Relatório proteínas do leite método de lowry

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Prática 4: Dosagem de proteínas do leite pelo método de Lowry
INTRODUÇÃO:
	As proteínas são de fundamental importância nos processos biológicos atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores através de membranas entre outros. Portanto, devido a essa gama de importância que as mesmas possuem é cada vez mais buscado processos que visam quantificar e dosar proteínas.
	Existem, atualmente, vários métodos disponíveis para dosagem de proteínas. Sabendo-se que as proteínas são constituídas por aminoácidos e que aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas podem ser detectadas a 270nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos que originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação (IB/UFF, 2017). Para tanto, os métodos disponíveis são: método de biureto, método de Lowry, método de Bradford, entre outros.
	Em 1870, Lambert Beer observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Ele relacionou dois princípios e criou uma lei, tais princípios são: A absorção da luz é maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada; absorção da luz é maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe. Esta lei pode ser expressa pela seguinte equação:
Log (I0/ I) =A=cl
A= absorbância
= absorvidade molecular ou coeficiente de extinção
c= concentração do material absorvedor
l= espessura da amostra da amostra através da qual a luz passa.
	O método de biureto baseia-se na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos. As ligações peptídicas das proteínas reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das proteínas no meio. 
	O método de Bradford é uma técnica para determinação de proteínas totais utilizando-se o corante Comassie, é um método rápido e sensível. Ele baseia-se na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas.
	No trabalho técnico vigente, foi-se usado o método de Lowry para dosagem de proteínas no leite (caseína e proteínas do soro). Este método apresenta leituras de absorbância em comprimento de onda 750 nm. Neste método, ocorre redução dos constituintes ativos do reagente de folin por meio das cadeias laterais de alguns aminoácidos que contribuem com quatro elétrons ou pela retirada de dois elétrons de cada unidade tetrapeptídica dos peptídeos e proteínas, que é facilitada pela formação do quelato entre o cobre (II) e proteínas. Após esta reação ocorrer, a solução desenvolve uma cor que será medida num espectofotômetro e comparada com uma curva padrão BSA versus absorbância.
	O material biológico analisado com este processo foi o leite. Biologicamente falando, o leite é o produto de secreção de glândulas mamarias de fêmeas mamíferas e possui alto valor nutritivo. Ele é constituído majoritariamente por água (livre ou ligada a outros componentes), a presença da mesma é demasiadamente importante, uma vez que confere ao leite propriedades físicas semelhantes as da água. Nele há aproximadamente 9g de carboidratos (lactose = glicose + galactose), 6,2g de proteínas (caseína e proteínas do soro), 6g de lipídeos (em sua maioria, triglicerídeos), sais minerais e vitaminas.
METODOLOGIA
Materiais
- Leite;
- água;
- Ácido clorídrico (5M);
- Reagente E;
- Reativo de Folin-ciocalteau;
- pipeta eletrônica;
- béquer;
- tubos de ensaio;
- papel filtro;
- espectrofotômetro.
Métodos
	No trabalho técnico vigente, foi aplicado o método de Lowry para a determinação e dosagem de proteínas no leite. Para tanto, foi necessário o preparo de duas amostras.
	Na primeira amostra, o objetivo era retirar a caseína, proteína abundante no leite. Sendo assim, 5 mL do leite foram adicionados a 30 mL de água em béquer cuja capacidade equivale a 100 mL. Posteriormente, adicionou-se ácido clorídrico até ocorrer a coagulação do leite, sendo assim, foi gasto um volume de 6 mL de HCl. Por fim, realizou-se a filtração desta solução. O material retido no filtro foi descartado e o filtrado foi separado para usos posteriores.
	A segunda amostra foi preparada com o objetivo de dosar todas as proteínas do leite. O mesmo foi diluído 80 vezes: 1 mL de leite em 79 mL de água.
	0,2 mL da amostra 1 foram transferidos a dois tubos de ensaio (experimento realizado em duplicata). A cada tubo foram adicionados 2 mL do reagente E e os tubos foram agitados por 10 minutos, posteriormente 0,2 mL do reativo de Folin-ciocalteau foram adicionados. O equivalente foi feito para a amostra 2. Foi-se realizado também um branco e, por fim, os tubos de ensaio foram deixados por 30 minutos em um armário escuro e depois suas absorbâncias foram medidas.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
	Os resultados obtidos através das medidas das absorbâncias estão expressos na tabela 01, juntamente com a média.
Tabela 01: Absorbâncias das amostras 1 e 2.
	
