Resumo de Bioquímica P3 UFRJ

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Módulo 3 – Bioquímica - ​Biologia Molecular 
Armazenamento de informações genéticas de uma célula para outra é uma condição 
fundamental para a vida. 
Os ácidos nucléicos são importantes nesse armazenamento 
O DNA funciona como armazenamento e transferência de informações biológicas sendo a 
única função disponível dessa molécula. O RNA tem vários papéis, atuando como transportador, 
mensageiro, ribossomomais, RNA de transferência e catalítico, entre outros. 
Histórico do DNA 
Experimento de Griffith (1928) - ​bactérias são capazes de transferir informação genética 
através de um processo conhecido como ​transformação​. 
Resumindo: As células rugosas (R) não causavam a morte do camundongo, as células lisas (S) já o 
levava a óbito. Quando as S foram expostas ao calor, ao ser aplicado o animal não morre, quando as 
células lisas mortas foram colocadas junto as células rugosas, o camundongo morre, e as células lisas 
sobrevivem. 
 Griffith ainda não sabia qual molécula que fazia essa transformação de material genético. 
 ​Avery, MacLeod e McCarty (1944) – A cepa / bacteria virulenta foi aquecida e passou um 
tratamento enzimático com protease, RNase e DNase, em seguida cada amostra é misturada com 
bactérias não virulentas. No frasco com protease e RNase acontecem transformações, aparecendo 
células novas lisas misturadas com células rugosas, não ocorre transformação no DNase, crescendo 
apenas células rugosas. Ou seja, a DNase degradava o DNA que passava a informação das células 
virulentas, por isso só restaram as células rugosas. 
Conclusão​: O DNA é a molécula responsável pela transformação. 
Hershey & Chase (1952) ​- ​ Bactérias marcadas com fósforo radioativo ou enxofre radioativo 
são infectadas por bacteriófago T2 não radioativo. Os bacteriófagos formados têm DNA radioativo e 
capa radioativa (Proteínas) , respectivamente fósforo e enxofre, ao final é observado que esse 
bacteriófagos radioativos ao transmitirem seu material genético, formaram fagos com DNA radioativo, 
e com a proteína radioativa não irá formar fagos marcados com radiação. 
Conclusão: O DNA é herdado pela progênie do fago. 
Gene: ​segmento de DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto 
biologicamente funcional, seja proteína ou RNA. 
Nucleotídeos -Diferentes funções no organismo: 
Moeda energética em reações metabólicas – ATP 
Respostas células a hormônios e outros estímulos extracelulares 
Componente estrutural de cofatores enzimáticos ou intermediários metabólicos 
Constituintes dos ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico (DNA|) e ácido ribonucleico (RNA) 
 
Componentes da estrutura do ácido nucleico – base nitrogenada, pentose e fosfato. Observação: o 
nucleosídeo é a molécula sem o fosfato. 
A base nitrogenada é ligada covalentemente (no N-1 das pirimidinas e no N-9 das purinas) por 
 
uma ​ligação N-beta glicosídica ao carbono 1’ da pentose, e o ​fosfato liga-se ao carbono 5 da pentose 
por uma ligação éster 
Pirimidinas​: citosina, timina e uracila Obs: Tem as duas nos ácidos nucleicos. 
Purinas:​ adenina e guanina 
 
Bases nitrogenadas secundárias: no DNA são mais comuns as formas metiladas, 
hidroximetiladas ou glicosiladas, tendo função de regulação e proteção da informação genética. No 
RNA, são encontradas de vários tipos, especialmente nos tRNAs. 
As bases nitrogenadas são básicas atuando como moléculas aromáticas, devido a ressonância 
das duplas ligações, se tornando plano nos casos das pirimidinas ou quase planar nas purinas. Por 
causa da ressonância podem ter formas tautoméricas dependendo do pH. Também tem ​capacidade de 
absorção de luz​ assim como os aminoácidos aromáticos, principalmente a 200 ​nanômetro. 
As bases nitrogenadas são ​hidrofóbicas e relativamente ​insolúveis em água e pH neutro, 
gerando uma estabilização na estrutura da molécula de DNA, pois as bases ficam empilhadas 
acontecendo ligações hidrofóbicas entre as moléculas e outros tipos de ligação como dipolo- dipolo e 
de Van der Waals. Caso aumente o pH ocorre o aumento das cargas e da solubilidade das bases 
nitrogenadas. 
São elas que fazem as ligações de hidrogênios ligando uma fita a outra fita, sendo a timina – 
adenina (ligações duplas) e guanina e citosina (ligações triplas). 
Os grupos funcionais das purinas e pirimidinas são anéis nitrogenados, grupos carbonila e 
grupo amino exocíclicos, os responsáveis pela formação das ligações de hidrogênios são os grupos 
amino e carbonila. ​Pentose​ – QUE DEFINE SE É RNA OU DNA. 
DNA: 2 D-desoxirribose e RNA D-ribose. A desoxirribose não tem o grupo hidroxila ligado ao 
carbono 2 da pentose, já na ribose está presente. 
Formam anel na forma de beta-furanose 
Purinas: C-2’ endo Pirimidinas: planar
Fosfato – presente no carbono 5’na 
pentose, pode está em outras posições, determinando 
diferentes funções. 
● Desoxirribonucleotídeos ( 
desoxirribonucleotídeo 5’-monofosfato) 
Ribonucleotídeos (ribonucleotídeo 5’ -monofosfato) 
Ligação fosfodiéster – ​o grupo 5’-fosfato ​de um nucleotídeo é ligado ao grupo ​3’-hidroxila 
do próximo nucleotídeo. 
O esqueleto covalente ​dos ácidos nucleicos consiste em fosfato e resíduos de pentose 
alternados, ​e as bases nitrogenadas podem ser consideradas como ​grupos laterais ligados ao esqueleto 
 
