inoculo no sentido de ele estar descontaminado livre de bactérias e fungos,sótenha o vírus que eu quero inocular , é preciso fazer uma antissepsia adequada na via de inoculação para miminizar as possibilidades de inoculação de microorganismos da microbiota da pele junto dessa via parenteral de inoculação,é preciso fazer um método de contenção adequado para que durante o trabalho o animal não se debata e não seja contido de maneira adequada a ponto de que essa contenção induza luxações,escoriações,fraturas,traumatismos de qualquer ordem que possam acontecer num trabalho de contenção mal feito.Então tudo isso é absolutamente relevante nessa situação ,a utilização do animal como um modelo,como um sistema hospedeiro para cultivar vírus.Naturalmente após essa inoculação feita desse jeito,o animal precisa voltar para o biotério,existem pelo menos 2 tipos básicos de biotério,3 tipos básicos de biotério tem o biotério de experimentação(onde se faz esse tipo de pratica,onde o animal será mantido após inoculação),inoculado com agente infeccioso como é um vírus esse animal após inoculação nunca pode voltar para aquele biotério onde estão sendo mantidos outros animais que não estão sendo utilizados ainda em experimento nenhum,esse é um cuidado básico,então o biotério para criação e manutenção de animais de laboratório é um e o biotério para experimentação é outro,fisicamente separados um do outro,o biotério de experimentação era também conhecido como infectorio,esse termo tem entrado em desuso em favor da terminologia biotério de experimentação.Então esse biotério para onde esses animais são mandados são ambientes controlados também para garantir que não haverá risco de contaminação sobresalente,o animal já está inoculado,mantido nas condições controladas do biotério e não quero que nada de fora venha a agravar ou modificar o estado de saúde ou de doença desse animal,esse é um cuidado importante. 
Como conduz esse experimento após a inoculação?
Precisa-se fazer observações constantes,pelo menos diárias do animal,preciso conhecer bem qual é o comportamento e quais são os parâmetros clínicos adequados dessa espécie a qual estou trabalhando,precisa-se acompanhar temperatura,movimentos respiratórios as vezes,peso do animal (se aumenta,se diminui),a ingesta de água,(se aumenta,se diminui),a ingesta de ração(se aumenta,se diminui),alem de outras observações referentes a estado de pelagem,por exemplo,comportamento(se altera,se não altera),tem que ir anotando essas coisas para identificar em que momento esse animal apresenta uma saida de normalidade.A replicação do vírus nesse sistema hospedeiro pode ser acompanhada do surgimento de uma doença e é preciso acompanhar,monitorar isso diariamente pelo menos para saber exatamente em que momento ele começa a me dar indícios de que a replicação viral está acontecendo numa intensidade tal que comece a alterar o estado de saúde do animal.Quando está fazendo um experimento com um animal em que o efeito da inoculação daquele vírus já é bem conhecido existe um limite ético para manter o animal infectado,ex:coelhos inoculados com herpes vírus de ovinos nesse caso,já é bem conhecido que produz uma doença letal em coelho ,tinha que fazer todo experimento,todas observações até o animal apresentar 41 graus de febre ,o comitê de ética estabelecia isso:diariamente tinha que fazer o monitoramento clinico dos animais que incluía a temperatura e a verificação da temperatura era o limite do pesquisador,quando chegava a 41 graus tinha que fazer eutanásia dos animais porque já era sabido o que acontece a partir do momento que essa febre atinge esse limiar,a partir daí é só o desenvolvimento clássico da doença,só sofrimento e dor para o animal,não pode mais manter,não precisa mais descrever o que está descrito,já sabia o que era a doença,queria estudar o que acontecia em termos de ativação gênica do vírus na infecção experimental,então tem esse outro aspecto,eu sei já o que acontece,preciso usar o animal,mas tem limites cientificamente estabelecidos.
Como recolho o vírus do animal?
