Aula 2 Diagnóstico laboratorial em microbiologia

Prévia do material em texto

Diagnóstico 
laboratorial em 
microbiologia
Profa. Thais
Revisão da aula passada
• Microbiologia: bactérias, vírus e fungos
• Importância: sanitária, ambiental, industrial, agrícola...
• Microrganismos Causam infecção com ou sem doença
• Hospedeiro-específicos
• Oportunistas ou patogênicos
• A doença depende: inóculo, infecção, sistema imunológico, 
patogenicidade da cepa
Revisão da aula passada
• Fatores de virulência:
• Adesinas
• Cápsula 
• Parede celular
• Multiplicação
• Depende de pH
• Nutrição
• Temperatura
• Disponibilidade de ferro
• Potencial de redução de oxidação
Revisão da aula passada
• Exo e endotoxinas
Toxinas bacterianas
Exotoxinas Endotoxinas
Proteínas ou polipetídeos Lipopolissacarídeos
Produzidos por Gram + e - Gram -
Letais Letais em grandes quantidades
Sensíveis ao calor, químicos e estocagem Estáveis ao calor, químicos e estocagem
Podem ser convertidos em toxoides para 
produção de vacinas
Não conversíveis em toxoides
Efeito semelhante independente da bactéria
Revisão da aula passada
• Resposta imune inata e adquirida
• Inata: 
• Anticorpos
• Proteinas do sistema complemento
• Enzimas
• Proteinas de fase aguda
• Proteinas ligadas a ferro
• Imunidade adquirida
• Celular e humoral
Revisão da aula passada
• Vírus em fase virêmica
• Bactérias extracelulares
Anticorpos O que indica Local de ação
IgM Infecção recente Intravascular
IgG Infecção secundária/tardia Intravascular
Espaços teciduais
IgE infecções parasitárias e 
reações de 
hipersensibilidade
(vacinação)
Subcutâneo
Submucosa
IgA Infecção viral ou bacteriana 
em mucosas
Secreções (leite, 
saliva, mucosas)
Revisão da aula passada
• Cocos
• Bacilos ou bastonetes
• Filamentosas ou miceliais
• Espiralados
Revisão da aula passada
• Parede bactérias Gram +, Gram – ou BAAR
Mais permeável
Rosa 
Micobactérias
Impermeável à entrada de 
corantes básicos
Resistência ao ressecamento e à 
desidratação
Maior rigidez
Roxa 
Diagnóstico 
laboratorial em 
microbiologia
Profa. Thais
Para que serve o diagnóstico?
• Etiologia da doença
• Tratamento de doenças infecciosas  antibióticos
• Tratamento de doenças não-infecciosas (ex.: corticoides) são contraindicados 
em casos de infecção
• Isolamento do agente
Colheita e transporte
• Transporte rápido
• Ressecamento e exposição a O2
LACEN
“Para que o laboratório possa obter um
resultado confiável não basta que execute
as técnicas de forma correta, é necessário
que receba uma amostra adequada em
quantidade suficiente, recipiente apropriado,
bem identificada, conservada e transportada
corretamente”.
2017 
Transporte e acondicionamento
• Evitar vazamento e contaminação
• Requisições de exames em saco plástico separadas das amostras 
• Colocar os tubos em estantes 
• Recipientes de transporte: 
• Manter a temperatura ideal; 
• Umidade
• Identificados com o símbolo risco biológico 
Transporte
• Meio de transporte
• Solução em matriz gel
• Não contém nutrientes
• Pouca ou nenhuma multiplicação
Transporte anaeróbios
• Líquidos com bact. anaeróbias devem 
ser cultivados imediatamente
• Ex.: exsudato, efusão, abscesso 
• Eliminar o ar da seringa e tampar com 
rolha estéril
• Swab: meio de transporte anaeróbio 
(Stuart)
• Temperatura AMBIENTE
Transporte e acondicionamento
Amostra
Diagnóstico 
direto
• Pesquisa vírus
Diagnóstico 
indireto
• Pesquisa de 
anticorpos
Isolamento
• Animais
• Ovos embrionados
• Cultivo celular
Esfregaço direto
• Observa forma
• Coloração por Gram ou Romanowsky (Wright’s ou Giemsa)
• Presença de microrganismos em locais estéreis  significativo
• Identificação de 1 bactéria/campo de imersão em óleo em urina que 
se deixou secar e foi corada representa 105 bactérias/ml de urina
Cultivo bacteriano
• Amostra é cultivada no meio