	Amostra 1
	Amostra 2
	Absorbância 750 nm
	0,231
	0,299
	Absorbância a 750 nm
	0,224
	0,295
	Média das absorbâncias
	0,2275
	0,297
	
	Uma vez que o leite foi filtrado na preparação da amostra 1, conforme descrito na metodologia do experimento, foi-se retirado do mesmo a caseína, logo haverá na mesma somente as proteínas do soro, sendo elas: albuminas e glubulinas. Na amostra 2, por sua vez, haverá também a caseína.
	Com os dados dispostos no roteiro, foi-se possível construir com o auxilio da ferramenta excel uma curva padrão de absorbância versus concentração de BSA. Os dados usados para a construção da curva encontram-se na tabela 02; a curva padrão encontra-se representada abaixo pela figura 01.
Tabela 02: dados usados para a construção da curva padrão.
Figura 01: curva padrão absorbância versus concentração de BSA
	Fez-se a regressão linear, para que o gráfico fosse transformado em uma reta. A reta obtida possui a seguinte equação:
Y=0,3074x + 0,0455
	 E um valor de R²= 0,9807.
	A partir da equação da reta, pode-se determinar a concentração caso seja informado a absorbância, ou pode-se determinar a absorbância sabendo-se a concentração. Logo, como foi medido, pelo espectrofotômetro, as absorbâncias é possível calcular a concentração das amostras 1 e 2;
Para a amostra 1:
Y = 0,3074x + 0,0455
0,2275 = 0,3074x + 0,0455
X= 0,5920 mg/mL
Para a amostra 2 obtêm-se, seguindo os mesmos cálculos da amostra 1, que a concentração é igual a 0,8182 mg/mL.
Na amostra 1, foi-se adicionado 6 mL de HCl, ocasionando a precipitação da caseína e por conseguinte retirou-se a mesma da amostra. Portanto, o valor 0,5920 mg/mL corresponde apenas à concentração das proteínas solúveis. 
Supondo que 1 L de leite resulte em 900 mL de soro:
1 L ----- 900 mL de soro
0,005 L ---- x mL de soro
X= 4,5 mL
Esse cálculo é necessário para descontar o volume de leite que se precipitou.
0,0024272 g ----- 4,5 mL de soro
X g --------- 1000 mL de soro
X= 0,5394 g
Logo, o soro do leite possui uma concentração de proteínas de aproximadamente 0,54 g/L.
A amostra dois quantificou, por sua vez, a quantidade total de proteínas presentes no leite. Sabendo-se que a concentração é 0,8182 mg/mL, pode-se calcular quantas mg há em 1 L de leite
	Logo, 
 0,8182 mg ------ 1 mL de leite
X mg ----- 1000 mL de leite
X = 818,2 mg = 0,8182 g 
Foram calculados os fatores de diluição para o leite e para o soro:
Fator de diluição = volume total da amostra/ volume inicial da amostra
Para a amostra 1:
Fator de diluição = 80/1 = 80
Para a amostra 2:
Fator de diluição = 41/5 = 8,2
	Como o leite estava diluído 80 vezes e o soro diluído 8,2 vezes, utilizando os fatores de diluição respectivamente tem-se:
Concentração da amostra 1= C (g/L) x Fator de diluição
Concentração da amostra 1= 4,428 g/L
Concentração da amostra 2: 65,456 g/L
	Logo, existe um total de 65,456 g de proteínas a cada litro de leite. Sabendo-seque 4,428g correspondem às proteínas do soro, pode-se calcular qual quantidade corresponde apenas à caseína;
Q caseína= Qtotal – Qproteínas do soro
Qcaseína= 65,456 – 4,428= 61,028 g de caseína.
	Considerando que a maior parte do leite é composta por água, consideramos que 1 L de leite é igual a 1 Kg de leite.
1000 g ------- 100 %
65,456g -------x %
 X= 6,5456 %	
	Fazendo o mesmo cálculo para a massa de caseína:
1000 g ------- 100 %
61,028g -------x %
 X= 6,1028%	
	Através dos cálculos realizados acima, prevê-se que 6,1028% do leite equivale à caseína, totalizando 93 % das proteínas totais. A literatura informa que da totalidade de proteínas existentes no leite 80% são as caseínas e 20% as proteínas do soro. Os erros podem estar relacionados a erros na técnica ou à qualidade do leite, sobre a qual não se tem certeza absoluta.
	Além disso, a curva utilizada pode ter alterado os resultados finais, uma vez que mesmo sendo a melhor curva para análise não representa os valores exatos. Outra possível explicação pode ser o método utilizado. Embora o método de Lowry seja bastante vantajoso, ele apresenta bastante sensibilidade a interferentes.