Inoculei,observei indícios clínicos que me sugerem a produção de vírus,que o experimento deu certo,como faço para recuperar o vírus?Ponho alguma material desse animal inoculado,sempre mesmo que a colheita desse material não implique na morte desse animal,tenho que sacrificar esse anima,não tem nenhum sentido o animal entrar em um experimento como sistema hospedeiro para cultivo de vírus e depois do experimento essse animal ser mantido vivo ,ele vai correr o risco de disseminar o vírus para outros animais e até para pessoas ,dependendo do vírus,então se entrou no experimento,tem que morrer!!Mas antes da morte nos da uma ajuda importante para elucidar algum detalhe muito bem definido qual é e atraves de metodologias muito bem justificadas para que a sociedade cientifica possa aceitar o uso desse animal na experimentação.Então sempre qualquer que seja material que eu vá colher,esse animal vai ser humanitariamente sacrificado.Depois desse sacrifício ou durante esse sacrifício colhe-se tecidos desse animal,os tecidos podem ser dos mais diversos,vou eleger qual será essse tecido de acordo com o conhecimento prévio sobre a biologia desse vírus que estou trabalhando.Se não conhecer a biologia desse vírus,for um agente novo,vai colher diversidades de tecidos,os diferentes sistemas importantes :SNC,sistema linfóide,linfonodos periféricos,placa de payer,tecido muscular,sangue,uma gama de tecidos podem ser colhidos para que faça então essas investigações básicas sobre o espalhamento do vírus desconhecido no organismo do animal.Os animais de laboratório não são os únicos sistemas hospedeiro,dentro de uma perspectiva histórica foram os primeiros a serem desenvolvidos para sistema hospedeiro para cultivo de vírus.
O segundo sistema hospedeiro para cultivo de vírus são os ovos embrionados de galinha,são embriões de galinha,devem ser encarados como animais de laboratório pois precisam ser mantidos em condições controladas,mas não precisa de um biotério para manter ovo embrionado,precisa de biotério para manter a poedeira que vai dar o ovo embrionado. O ovo embrionado representado esquematicamente no slide 5 tem vantagens interessantes em relação ao animal de laboratório.O animal de laboratório tem serie de demandas,tem manejos específicos que precisam ser atendidos em termos de controle ambiental , de necessidade de alimentação,de limpeza,eventualmente algum tratamento medico antes de experimentação.No caso do ovo embrionado ele já vem dentro da gaiolinha dele com a alimentação garantida e não precisa nem fazer limpeza pois ele já tem todo sistema embutido nele e essa foi uma das razoes principais pelas quais pensou utilizar isso como uma alternativa aos animais de laboratório. Pensa-se que usando ovo embrionado tenho restrição quanto ao numero de vírus que pudessereplicar nesse sistema hospedeiro,isso acontece,mas não é uma restrição tão grande quanto se imagina,e não é tão grande pois existe a possibilidade de adaptação do vírus a um sistema hospedeiro experimental.Isso é valido mesmo para os casos de animais de laboratório,posso inocular vírus de ovino em coelho como foi dito,mas possoter vírus de bovinos,de caninos,de outras espécies,eqüinos sendo inoculados em camundongos.O mesmo processo que permite a adaptação de um vírus de uma dessas espécies de importância veterinária a uma espécie de animal de laboratório,apesar de falar só de mamíferos ,é valida para pensar numa adaptação do vírus de mamífero para a ave,o mesmo processo que permite adaptação do vírus de animal,de importância veterinária ser cultivado em laboratório pelo menos em principio pode permitir a adaptação do vírus da espécie de interesse veterinário num ovo embrionado de galinha. O ovo embrionado de galinha também pode ser subdividido em ovo de galinha convencional ,ovo de galinha SPF e ovo de galinha notobiotico desde que a poedeira fertilizada que vai originar esse ovo seja mantida em bioeterios com esse nível de biosegurança adequado para cada uma dessas categorias,então tem ovo convencional,ovo SPF,ovo notobiotico,resumindoessas categorias de animal de laboratório.Semelhante ao que tem no caso dos animais de laboratório ,tem algumas possibilidades de vírus com formação distinta,os números de vírus inoculação no ovo embrionado não são tão diversificadas quanto aquelas que descrevi no animal de laboratório.Nesse caso tem três vias que são as mais comumentes utilizadas na virologia,no cultivio de vírus em ovo embrionado; inoculação na vesícula corontoidiana ou alantoidiana,(também pode ser inoculado na vesícula amniótica),ou seja pode se inocular em anexos embrionários ou até no próprio embrião,inoculação na membrana corontoidiana,na superfície dessa membrana que delimita esse anexo embrionário que é a vesícula corontoidiana,cavidade corontodiana (via muito frequente e fácil de ser utilizada).