• Quantidade de colônias na placa indica número de 
microrganismos na amostra
• Não fazer enriquecimento
• Exceto organismos como Salmonella
• Microrganismos isolados de local estéril + células 
inflamatórias = infeção
• Microrganismos isolados de local estéril sem 
células inflamatórias = contaminação da amostra
• Meio enriquecido
• Meio que favorece o crescimento de uma determinada espécie de bactérias
• Aumenta o número de bactérias que se deseja isolar,
Cultivo bacteriano
• Bactérias aeróbias
• Ágar sangue
• Ágar MacConkey
• Entéricos crescem bem, 
ex.: E. coli, Klebsiela, 
Enterobacter
• Gram positivos não 
crescem
Cultivo bacteriano
• Bactérias anaeróbias
• Ágar sangue
• Livrar o meio de oxigênio
• Bactérias anaeróbias:
• Fístulas drenantes
• Abcessos
• Efusões
• Piometra
• Osteomielite
• Fezes, urina, microbiota vaginal possuem bactérias anaeróbias, portanto a cultura 
não é indicada 
Jarra de anaerobiose
Adição H2O envelope  H2 + CO2
H2 + O2 = H2O + H
Meios de cultivo
• Devem permitir crescimento de microrganismos
• Exceção de meios de transporte
• Água, pH certo, oxigênio, estéril, temperatura ideal
• Divididos quanto à consistência, natureza e composição 
Consistência do meio de cultura
• Sólidos
• Possuem nutrientes e ágar
• Semi-sólidos
• Possuem nutrientes e pequena porcentagem de ágar (0,5-0,8%) 
• Úteis em comprovar motilidade 
• Líquidos
• Nutrientes em solução aquosa
Natureza do meio de cultura
• Animado
• Constituído de células vivas
• Ex.: animais, ovo embrionário, tecidos
• Inanimado
• Não possui células vivas
• Natural
• Ex.: leite
• Sintético
• Preparado em laboratório
• Ex.: ágar
Composição do meio de cultura
• Meio rico
• Permite crescimento de microrganismos
• Possui nutrientes 
• Pode possuir sangue, soro ou extrato de tecidos (ex.: extrato de carne)
Diagnóstico de doenças virais
• Isolamento e identificação viral:
• Surto de doença vesicular (ex.: aftosa)
• Em casos de doenças que afetem todo o rebanho
Fonte: BRASIL (2009)
Fonte: BRASIL (2009)
Métodos moleculares
• Quando a cultura é demorada
• Necessidade de diagnóstico rápido
• Agentes infecciosos que ameaçam outros animais e pessoas
Diagnóstico de doenças virais
• Diagnóstico rápido para evitar transmissão
• Isolamento e identificação quando:
• Surto de doença vesicular
• Em doenças de rebanhos
• Etiologia deve ser conhecida devido ao potencial zoonótico
• Em casos de exposição humana
• Para identificar incidência e prevalência de doenças
Diagnóstico de doenças virais
Em casos de eutanásia, coletar amostras teciduais frescas
Tipo de lesão
Idade e espécie
Tamanho da carcaça
Tipo de doença
Respiratória (pulmões, traqueia)
Vesicular (pele, vesículas)
Diagnóstico de doenças virais
• Anamnese
• Soroconversão (sorologia pareada)
• Isolamento e identificação
• Identificação de animais infectados  eliminação do rebanho
• Isolamento viral não significa que o vírus é o causador da doença
• É comum isolamento de vírus vacinal atenuado
Isolamento viral
• Cultivo celular
• Cultura celular primária
• Ovos embrionados
• Animais de laboratório
• Culturas celulares são observadas por 7-10 dias
• Efeito citopático ocorre entre 24-72 horas
Isolamento viral
• Isolamento em ovos embrionados
Isolamento viral
• Inoculação em Animais
• Informações sobre tropismo celular
• Virulência
• Patogenia
• Transmissibilidade
• Observação diária
• Coleta de sangue
• Necropsia de animais mortos
• Isolamento viral e histopatologia em tecidos coletados
• Incineração da carcaça 
Fonte: O camundongo como animal de experimentação
Identificação viral
• Microscopia EletrônicaFonte: ALMEIDA et al. (2008)
Identificação viral
• Imunofluorescência
Identificação viral
• Reação em cadeia 
da Polimerase (PCR)
ELISA
Detecção sorológica de vírus
• Soroneutralização (SN)
• Neutralização Viral no Soro