em intervalos regulares. 
O esqueleto do DNA e do RNA são hidrofílicos ficam para fora. Os grupos hidroxila dos 
resíduos de açúcar formam ligações de hidrogênio com a água. Os grupos fosfatos, com um pKa 
próximo de 0, são completamente ionizados e carregados negativamente em pH 7, e as cargas 
negativas são, de um modo geral, neutralizadas pelas interações iônicas com cargas positivas nas ptns, 
nos íons metálicos e nas poliaminas. 
O DNA é mais estável do que o RNA, devido a ausência da hidroxila no carbono 2’. Quando 
exposto a condições alcalinas, o RNA é hidrolisado rapidamente, rompendo a ligação de fosfodiéster, 
formando como produto nucleotídeos 2’,3’- monofosfato cíclicos. 
Estrutura dos ácidos nucleicos 
Chargaff (1940) – Composição de bases no DNA varia entre as espécies, DNAs separados de 
diferentes tecidos de uma mesma espécie apresentam a mesma composição de bases.Não ocorre 
variações com a composição de bases em relação a idade, o estado nutricional e fatores 
ambientais. 
Independentemente da espécie, apresentam igual número de resíduos de nucleotídeos, ou seja, 
o número de guanina é igual a citosina, e o adenosina é igual ao número de timina. Dessa forma, 
conclui-se que ​a soma dos resíduos de purina é igual à soma dos resíduos de pirimidina. 
Rosalind Franklin e Maurice Wilking (1950) – ​Usaram o método eficaz da difração por raio 
X para analisar fibras de DNA, demonstrando um padrão característico, deduzindo que as moléculas 
de DNA são helicoidal com duas periodicidades, um pequeno e outro grande. 
Watson e Crick ( 1953) ​– Concluíram com as informações ​obtidas ​que o DNA seria uma 
molécula helicoidal ​, constituído por duas cadeias agrupadas em torno do mesmo eixo formando uma 
dupla hélice de ​orientação á direita​, tendo um esqueleto hidrofílico de grupos fosfato e desoxirribose 
alternados fora dadupla-hélice, orientados para a água. As bases nitrogenadas empilhadas dentro da 
dupla hélice, com suas estruturas hidrofóbicas em forma de anel e quase planares muito perto uma da 
outra e perpendiculares ao eixo longitudinal. O pareamento perfeito das duas fitas cria um sulco maior 
e um sulco menor. 
 
Fitas paralelas e antiparalelas ​com extremidades 5’ e 3’​. As fitas são complementares entre 
si. ​Em solução aquosa uma volta mede 66 Å equivalente 10,5 pares de bases. 
 
Forças importantes​: ligações de hidrogênios ​entre as bases complementares e ​as interações de 
empilhamento ​de bases​. 
Quanto mais bases Guanina e Citosina na molécula de DNA, mais separadas fico as fitas, devido às 
ligações triplas entre essas bases. 
Variação na estrutura do DNA 
 
A forma B é a mais estável das estruturas, a forma A é favorecida em soluções livre de água ( 
pouca água), dupla hélice à direita, mais larga e o número de bases por volto é 11. Observe na tabela 
abaixo as diferenças. 
 
 ​ 
O DNA pode ocorrer em formas tridimensionais 
diferentes. 
Extremamente flexível, rotações consideráveis em torno de 
vários tipos de ligações no esqueleto açúcar – fosfato e 
flutuação térmica pode produzir enovelamento, alongamento 
e desnaturação (fusão) das cadeias. 
Obs: Essas variações de conformação não afetam as 
propriedades do DNA. 
Refletem em 3 aspectos: 
As diferentes conformações possíveis da desoxirribose, a 
rotação em torno das ligações contíguas que constituem o 
esqueleto de fosfodesoxirribose e a rotação livre em torno da 
ligação C-1’- N-glicosídica. 
Devido a restrições estéricas, as purinas nos nucleotídeos 
púricos estão restritas as duas conformações estáveis com 
respeito à desoxirribose, denominadas ​syn​ e​ ​anti​ . 
As pirimidinas geralmente estão restritas à conformação ​anti​, devido a interferência estéricas entre o 
açúcar e o oxigênio da carbonila no C-2 da pirimidina. 
 