Como escolhe essa via de inoculação?
Vai depender do conhecimento básico da biologia do vírus que quero cultivar,como faço essa inoculação? Utilizando técnica asséptica fazer um orifício na casca do ovo através do qual eu possa introduzir uma agulha e com ajuda dessa agulha inocular o material que eu suspeite,que eu saiba que tem um vírus que eu queira que seja cultivado ali.Depois tenho que ser capaz de selar esse orifício para garantir a estanqueidade do conteúdo do ovo em relação ao ambiente externo e esse ovo precisa voltar para camara de inoculação porque o embrião precisa de continuar se desenvolvendo para dessa maneira ele poder produzir vírus,fazer o ciclo replicativo do vírus.
Então a necessidade de trabalhar com material estéril , com um inoculo bem tratado,bem processado no que diz respeito a não ter bactérias ou fungos contaminando esse inoculo. Preciso fazer uma antissepsia da superfície da casca do ovo para depois fazer inoculação e voltar com esse ovo embrionado para camara de incubação e assim não ter nenhuma contaminação do ovo e dessa maneira poder ter o ciclo de replicação do vírus acontecendo da maneira que espero que aconteça. Nesse caso como vou saber como está evoluindo a infecção viral? Não vou observar sintomas como descrevi para os animais de experimentação,mas posso acompanhar o desenvolvimento do embrião,posso fazer procedimento que tem nome de ovoscopia,que é um processo de transiluminação,coloco ovo na frente de um feixe luminoso em ambiente escuro,dessa maneira posso observar onde está o embrião,posso observar algumas estruturas internas do embrião,tipo camara de ar,saco da gema e posso observar a membrana corontoidiana porque ela é ricamente vascularizada,essa vascularização consigo observar na ovoscopia,então posso acompanhar após a inoculação se há alguma alteração nessas estruturas internas do ovo,através da ovoscopia.Mas tem uma limitação importante,o tempo de incubação do ovo,ovo de galinha em 21 dias o embrião de galinha se desenvolve e eclode.Então não posso fazer nenhuma incubação que exceda esse tempo,isso é muito importante.Se eu permito que esse ovo,esse embrião continue a se desenvolver,se ele não tiver nenhum retardo,nenhum problema no seu desenvolvimento por conta da inoculação viral,não posso permitir que esse pintinho ecloda porque se ele eclodir vai ter uma contaminação ambiental importante,isso não é tolerado no trabalho controlado cientifico com vírus,então tenho que organizar todo meu trabalho de inoculação em ovo embrionado desde o momento da inoculação ,isso vai definir também o tempo de incubação que vou fazer para que tudo aconteça antes dos 21 dias de incubação.A idade media para inocular vírus de ovo embrionado varia dos 10 a 11 dias de incubação,passado esses 10,11 dias de incubação posso voltar o ovo para incubação e ficar acompanhando esses parâmetros até o 18° dia de desnvolvimento do embrião,quando normalmente abre o ovo e colhe-se materiais desse ovo para pesquisar se houve sucesso ou não na produção de vírus.
Como que se evidencia lesões macro e microscopicas nas membranas internas do ovo,nos anexos embrionários,fundamentalmente a membrana coroidiana; alteração no comportamento do animal(o embrião de galinha se movimenta dentro do ovo se ele está vivo e pode se perceber isso durante a ovoscopia) ou morte do embrião; Depois posso em materiais extraidos do ovo após a incubação fazer pesquisa do vírus.