Detecção sorológica de vírus
• Inibição da 
Hemaglutinação (HI)
• Alguns vírus possuem 
hemaglutinina
• Quando o vírus infecta, 
há produção de 
anticorpos contra as 
hemaglutininas virais
• Os Ac se combinam ao 
vírus impedindo a 
hemaglutinação
Detecção sorológica de vírus
• Fixação do Complemento (FC)
Detecção sorológica de vírus
• Imunodifusão
Detecção sorológica de vírus
• Radioimunoensaio
Detecção sorológica de vírus
• Western Immunoblot
Uso de anticorpos monoclonais
• Anticorpos pertencem a uma classe de proteínas, conhecidas como 
imunoglobulinas
• Produzidas e secretadas por linfócitos B em resposta à estimulação por 
antígenos
• Anticorpos monoclonais são anticorpos produzidos por um único clone de um 
linfócito B
• São anticorpos idênticos em relação às suas 
propriedades físico-químicas e biológicas
• Gerados em laboratório para reconhecer e se 
ligar a qualquer antígeno de interesse
Uso de anticorpos monoclonais
• Anticorpos pertencem a uma classe de proteínas, conhecidas como 
imunoglobulinas
• Epecíficos para uma única região do antígeno (epítopo) 
• mAbs são usados na produção de kits para diagnósticos ou pesquisa científica
Doença Nome comum ou vírus associado Amostras a coletar Testes 
diagnósticos
Respiratória Adenovírus (hepatite infecciosa 
canina)
Baço, fígado, linfonodos, rins e sangue VI, HHA, FA, 
VN
Diarreia viral bovina (pestivírus) Secreções nasais, lesões orais, pulmão, 
baço, sangue etc
VI, FA, VN
Influenza (equina, suína) 
(ortomixovírus)
Secreção nasal, ocular, pulmão, swab
traqueal
VI, HA, HI
Entérica Parvovírus Fezes, mucosa intestinal, linfonodos 
regionais, cérebro, coração
VI, FA, EM, 
HA, HI, VN
Sistema Nervoso 
Central
Raiva (lissavírus) Cérebro, glândula salivar VI, FA, VN
Mucosas e pele Febre aftosa Lesões, tonsilas, líquido vesicular, líq. 
esofágicos-faríngeos
VI, CF, VN, 
FA, AGID, 
ELISA
Genital Arterite viral equina (pestivírus) Sangue total, secreções, feto, baço VI, CF, FA, 
AGID
Síndrome 
hemorrágica
Anemia infecciosa equina 
(retrovírus)
Sangue, baço, linfonodos VI, FA, VN, 
CF, ELISA, 
AGID
Exercícios
• A amostra adequada de ferida para cultivo de microrganismos 
anaeróbicos pode ser obtida: 
• a) Swab de lesão obtido antes da administração de antibióticos. 
• b) Swab de lesão obtido após a administração de antibióticos.
• c) Aspirado com seringa da secreção antes da administração de 
antibióticos. 
• d) Aspirado com seringa da secreção após a administração de 
antibióticos
• Uma amostra de secreção de abscesso da parede abdominal recebida 
pelo laboratório apresentou um crescimento abundante de 
microrganismos após semeadura em anaerobiose; entretanto, não 
apresentou nenhum crescimento após semeadura em aerobiose. Essa 
cultura contém: 
• a) Um aeróbio obrigatório
• b) Um anaeróbio facultativo
• c) Um anaeróbio obrigatório
• d) Nenhuma das alternativas
• A microscopia em campo escuro é mais frequentemente usada para 
estudo de:
• a) Fungos
• b) Micobacterias
• c) Núcleo de parasitas
• d) Espiroquetas
• A morfologia típica de Staphylococcus é: 
• a) Cocos em cadeia. 
• b) Bacilos filamentosos. 
• c) Cocos agrupados em cachos. 
• d) Cocobacilos.
Referências
• ALMEIDA, Sabrina R. et al . Caracterização clinicopatológica da 
mamilite aguda em ovelhas lactantes infectadas experimentalmente 
com o herpesvírus bovino 2. Pesq. Vet. Bras., Rio de Janeiro , v. 
28, n. 1, p. 87-94, Jan. 2008 . Available from
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
736X2008000100014&lng=en&nrm=iso>. access
on 12 Feb. 2018. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-
736X2008000100014.
• BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. 
Coletânea de Imagens. Lesões de febre aftosa e de outras doenças 
incluídas no sistema nacional de vigilância de doenças vesiculares. 
Brasília, 2009.