 
Certas sequências de DNA adotam estruturais incomuns 
Palíndromo: palavra ou frase escrita de forma idêntica se for lida da esquerda para direita ou 
vice-versa, termo aplicado a regiões de DNA com repetições invertidas de sequências de base tendo 
simetria dupla nas duas cadeias de DNA. Tem potencial para formar estruturas ​cruciformes (em 
formato de cruz) ou em ​grampo​. 
Quando a repetição invertida ocorre dentro de cada 
cadeia individual de DNA, a sequência é denominada 
repetição de imagem especular. ​Não tem sequência 
complementares e não formam grampos ou cruciformes. 
São regiões reconhecidas por enzimas específicas, sendo 
importantes na regulação e outros mecanismos. 
Quando se tem ligações de hidrogênio adicionais, 
principalmente no sulco maior, por exemplo, um par de bases pareado com um resíduo de guanina, são 
denominadas ​posições de Hoogsteen​, e o pareamento do tipo não Watson-Crick é chamado de 
pareamento de Hoogsteen. ​Esse pareamento permite a formação do triplex de DNA, ​que são mais 
estáveis em pH baixo porque o trio C ≡ G . C+ requer uma citosina protonada. Acontece muito quando 
se tem muita pirimidina em um lado da cadeia, ou somente purinas 
O tetraplex G = 4 cadeias de DNA com proporção muito alta de resíduos de guanosina. 
Importância dessas variações de estruturas: Os 
palíndromos são sítios específicos que são reconhecidos por muitas enzimas ligantes de DNA, atuando 
no reconhecimento do DNA, e na formação do tRNA. No tetraplex G e no triplex é importante para 
diminuição da expressão gênica, com potencial de silenciar um gene. 
Propriedades químicas do DNA 
Temperaturas acimas de 80 grau célsius e valores de pH extremos causam desnaturação do DNA. O 
rompimento das ligações de H entre pares de bases e das bases empilhadas causam desenrolamento da 
dupla-hélice formando duas cadeias simples, podendo ser completamente separadas (desnaturação 
completa) uma da outra pela molécula inteira ou de parte da molécula (desnaturação parcial). 
Nenhuma ligação covalente no DNA é rompida. 
Renaturação: ​quando retorna a sua temperatura e pH iniciais 
Desnaturação parcial – 1 etapa rápida 
Desnaturação completa - 2 etapas, um lenta e outra rápida. 
 
Efeito hipocrômico: ​a renaturação e pareamento diminui a absorção de luz 
Efeito hipercrômico: ​a desnaturação aumenta a absorção de luz. 
 
Motivo: bases nitrogenadas serem aromáticas. 
 
A desnaturação depende da composição das moléculas de DNA, exemplo a C ≡ G e T-A, tendo 
ligações triplas vai aumentar temperatura de melting, assim gastando mais energia, ao contrário das 
 
ligações duplas. A desnaturação costuma iniciar em regiões ricas em AT 
Observação: Temperatura de melting – quando 50% das moléculas são enoveladas e 50% 
desnaturadas. 
 
Em RNA duplos as temperaturas são mais altas do que as temperaturas do DNA para iniciar 
uma desnaturação. São desconhecidas bases físicas para essa diferença. 
 
 Hibridação do DNA 
 
A taxa de pareamento do DNA é afetada pela temperatura, pelo comprimento e pela 
concentração dos fragmentos de DNA a serem pareados, pela concentração de sais na mistura de 
reação e pelas propriedades da sua própria sequência ( complexidade e C ≡ G). 
Temperatura baixa: sequências curtas de moléculas de DNA com semelhanças coincidentes em 
partes distantes e heterólogas irão se parear improdutivamente e interferir com o alinhamento geral de 
cadeias complementares de DNA. 
Temperatura muito altas: desnaturação 
 
A maioria do reanelamento ocorre entre cadeias complementares de DNA murinho para formar 
duplex de DNA murinho, mas também pode ocorrer com o DNA humano. Quando juntam os dois 
podem formar duplex híbridos. Herança evolutiva comum facilitam a hibridização. 
 
Hibridação: duas amostras de DNA são aquecidas até desnaturar separadamente, são 
misturadas e resfriadas lentamente, as duas cadeias começam a se complementar e se anelam para 
formar o duplex. 
 
Transformações não enzimáticas 
Quando há um mal pareamento das bases nitrogenadas, se não ocorre o reparo pode gerar mutações. 
 
Desaminação – perda espontânea de seus grupamentos amino exocíclicos, processo lento. A 
desaminação da citosina a uracila pode ser o motivo da ausência de uracila no DNA, pois o organismo 
ativa o sistema de reparo e retira a uracila do DNA. 
Depurinação – ​purina é perdida pela hidrólise da ligação N-beta-glicosídica, formando sítio 
abásico ou sítio AP (sítio apurínico ou apirimidínico), essa reação acontece mais rapidamente em 
ácido diluído no laboratório. 
Luz UV - induz a condensação de dois grupos etilenos para formar um anel ciclobutano, tende 
a gerar dímeros pirimídicos ciclobutanos ou fotoproduto 6-4, introduz um ângulo ou dobra no DNA. [ 
acontece geralmente nas Timinas] 
Reagente químicos​: agentes desaminantes - especialmente ácido nitroso (HNO2) ou 
compostos que podem ser metabolizados a ácido nitroso ou nitritos; 
Agentes alquilantes - dimetisulfato pode metilar a guanina para produzir O6 -metilguanina, a 
qual não pode parear com a citosina. 
São usados como conservantes alimentos processados evitando o crescimento de bactérias 
tóxicas.. 
Metilação do DNA -acontece com mais frequência na ​adenina ​e na ​citosina ​do que guanina e 
timina. 
Na E.coli a metilação auxilia na distinção do seu DNA do DNA exógeno por marcar seu 
próprio DNA com grupo metila e destruindo o exógeno sem metila ( sistema de modificações restritas) 
e também pode ocorrer o reparo dos pares de bases mal pareados mediado pela Dam metilase. 
 
 
Outras funções dos nucleotídeos: 
 
Carregadores de energia - O grupo fosfato ligado covalentemente na hidroxila 5’de um 
ribonucleotídeo pode ter um ou dois fosfatos adicionais ligados. Tendo nucleotídeos mono, di, 
trifosfatos. A hidrólise dessas moléculas geram energia química para várias reações celulares. 
 