Slide 8:embrião de galinha com mais ou menos 11 dias de incubação; tem um ovo que foi aberto na região de camara de ar está olhando de cima desse ovo: vê-se o embrião bem nitidamente,vesícula vitelínica,a gema do ovo,nutrientes para o embrião e vê também vasos sanguineos que são muito importantes para nutrição,para as trocas gasosas desse embrião,esses vasos estão fazendo parte da membrana corontoidiana que só se desenvolve no ovo embrionado,no ovo de galinha virgem,no ovo de galinha solteira não tem desenvolvimento desse anexo embrionário,só a gema evidentemente . Esse outro estruturas normais de ovo que não foi inoculado com coisa alguma. Imagens mostrando o trabalho de colheita de material do ovo após a inoculação ,é uma abertura na casca do ovo feita na região da camara de ar e com a agulha acoplada a uma seringa se aspira liquido do ovo,o liquido corontoidiano. Tem o albumem também,mas a medida que o embrião vai desenvolvendo a quantidade de albumem diminui e aumenta o liquido corantoidiano,muitas vezes bastante rico em vírus.Tem dois embriões na foto,o de cima é normal e o de baixo está hemorrágico,um exemplo de alteração macroscópica que pode se ter quando a inoculação de vírus em ovo embrionado de galinha.Virus de encefalomielite de cavalo inoculado em ovo embrionado pela via da cavidade corontoidiana produz esse tipo de lesão hemorrágica no embrião de galinha,esse animal morre,nesse nível de lesão,ele não está vivo. E na outra imagem tem membrana corontoidiana extraída do ovo aonde se observa lesões no epitélio dessa membrana,aqui uma lesão só e aqui uma grandequantidade de lesões que acontecem quando há inoculação de vírus com herpes,pode fazer esse tipo de lesão na membrana corontodiana.
Finalmente teve o desenvolvimento dentro de uma perspectiva de historia de um terceiro sistema hospedeiro que pode ser usado como cultivo de vírus,esse sistema hospedeiro são as culturas de células.
As culturas de células precisam de um meio de cultura para a célula,não para o vírus.Chama-se de cultura de célula animal a estratégia para manutenção de células animais vivas retiradas do tecido de origem ,faz –se uma esplante de células de um tecido animal e trabalha-se com um único tipo de células e manter essas células ão de células animais vivas retiradas do tecido de origem ,faz –se uma esplante de células de um tecido animal e trabalha-se com um único tipo de células e manter essas células artificialmente vivas num meio de cultura e numa camara de incubação adequados. Essas células vão iniciar processos de divisão mitótica nesse ambiente artificial e vão estabelecer cultura de células . Tem categorias de culturas de células definidas por vários parâmetros,o mais importante é aquele que define as células de cultivo primário e as células de linhagem.
Algumas aplicações desses cultivos celulares: Sistema biológico para cultivo de vírus: São muito parecidos esses objetivos mas estudando o vírus em cultura de células tem facilidade de estudar de observar fenômenos celulares e bioquímicos inerentes a esse vírus,a essa infecção viral,então é um sistema que permite de maneira bastante importante esse tipo de observação.Os estudos de patogenia devem ser vistos com alguma reserva,porque numa cultura de células não posso em hipótese nenhuma achar que estou observando o desenvolvimento de uma doença tal qual se dê no organismo animal ,a diversidade de tecidos que tem no organismo animal posso ter um quadro muito mais fiel ,muito embora não igual ao que tem na natureza. Não tem sistema hospedeiro de laboratório que mimetize ou que reproduza integralmente o que acontece na infecção em um animal,então é importante fazer esses experimentos em sistema hospedeiro em laboratório para eu ter condições controladas a ponto de poder fazer observações cientificas no processo,mas transporesses dados das observações em laboratório a realidade do campo vai uma grande distancia,é preciso complementar com as ciências clinicas,pensando na caracterização da doença,da patogenia de uma doença em particular.
Slide 10:A maior parte das culturas de células desenvolvem monocamadas celulares,a qual é uma camada que é formada em espessura de uma única célula,tem um superfície ..... banhada pelo meio de cultura liquido,nessa superfície as células se desenvolvem,normalmente com a espessura de uma célula,vamos ter uma célula do lado da outra até formar uma monocamada,essa monocamada vai ter em momentos diferentes do seu desenvolvimento níveis de confluência diferentes ,no começo ela não vai estar muito confluente,depois ela vai se tornando mais confluente a medida que as mitoses ocorrem ,confluência é proximidade entre as células. No caso da foto, as células estão bem grudadinhas,bem confluente e na outra níveis intermediários de confluência. Esse meio de cultura é liquido,em algumas situações especificas usa se germificante,mas normalmente é liquido,tem uma mistura de aminoácidos ,contem alguns sais para garantir ph dos sistemas de tamponamento,açucares e normalmente fazemos suplementação com soro sanguineo,soro fetal para colocar fatores de crescimento:toda uma gama de substancias de ação hormonal que estão presentes no soro dos animais,mas que não sabemos precisar do ponto de vista qualitativo ou quantitativo quem são,suplementando com esse soro asseguramos um aporte de estimulo ao metabolismo dessas células,que essas substancias de ação hormonal terão. No geral,o meio de culura das células tem essa composição. Em alguns casos esse meio é suplementado com antibióticos e antifúngicos,mas não é uma obrigação ,tudo depende do tipo de experimento e da pratica,rotina de culturas de células que esse laboratório tem.
