Apresentação CRISPR

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“Edição do genoma humano”
CRISPR-CAS9
Alunos: Ana Micaela Camini, Anelise Matzen, Luisa Capra e Maiara Pappen;
Disciplina: Biologia Molecular
Professor (a): Verônica Contini
1987 - Foi identificado DNA viral em bactérias E. Coli
O QUE É CRISPR?
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas);
Sistema imunológico adaptativo de bactérias que permite detectar o DNA do vírus e destruí-lo;
Esse sistema tem a proteína CAS-9 que é uma NUCLEASE, que é capaz de PROCURAR, CLIVAR e, por fim, DEGRADAR o DNA do vírus de uma maneira específica;
Esse sistema imunológico da bactéria conta com pequenos RNA’s de sequências específicas que detectam e silenciam ácidos nucleicos estrangeiros;
O sistema é composto por cas genes organizados em operons e a CRISPR (CONJUNTO) consiste de sequencias genômicas do alvo interespaçadas em repetições idênticas;
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3 - Na bactéria o sistema CRISPR permite que esse DNA seja arrancado do vírus e inserido em pequenos fragmentos dentro do cromossomo no DNA da bactéria
4 - Esses pedaços de DNA integrados do DNA viral são inseridos em um local chamado CRISPR
O locus é transcrito numa cadeia
percursora de RNA não codificante (pre-crRNA),
As cadeias repetidas do pre-crRNA sofrem
hibridação com um segundo RNA não codificante,
o trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA),
formando uma cadeia dupla de RNA que é clivada
e processada pela host factor ribonuclease (RNase)
III. A forma duplex de crRNA-tracrRNA associase
com a nuclease Cas9 e forma um complexo
responsável pelo reconhecimento e destruição do
DNA invasor in vitro
FASE DE AQUISIÇÃO
O DNA “estrangeiro” é incorporado nos lócus CRISPR
CrRNA BIOGÊNESE
Esse lócus é transcrito e processado em CrRNA
FASE DE IINTERFERÊNCIA
É formado o complexo CAS-CrRNA e o tracrRNA separado cliva o DNA estranho;
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O tracrRNA é necessário para a maturação de crRNA a partir de uma transcrição primária que codifica vários pré-crRNAs. Isso ocorre na presença de RNase III e Cas9 (12)
CAS 9
 Endonuclease, com dois domínios enzimáticos independentes, HNH e o RuvC;
HNH: Cliva a cadeia complementar de DNA;
RuvC: cliva a cadeia não complementar de DNA;
Durante a destruição do DNA alvo, os domínios de nuclease tipo HNH e RuvC cortaram as duas cadeias de DNA, criando rupturas de cadeia dupla
(DSBs) em locais definidos por uma sequência alvo de 20 nucleótidos dentro de um transcrito de crRNA associado (11, 14). O domínio HNH cliva a cadeia complementar, enquanto o domínio RuvC cliva a cadeia não-complementar.
A atividade de endonuclease de cadeia dupla de Cas9 também requer que uma pequena seqüência conservada, (2-5 nts) conhecida como protospacerassociada
motivo (PAM), segue imediatamente 3'- da sequência complementar crRNA
As regiões de crRNA complementares ao tracrRNA (laranja) e o DNA protoespaçador(amarelo). 
Os sites de clivagem estão mapeados em C e D
As proteínas cas9 constituem um grupo de enzimas que requerem uma estrutura de emparelhamento de base formada entre o ativador tracrRNA e o crRNA de direcionamento para clivar a dupla fita de DNA do alvo.
A clivagem do site específico ocorre na localização determinada pela complementaridade do pareamento de base entre o crRNA e um protoespaçador do DNA alvo e um pequeno motivo (PAM)
VARIANTES DA CAS9
CAS9 TIPO SELVAGEM:
Pode dividir o DNA – a cadeia dupla- em um local específico, ativando a maquinaria de reparo de ruptura de duplos. Pode ser reparado de duas maneiras:
NÃO HOMÓLOGA
HOMÓLOGA
INSERÇÕES/ DELEÇÕES
MUTAÇÕES
O primeiro é Cas9 de tipo selvagem, que pode dividir especificamente o DNA de cadeia dupla, resultando na ativação da maquinaria de reparo de ruptura de duplos (DSB). Os DSBs podem ser reparados pela via celular não-homóloga (NHEJ) (17), resultando em inserções e / ou deleções (indels) que perturbam o locus alvo. Alternativamente, se for fornecido um modelo de doador com homologia com o locus alvo, o DSB pode ser reparado pela via de reparação homologicamente direcionada (HDR), permitindo a realização de mutações de substituição precisas (Figura
VARIANTES DA CAS9
CAS MUTANTE – CAS9D10A-:
Cliva apenas uma das cadeias de DNA, ativando somente a via homóloga;
Com isso, os reparos de DNA induzem reparos homólogos de alta fidelidade, resultando em mutações indel reduzidas;
isso significa que ele cliva apenas uma cadeia de DNA e não ativa o NHEJ. Em vez disso, quando fornecido com um modelo de reparo homólogo, os reparos de DNA são conduzidos apenas pela via HDR de alta fidelidade, resultando em mutações indel reduzidas (1, 11,9). Cas9D10A é ainda mais atraente em termos de especificidade do alvo quando os loci são direcionados por complexos Cas9 pareados projetados para gerar
Nicks de DNA adjacentes (20) (veja mais detalhes sobre "nickases emparelhados" na Figura 2B).