 
Componentes de cofatores enzimáticos - ​forma coenzima A, FAD e NAD, entre outros. Eles 
não são estruturalmente relacionados, exceto pela presença de adenosina, em nenhum desses cofatores 
a adenosina faz a função principal, mas se for retirada resulta em uma redução drástica da atividade do 
cofator. 
 Porque ADENOSINA ? porque ela é usada normalmente como moeda de troca para fornecer 
energia às reações, se fosse usar outro domínio poderia gerar mais gastos de energia, assim envolve 
uma forma de economia evolutiva. 
 Moléculas reguladoras- mensageiros químicos - ​Atuam como segundos mensageiros dentro 
célula, onde recebem informações de hormônios ou sinais extracelulares, gerando a formação de ​AMP 
cíclico​ que transportam as informações para fora da célula. 
Em bactérias existe o regulador ppGpp​, produzido em resposta a uma redução de velocidade 
da síntese proteica durante a falta de aminoácidos, esse nucleotídeo inibe a formação de RNAs 
transportadores e ribossomais, prevenindo a produção desnecessária desses ácidos nucleicos. 
 ​Níveis de organização do cromossomo 
As moléculas de DNA são associadas com histonas formando nucleossomos, ‘’colar de contas’’, esses 
nucleossomos se reúnem formando fibras de cromatinas que se condensam formando o cromossomo. 
Replicação semiconservativa do DNA - síntese de duas 
moléculas -filhas de DNA híbridas, utilizando como molde 
a fita da molécula mãe. 
 Experimento de Meselson-Stahl - 1957 
Células foram cultivadas por muitas gerações em meio 
contendo apenas nitrogênio pesado, 15N. 
Depois essas células foram transferidas para um local com 
células contendo apenas 14N, formaram moléculas filhas 
de primeira geração híbridas. O DNA isolado gerou um 
única banda no gradiente de CsCl. 
No experimento seguinte, as células marcadas com 
nitrogênio pesado foram colocadas em um meio com 
 
nitrogênio 14 até dobrar em número. O DNA isolado desse segundo ciclo de replicação exibiu duas 
bandas no gradiente de densidade, um qual densidade igual aquela do DNA leve e a outra com a 
densidade do DNA híbrido. 
A replicação começa em uma origem e em geral segue bidirecionalmente. 
Jonh Cairns - ​utilizou moléculas de DNA de E.coli radioativo cultivando células em um meio 
contendo timidina marcada com trítio. Quando isolado foi possível observar que o DNA com um único 
cromossomo, dentro dela tinha uma volta adicional. Concluiu que essa volta foi crescendo ao longo do 
tempo formando duas moléculas de condições iniciais. 
 
Resumo: Existe uma origem, onde começa a replicação, e acontece em dois sentidos através das 
forquilhas de replicação ​que ficam nas extremidades das voltas. 
 
A síntese do DNA segue em uma direção 5’- 3’ e é semidescontínua. 
 
A fita ​contínua ou fita líder ​é aquela que a síntese 5’-3’ segue na ​mesma direção do movimento da 
forquilha de replicação. Já na fita ​descontínua ou retardada é aquela que a síntese 5’-3’ prossegue na 
direção oposta ​da direção do movimento da forquilha. Assim, na fita descontínua a enzima primase 
adiciona primers para que ocorra o início da síntese que é feita em pedaços pequenos, o fragmento de 
Okazaki, a ligase ligam os fragmentos deixando a fita contínua. 
 
O DNA pode ser degradados por nucleases ou DNases. 
Exonuclease​: atuam na direção 5’-3’ ou 3’-5’ 
Endonuclease​: reconhece sequência internas específicas de DNA, exemplo as enzimas de restrição. 
O DNA é sintetizado por DNA-polimerases 
 
DNA polimerase I ​- fornece a transferência do grupo fosforil. 
 
A hidroxila do carbono 3 ataca o fósforo alfa presente no dNMP e dNTP, formando uma 
ligação fosfodiéster, liberando um pirofosfato inorgânico. Essa reação envolve dois íons de Mg 2+ que 
estabilizam as cargas negativas. 
A DNApol precisa de uma fita molde e uma hidroxila livre, a primase é importante nesse 
processo, pois sintetiza um pequeno segmento iniciador (​primer​) que fornece hidroxila livre no 3’C 
para que ocorra a síntese pela polimerase na fita descontínua. 
 
Duas partes do sítio ativo do DNApol: ​sítio de inserção​: onde o nucleotídeo que chega é 
inicialmente posicionado. Quando a ligação fosfodiéster é formada, a polimerase desliza para frente do 
DNA e um novo par de bases é posicionado no ​sítio de pós-inserção​. 
 
Observação: É uma única molécula de DNA polimerase que vai sintetizar as duas fitas ( contínua e 
descontínua). 
 
ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA 
 
1. Etapa de Iniciação​: reconhecimento das origens de replicação por um complexo proteico; abertura 
localizada da dupla fita de DNA pela helicase, ou seja, sempre existe um local exato de abertura da 
 
molécula de DNA; síntese do primer (término dessa fase). 
 
2. Etapa de elongação​: ocorre a síntese continua na cadeia leading (líder) e a síntese descontínua na 
cadeia lagging (atrasada), pois aparentemente a síntese da fita contínua começa antes da síntese da fita 
descontínua. 
 
3. ​Etapa de terminação​: há várias sequências, chamadas de sequências ter, que são reconhecidas por 
proteínas Tus, que desaceleram e param a helicase. 
 