Slide 11 e 12: Cultivo primário : Como que se obtem uma cultura de células ; é aquela cultura de células que retirei do organismo animal e levei para o ambiente artificial de crescimento,então começa aqui uma remoção cirúrgica do órgão que contem o tipo celular que eu quero cultivar,desse órgão estão sendo retirados os tecidos que não tem aquele tipo celular que me interessa cultivar ,então retirou uma gordura perirenal ou glândula suprarenal(ele não sabe o que é). Na outra fazendo corte sagital do rim ele está tirando a capsula renal,está querendo cultivar células epiteliais renais,então ele retira a capsula,depois de feito o corte sagital ,ele retira região da medular do rim,tem muito tecido conjuntivo e pouca célula epitelial renal ,essa região está cheia de alça de henle e um monte de tecido conjuntivo,enquanto que na cortical tem um monte de túbulos contornados proximais ,tem um monte de nefron,então aqui tem mais riqueza do tipo celular que me interessa ,então está retirando essa região medular dorim e depois faz fracionamento do órgão,esse fracionamento se faz porque a intenção é ter celulas individualizadas para que elas possam estabelecer o cultivo,então o desejado é que pudesse separar célula por célula,ele começa esse trabalho fazendo essa fragmentação do órgão,é claro que ele não vai dividir célula por célula,é impossível fazer isso,mas ele diminuindo o tamanho de fragmento do órgão facilita o trabalho da etapa subseqüente que é de promover uma digestão enzimática da matriz extracelular que mantem essas células epiteliais unidas umas as outras,em ultima analise é a matriz extracelular que faz esse trabalho,então ele está fazendo o que se chama de tripisilização,utiliza tripsina que é uma enzima proteolítica que digere vários tipos diferentes de proteína,ela faz parte da estratégia digestiva do nosso sistema,do nosso estomago,então diminuindo o tamanho do órgão minimizo a possibilidade de risco da tripsinização para a propria célula.Aqui então ele está colocando uma barrinha magnética dentro desse frasco e na outra foto no banho Maria sob agitação,tem destruição da matriz extracelular para individualização das células ,acompanhando no microscópio esse processo ele,o operador vai ver quando as células estão suficientemente separadas e nesse momento ele para a tripsinização,inicialmente colocando esse frasco num banho de gelo,tirando da temperatura ótima para ação da tripsina que é 37° essa ação vai diminuindo progressivamente até virtualmente parar,então ai vai estar preservando as células.Depois que tem essas células vai ser feito um processo de lavagem,centrifugação e dessa maneira complemento retirando a tripsina e depois coloca essas células individualizadas no meio de cultura para células e ai tem desenvolvimento ,inicio do desenvolvimento do cultivo celular propriamente dito ,isso é cultivo celular primário.Essas células cultivadas elas estão muito pouco adaptadas a essa condição artificial de crescimento e por conta disso não resistem a tentativas de transferência da monocamada produzida para uma outra garrafinha,outro frasco com meio de cultura novo.Essa transferência chamamos de passagem,então um cultivo primário ele tem dentre as suas características o fato de não tolerar passagens ou tolera um numero muito pequeno de passagens .
Por qual motivo se faz passagem de cultura de células ? Para evitar todo esse trabalho,depois da cultura de células estabelecidas,se fizer uma nova e for uma cultura primaria tem que voltar la no animal,pegar outro órgão e fazer todo esse trabalho para estabelecer outra cultura,se puder tirar da garrafinha que já preparou as células e colocar em uma outra isso já seria uma passagem.Os cultivos primários em geral não tem células com essa capacidade de transferência e ai cria-se a distinção em células primarias,células de cultivo primário e células de linhagens,essa ultima foram células primarias que sofreram mutações que as tornaram mais adaptadas a condição artificial de cultivo e por isso elas resistem serem transferidas de uma monocamada para formar uma nova em outra garrafa.