VARIANTES DA CAS9
CAS COM DEFICIÊNCIA DE NUCLEASE:
Mutações H84DOA no domínio HNH e D10A no domínio RuvC inativam a atividade de clivagem da enzima, mas não impedem a sua ligação no DNA.
Ela pode segmentar especificamente qualquer região do genoma sem fazer a clivagem;
Pode ser usada como ferramenta da silenciamento ou ativação de genes.
Pode ser usada como ferramenta de visualização;
Portanto, esta variante pode ser usada para segmentar especificamente qualquer região do genoma sem clivagem. Em vez disso, ao se fundir com vários domínios efectores, dCas9 pode ser usado como uma ferramenta de silenciamento ou ativação de genes (21, 23-26). Além disso, ele pode ser usado como uma ferramenta de visualização. Por exemplo, Chen e colegas usaram dCas9 fundido com a Proteína Fluorescente Verde Avançada (EGFP) para visualizar seqüências de DNA repetitivas com um único sgRNA ou loci não-competitivo usando múltiplos sgRNAs (27).
GnRNA
Foi desenvolvido um GnRNA que é uma sequencia simples de RNA (única fita) que mimetiza o que ocorre naturalmente nas bactérias e, desta forma, promove o direcionamento da Cas9 para uma sequência alvo específica para que ela promova a clivagem dessa sequência.
Eucariotos -> Não possuem a maquinaria necessária para a ligação do tracRNA:crRNA, por isso, foi desenvolvido o GnRNA;
Doudna e Charpentier, baseado no sistema CRISPR de tipo II desenvolveram um sistema simplificado de dois componentes combinando trRNA e crRNA em um único de guia único sintético (sgRNA). Esse sgRNA programado cas9 mostrou ser tão efetivo quanto o cas9 programado com trRNA e crRNA separados para orientar alterações de genes direcionados;
Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que consiste na construção de uma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a capacidade de mimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma, promover o direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica para que esta promova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta disponível para atuação da maquinaria de reparo da célula e assim, promover edição da porção de interesse presente no genoma alvo. Tais fundamentos nos permitem considerar o sistema CRISPR (CRISPR/Cas) uma técnica rápida, com relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando comparada a técnicas anteriore
Mostrou que a endonuclease CAS9 pode ser programada com moléculas de RNA simples para clivar sites específicos de DNA aumento assim a possibilidade de desenvolver um simples e versátil de direcionamento de RNA para gerar quebras na dupla fita de DNA para a segmentação e edição de genomas.
NOCAUTE GÊNICO
Bloquear a expressão de um gene específico num organismo;
(AREND, MARKOSKI, PEREIRA, 2017)
Sistema CRISPR/Cas9 - mecanismo de reconhecimento do alvo. O RNA guia é projetado para reconhecer a sequência-alvo a ser modificada no DNA e introduzir modificações. Quando o pareamento de bases nitrogenadas ocorre (em função do anelamento da sequência-alvo com a região do protoespaçador do RNA guia), algumas modificações são
adicionadas (aqui, representadas pelo círculo) e a enzima Cas9 é acionada, causando quebras na dupla-fita de DNA (onde há falhas de pareamento em razão das mutações introduzidas). As quebras ativam os sistemas de reparo intracelulares que refazem a dupla-fita, aceitando as modificações oriundas do RNA guia. As novas mutações, de forma geral, causam falhas na sequência e geram proteínas não-funcionais. Mas o mecanismo pode ser utilizado também para corrigir mutações originalmente presentes no DNA e gerar proteínas funcionais.