REPLICAÇÃO EM PROCARIOTO 
 
A ​polimerase reconhece a origem de replicação,a helicase rompe as ligações de hidrogênio 
fornecendo uma abertura nas fitas,ocorre adição de SSB que mantém a separação das fitas. 
A síntese da fita líder começa com a adição de um primer na origem de replicação pela primase 
(DNA G), ela interagem com a helicase (DNA B) formando um iniciador da fita líder ( dna G -dna B) 
que irá se mover em direção oposta. Os desoxirribonucleotídeos são adicionados a esse iniciador por 
um complexo DNA polimerase 3 ligado à helicase Dna B presa à fita de DNA oposta. 
Na fita retardada, a síntese é realizada em fragmentos de Okazaki. Os primers são adicionados 
(iniciador), a DNA pol 3 se liga ao iniciador e adiciona os desoxirribonucleotídeos. A helicase ligada 
na frente da DNA pol 3, desenrola o DNA na forquilha de replicação a medida que ela se move. 
Quando acaba o fragmento vem a primase novamente, e a DNApol 3 junto a braçadeira beta desliza 
formando mais nucleotídeos, ao finalizar o fragmento a braçadeira é deixada para trás. Após a síntese, 
a DNA ligase finaliza deixando a fita contínua, sem cortes, ou seja, ela forma ligações fosfodiéster 
entre a hidroxila 3’ de um fragmento e o 5’fosfato de outro. 
 
Terminação​: tem uma sequência conhecida como Ter que funciona como sítiode ligação para 
a proteína Tus. Esse complexo Tus-Ter faz com que a replicação pare, a quando as duas forquilhas se 
encontram a replicação é parada, a topoisomerase 4 vai fazer uma quebra de uma das fitas duplas e 
separam os DNAs. 
REPLICAÇÃO EM EUCARIOTOS 
 
-Tem diversas origens de replicação; 
- Processo de abertura parecido com procarioto, mas tem uma proteína MCM2 que é análoga a DNA B 
helicase 
- Tem DNA polimerase: 
Delta ​: equivalente eucariótico da DNA pol III responsável pela replicação do genoma nuclear; possui 
atividade exonucleásica 3’ – 5’ 
Alfa ​: possui uma atividade primase 
Épsilon ​: reparação do DNA 
 
 SEQUENCIAMENTO DE DNA 
 
Em 1977 Frederick Sanger fez o sequenciamento de moléculas grandes com uma certa 
facilidade. 
​Sequenciamento de Sanger - Baseado nos análogos de nucleotídeos (desoxirribonucleotídeo ou 
ribonucleotídeo), diferença entre eles é a ausência de OH C2’ e não tem OH no C3’ no DNA, assim ele 
é um ddNTP. 
Qual a importância da utilização desse ddNTP ? é a OH livre no carbono 3’ é que vai fazer o 
ataque nucleofílico no fósforo alfa do trifosfato, gerando uma ligação fosfodiéster na fita crescente de 
 
DNA. 
Caso não tenha esse OH livre a ligação fosfodiéster não é formada e a replicação da fita de DNA 
fica interrompida. 
 No laboratório podemos fazer ​in vitro​ essa replicação na ausência de OH 3’. 
É necessário a adição das ​4 bases de DNA [ ​dATP, dGTP, dCTP, dTTP], primer (iniciador), DNA pol, 
Mg2+, condições importantes de sais. 
São feitos 4 tubos com essa preparação, no primeiro tubo é adicionado ddATP, no segundo 
ddCTP, no terceiro ddGTP e no último ddTTP. O primer é adicionado a sequência do DNA molde, a 
DNA polimerase começa a síntese, adicionado os nucleotídeos, quando o ddNTP é adicionado ocorre 
o interrompimento da síntese. As amostras são transferidas para 
quatro ‘’pistas’’ do gel de eletroforese, que são separados por 
tamanhos e tipo de nucleotídeo, o oligonucleotídeo mais curtos se 
movem rápido para baixo do gel. A leitura de baixo para cima 
fornece a sequência correta de DNA. 
 
 
No sequenciamento automático, as bases dos ddNTPs são 
marcadas com radiação, cada base tem uma cor, após a replicação e 
a parada de cada ponto, as amostras são desnaturadas. Em seguida 
são colocadas em um gel capilar, um detector vai identificar 
através das cores cada nucleotídeo. Muito vantajoso para moléculas 
grandes. 
 
 ​Transcrição 
Funções do RNA 
- Armazenamento de informações 
- Catálise, tendo o RNA catalíticos ou ribossomas. 
 
Normalmente vemos a transcrição de um DNA em RNA, mas não 
podemos esquecer dos vírus que fazem a replicação do seu próprio 
DNA, ou seja, às vezes a informação que vem do DNA pode está 
contida nela mesmo, e não no RNA. 
 A transcrição pode variar muito, tem genes que é transcrito a qualquer momento, a todo 
momento, outros que nunca são transcritos, pode variar de acordo com a natureza. 
 Inicialmente o gene era considerado como uma porção que determinava o genótipo, depois 
acreditaram que era um material genético que formava uma enzima, mas nem todos geravam uma 
enzima. Posteriormente, observaram que ao ser traduzido se transformava em um polipeptídeo, uma 
proteína que não era um enzima. Atualmente a definição de genes é mais ampla, e é relacionada com 
qualquer porção do DNA que codifica uma sequência primária que é um produto do genes, que pode 
ser um polipeptídeo, proteína, enzima ou não, e um RNA que exerce sua função. 
 O gene estruturalmente vai englobar um região regulatória, a parte de fato que vai ser traduzida 
e uma região de terminação de transcrição. 
 Transcriptoma celular:​ todos os tipos de RNAs que são produzidas na célula. 
A maior parte do genoma de seres humano e mamíferos é transcrita em RNA, mas as formas 
predominantes de RNA transcrito não são aqueles três conhecidos (RNAs mensageiro,transportador e 
ribossômico), e sim RNA especiais, os microRNA, pequenos RNAS nucleares, as funções dos mesmos 
ainda está sendo descobertas. 
 