Dentre as células de linhagem tem um subgrupo de células de linhagem que são chamadas de células de linhagem continua,essas células sofreram muitas adaptações,de modo que elas podem ser mantidas indefinidamente no meio de cultura artificial,não é mantida aquela mesma monocamada para sempre,mas através de passagens,tem uma monocamada,depois retira algumas células dessa monocamada,levo para um meio de cultura novo e uma nova monocamada se forma ali. Nas células de linhagem continua isso pode ser feito indefinidamente,essas células sofreram muitas mutações,frequentemente essas são células neoplásicas,enquanto que as células de linhagem que não são continuas,elas sofreram mutações que as tornam mais adaptadas ao ambiente in vitro mais adaptadas que as células de cultivo primário,mas não tão adaptadas a ponto de poderem ser mantidas ineterruptamente através de passagens no laboratório,quem chegou nesse estagio são as células de linhagem continua.
Slide 13: Linhagem de célula continua que é muito famosa,muito utilizada nos laboratórios do mundo inteiro no âmbito da virologia e fora dela que chama linhagem Hela,foi chamada assim porque foi obtida a partir de um carcinoma de colo de útero de uma mulher,esta senhora que teve câncer de colo de útero e a rebelia dela e dos descendentes dela, amostras desse tecido neoplásico dela foram submetidas a um procedimento parecido com o outro que foi descrito de obtenção de células separadas e a partir daí muito rapidamente se descobriu quue essas células tinham a capacidade de serem mantidas ineterruptamente por passagens sucessivas no laboratório,foram um dos primeiros exemplos de linhagem continua de célula,alguém patenteou isso como um produto e a família dela não recebeu um centavo. Laboratorios pelo mundo que são referencias em linhagens celulares e essas pessoas,instituições vendem essas linhagens para os interessados.No Brasil tem algumas dessas.A medida que a gente mantem as células em laboratório elas ficam sujeitas a sofrerem processos de adaptação,o processo de adaptação é ineterrupto e continuo ,então se a gente começarcada um a ter sua hela,cada um ter a sua linhagem de célula e manter cada um do seu jeito no laboratório não tem nada que garanta que dentro de 5 ou 10 anos aquela mesma amostra que foi mandada pro laboratório daqui e uma outra que foi mandada para o Piaui,não tem muita garantia que elas continuarão as mesmas células,o mesmo .... genético,pode ter acontecido alguma mudança genética inadivertidamente que faz alguma diferença ,que constitui uma diferença importante na capacidade de resposta dessa célula em relação a do Piauí e mais ainda em relação a fonte original dessa linhagem de célula por isso que precisamos ter essas referencias. ATCC(Coleção de culturas de células dos EUA)- é uma das referencias de fornecimento de cultura de célula e de bactérias,vírus e fungos,eles tem uma coleção ampla e bem conceituada,é uma identificação,obteve de um fornecedor idôneo,se fosse do instituto biológico de são Paulo da mesma maneira.
Como que inoculamos uma célula com o vírus?
Basta retirar o meio de cultura liquido e diretamente sobre a monocamada coloco o inoculo viral,preciso retirar o meio de cultura para eu otimizar o encontro do vírus com a célula,depois de um períodos de adsorção,pode ser de uma hora,depende do protocolo,coloco meio de cultura novo e mantenho a incubação dessa célula na temperatura adequada para ela e faço observação ao microscópio diariamente para acompanhar como essa célula se comporta após a inoculação do vírus,a célula pode desenvolver efeitos citopaticos ,que é o nome que se dá ao conjunto de alterações morfológicas que podem aparecer na célula em cultivo em decorrência da infecção viral e tem alguns exemplos de efeitos citopaticos,mas então acompanho por essa observação microscopia das células molecular,e depois como é que eu faço para recuperar o vírus desse material,dessa cultura de células,pode se fazer de duas maneiras diferentes ou das duas maneiras : Pode pegar o sobrenadante da cultura de células do meio de cultura ou posso homogeinizar a própria monocamada,romper as células da monocamada e dessa maneira recolher os vírus que sejam liberados após o rompimento dessas células,mas de uma maneira geral tiro material do sistema hospedeiro na monocamada ou o sobrenadante da cultura ou a própria monocamada celular.