 
 
Tipos de RNA: 
Mensageiro​: que atua na transcrição do código genético para ser traduzido na forma de polipeptídeos. 
Transportador​: faz a ligação do anticódon com o RNA mensageiro, levando o aminoácido para 
síntese protéica. 
Ribossomais​: montam a maquinaria para que a síntese de ptn ocorra. 
 
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS 
 
RNA mensageiro ​policistrónico ​( quando se tem um promotor e uma sequência de terminação 
e vários genes ou código para cadeia polipeptídicas independentes) ou ​monocistrónico ​(apenas um 
código para a cadeia polipeptídica, sem controlado por um promotor) 
O tamanho RNAm vai depende da cadeia polipeptídica. Uma trinca de nucleotídeo, o códon 
gera um aminoácido. 
Apesar de o RNA ser uma fita simples, ele pode parear, tendo uma forma helicoidal, assim 
como o DNA, pode ter a forma A, B e Z. Normalmente encontramos a forma A. A estrutura 
secundária do RNA é bem complexa, com presença de loop, grampos . O pareamento de RNA não 
segue o padrão do DNA, o modelo de Watson e Crick, ele pode fazer outros pareamentos. 
A estrutura é estabilizada pelo ligamento das bases por ligações de hidrogênio, o RNA pode ter 
estrutura tridimensional por exemplo, o RNA transportador. 
 
A síntese de RNA tem similaridade e diferença com a do DNA. 
- tem a ligação fosfodiéster 
- a síntese é feito na direção 5’ -3’ 
- precisa de apenas um fita de molde 
- dividida em três etapas: iniciação, alongamento e terminação. 
- Não precisa de um primer, nem de uma OH 3’ livre 
 
Em 1960 descobriu a RNA polimerase que depende do DNA, e de todos os 4 ribonucleosídeos 
5’-trifosfatos (ATP, GTP, CTP E UTP) como precursores das unidades de nucleotídeos de RNA, bem 
como de Mg2+. 
A RNA pol alonga a fita de RNA ao adicionar unidades de ribonucleotídeos à extremidade 
hidroxila 3’, construindo o RNA na direção 5’-3’. O grupo hidroxila 3’ atua como nucleófilo, atacando 
o alfa fosfato do ribonucleosídeo trifosfato que chega e liberando o pirofosfato. 
A fita de DNA é copiada na direção 3’-5​’ (antiparalela à nova fita de RNA), exatamente 
como na replicação do DNA. A RNA pol se liga ao promotor do DNA para iniciar a síntese. O duplex 
de DNA é desenrolado em um pequeno trecho formando uma ​bolha de transcrição permitindo que a 
RNA pol sintetize uma fita de RNA complementar a umas das fitas de DNA. 
 
Fita molde - a fita do DNA que é transcrita 
Fita não molde/ codificadora - é idêntica ao RNA formado, com U no lugar do T no DNA. 
 
RNA polimerase de E.coli é constituída de duas subunidades alfa, duas betas, uma beta e outra 
beta’ e um sexta subunidade, de um grupo denominado ômega, também tem um subunidade sigma 
que é importante para o reconhecimento do promotor. 
O sistema de revisão da RNA pol não é tão eficiente como o da DNApol, o pirofosfato não 
clivada no primeiro nucleotídeo é utilizado para o reparo de mal pareamento . 
A ​iniciação ​- começa nos promotores, em E.coli essa região é localizada entre par de base - 70e 30 ,antes do primeiro nucleotídeo que vai ser transcrito. Tem a região -10 e -35 que são sítios de 
interações importantes para o reconhecimento da subunidade sigma 70, sequência de consenso na 
 
região -10 é (5’) TATAAT(3’) na região -35 é (5’) TTGACA (3’). 
 
Existe um outro elemento de reconhecimento rico em AT, chamado de UP, ocorre entre as 
posições -40 e -60 nos promotores de certos genes altamente expressos. Esse elemento é ligado pela 
subunidade alfa da RNApol. 
 
A eficiência da RNA pol vai depender da sequência das regiões promotoras, os espaços 
entre elas e pela distância do sítio de início de transcrição. 
 
A​ iniciação ​é dividida em duas etapas 
​1) a subunidade sigma se liga a região promotora, tem um complexo fechado (em que o DNA 
ligado é intacto) e um aberto ( em que o DNA ligado está intacto e parcialmente desenrolado próximo 
da sequência -10) se formam em sucessão. 
2) iniciada no interior do complexo, levando uma mudança conformacional que converte o 
complexo na forma de alongamento, seguida pelo movimento do complexo de transcrição para longe 
do promotor. 
 
A transcrição começa, a remoção do promotor é seguida de alongamento, ao se dissociar um 
ptn NusA se liga nesse local, atuando na estabilização do complexo durante o alongamento. Quando a 
transcrição termina a NusA se dissocia e a RNApol é reciclada. 
Existem várias subunidades sigmas, a 70 está envolvida com proteínas responsáveis pela 
manutenção celular, por isso ela tem que se liga facilmente a região promotora porque as proteínas são 
bastante expressadas, tendo um Kd baixo, constante de dissociação. Existem muitas dessas 
subunidades nas células para ter alta taxa de transcrição. 
Temos os promotores dos genes de choque térmico, que é utilizado quando a célula recebe 
ameaças, como o aumento repentino de temperatura. Quando tem o estresse térmico a subunidade 
sigma 70 é trocada pela subunidade sigma 32, assim a RNA polimerase se liga ao promotor. 
 
 
 
 ​REGULAÇÃO 
Ocorre em qualquer etapa da transcrição, incluindo alongamento e terminação. Boa parte da 
regulação está direcionada para a ligação da RNA polimerase e etapas da iniciação da transcrição. A 
diferença nas sequências de promotores são apenas um dos vários níveis de controle. 
A ligação de proteínas a sequências tanto próximas quanto distantes do promotor também pode 
afetar a expressão gênica. A ligação de ptns pode ativar ou reprimir a transcrição. 
Na E.coli uma ptn ​ativadora ​é a ​receptora cAMP ( CRP) que aumenta a transcrição de genes 
que codificam enzimas que metabolizam outros açúcares além da glicose quando as células crescem na 
ausência da mesma. 
Repressores: ptn que bloqueiam a síntese do RNA em genes específicos. No repressor Lac, a 
transcrição dos genes para as enzimas do metabolismo da lactose é bloqueada quando a lactose está 
indisponível. 
 
Terminação da síntese de RNA 
Sequência na fita de DNA sinaliza uma pausa na síntese de RNA, a E.coli tem duas classes de 
sinais de terminação 
Independentes de rho - uma região que produz um transcrito de RNA com sequências 
autocomplementares rica em GC e AT, permitindo a formação de um estrutura em grampo, outra 
característica é um filamento com três resíduos U próximo da extremidade 3’do grampo. 
Dependentes de rho - ​tem uma sequência curta rica em CA que cria um grampo. 
 
 3 TIPOS DE RNA POLIMERASE NUCLEARES EM EUCARIOTOS 
 
Todos os três tipos de RNA polimerases agem do mesmo modo que a RNA polimerase dos 
procariontes. 
​RNA polimerase I - responsável pela síntese de apenas um tipo de RNA pré ribossomal (ou 
pré-rRNA), que contém precursor dos rRNA 18S, 5,8S e 28S. Os promotores da Pol I são diferentes de 
uma espécie para a outra. 
RNA polimerase II ​- tem uma sequência, o TATA box de bases -30 e uma seq Inr (iniciador) 
próxima do sítio de início do RNA em +1. Presente em minoria. 
 ​RNA polimerase III​ - produz tRNA, o rRNA 5S e alguns RNA pequenos especializados. 
 
A RNApol II precisa de muitos outros fatores protéicos para a sua atividade. 
Tem 12 subunidades, a maior (RBP1) apresenta um alto grau de homologia com a subunidade 
beta’ da RNApol bacteriana. Outra subunidade (RBP2) é estruturalmente semelhante à subunidade 
bacteriana beta, e duas outras (RBP3 e RBP11) exibem algum grau de homologia estrutural em relação 
às duas subunidades alfa bacteriana. 
Tem uma ​longa cauda de carboxila terminal consistindo em várias repetições de uma 
sequência - YSPTSPS-. 
 A complexidade dessa polimerase está associada aos ​fatores de transcrição​. 
 Iniciação em eucariotos 
- Não é simplesmente a interação da RNA pol, existem diversos fatores que vão ser importante 
para que haja a formação do complexo de transcrição do RNA. 
 
 
 
O alongamento das fitas de DNA pela RNApol tanto em bactérias quanto em eucariontes é inibido 
pelo antibiótico ​actinomocina D, se insere em sequência de pares de bases G-C sucessivos, deformando o 
DNA que impede o movimento da polimerase. A ​acridina ​inibe a síntese de RNA de modo semelhante. 
A ​rifampicina ​inibe a síntese bacteriana de RNA ao se ligar à subunidade beta das RNApol bacterianas, 
impedindo a etapa da transcrição de distanciamento do promotor. 
 Alfa amanitina interrompe a formação de RNA mensageiro nas células animais ao bloquear a Pol II, 
altas concentrações a Pol III. 
 
 
 
 
 PROCESSAMENTO DE RNA 
Acontece em praticamente todos os eucariontes, e algumas moléculas de RNA de bactérias. 
Transcrito primário ​- molécula de RNA recém sintetizada. 
 ​ RNA MENSAGEIRO - EUCARIONTE​S 
5’ quepe - um resíduo de 7-metilguanosina ligado ao resíduo de terminal 5’do mRNA por uma rara 
ligação trifosfato 5’,5’-trifosfato. Função: protege o mRNA das ribonucleases, importante para iniciar 
a tradução, pois atua no reconhecimento. 
 
Obs: Pode ocorrer a metilação das primeiras bases, uma enzima sintetizadora do quepe vai se 
liga a porção terminal da polimerase II que reconhece a extremidade 5’ do mRNA, faz a reação de 
ligação da 7-metilguanosina , a enzima sintetizadora é liberada e uma outra ptn, CTD se liga 
garantindo o processamento do mRNA. 
 
O RNA catalisa o splicing de íntrons 
4 tipos de íntrons: 
I e II não precisam de enzimas, são ​autosplicing​, não tem a necessidade de cofator de alta energia 
(ATP) para o ​splicing ​. 
 
 No grupo I precisa de um nucleosídeo guanina ou de um cofator nucleotídeo, o grupo ‘3 da OH 
da guanina é usado como um nucleófilo, formando um ligação 3’,5’ - fosfodiéster normal com a 
extremidade 5’ do íntron. A OH 3’ do éxon que é deslocada nessa etapa age então como um nucleófilo 
em uma reação semelhante na extremidade 3’ do íntron. O resultado é a remoção precisa do íntron e 
ligação dos éxons. Na classe II, o padrão de reação é o semelhante exceto pelo nucleófilo na primeira 
etapa, que nesse caso é o grupo 2’ OH. 
 
Íntronsdo spliceossomo - ​a remoção é catalisada por um grande complexo proteico, 
spliceossomo, ocorre no seu interior. ​Classe III 
 Spliceossomo é constituído por complexo de RNA-proteínas especializados, pequenas 
ribonucleoproteínas nucleares (snRNP) onde tem os 5 tipos snRNA (U1,U2,,U4,U5,U6) que tem a 
capacidade de reconhecimento da sequência de íntrons indicando para as ptns, o U1 se liga e parea 
com 5’ éxons e início do intron. 
 
OBSERVAÇÃO: o splicing não precisa da ATP, somente a montagem do spliceossomo que necessita 
do ATP. 
 
Classe IV - encontrada em certos tRNA, precisa de ATP e de uma endonuclease. A endonuclease de 
splicing cliva as ligações fosfodiéster em ambas as extremidades do íntron, e os dois éxons são ligados 
por um mecanismo semelhante à reação de DNA-ligase. 
 
Adição da cauda poli (A) - ​atua como sítio de ligação para ptns específicas e ajuda na 
proteção contra a destruição enzimática do mRNA ( eucariotos), em bactérias essa cauda estimula a 
destruição do mRNA. 
O transcrito é clivado no local onde ocorrerá a adição da cauda por um componente de 
endonuclease ​de um grande complexo enzimática associado ao CTD da RNA pol II. O local é 
marcado por dois elementos de sequência: um altamente conservada ​(5’) AAUAAA(3’)​, de 10 a 30 
nucleotídeos no lado 5’do sítio de clivagem, e uma sequência menos bem definida rica em resíduos de 
G e U​, de 20 a 40 nucleotídeos abaixo do local da clivagem. 
 
A clivagem gera um grupo livre 3’-hidroxila, onde serão adicionados pela ​polimerase 
poliadenilada​ os resíduos de A. 
Quando o transcrito primário passa por todo os processamentos - adição do quepe 5’, da cauda 
poliA e remoção dos íntrons, o mRNA já está madura. 
O processamento gera uma ​variabilidade na molécula de mRNA​, dependendo do tipo de 
processamento que ele tiver. Ou seja, é o processamento que forma diferentes mRNA maduros que é 
determinado por diferentes fatores de processamento, que sinalizam o tipo de processamento 
necessário. 
Outros tipos de processamento: ​Escolha do sítio de poli A não é necessariamente no mesmo 
ponto, por exemplo o transcrito tem uma região A1 e A2, se for adicionada a cauda na região A2 o 
RNA vai ter mais informações genéticas, tendo diferença daquele que se ligou a região A1. Ex: 
diversidade nos domínios variáveis das cadeias pesadas da imunoglobulina. 
Temos também o splicing alternativos (mosca-da-frutas) que ocorre clivagem em duas regiões 
formando duas proteínas,na tradução. 
 
RNA ribossomais e tRNAs também sofrem processamento pode ocorrer por modificações pós 
transcricionais, desaminação, adição de metilas, as modificações das bases são importantes para que 
eles exerçam suas funções dando especificidade a cada um desses tipos de RNA. 
 
O processamento dos transcritos de pré-rRNA em bactérias: 
- Antes da clivagem, o precursor de RNA 30S é metilado em bases específica e sofre 
outras modificações. 
- A clivagem ocorre por endonuclease e exonuclease libera precursores de rRNAs e 
tRNAS. 
- Os produtos finais rRNA 16S, 23S e 5S. - rRNA maduros 
Observação​: acontece o mesmo em eucariotos, mas em compartimentos diferentes (núcleo, nucléolo, 
citoplasma). 
 
Processamento dos transcritos de pré-rRNA em eucariontes 
- RNA nucleolares pequenos, ou snoRNA ​reconhecem sequências do rRNA promovem 
modificações nas bases, 
- o snoRNA se associa às proteínas,formando um complexo ​snoRNP ​que vão fazer pareamento 
com sequências específicas do rRNA para que ocorram as clivagens iniciais, formando pré 40S 
e pré-60S, 
- Após algumas clivagens adicionais (exonuclease) as subunidades ribossomais maduras são 
formadas no citoplasma. 
 
Processamento dos RNAs transportadores 
- corte da extremidade da 5’ -3’ por molécula de ​RNase P (5’)​ ​e RNase D (3’)​ ( RNA catalítica) 
- adição de uma trinca CCA na posição 3’OH, importante na ligação do aminoácido durante a 
tradução 
- a adição é feita pela ​nucleotidiltransferase ​do tRNA, não dependendo de um molde de DNA 
ou RNA 
- modificações das bases (metilação,desaminação ou redução) 
- splicing em eucariotos, remoção introns de 14 nucleotídeos. 
 Todos os RNAs são processados!!! 
 
Ribozimas​: são RNA catalíticos. Exemplos: 
- íntrons do grupo 1 que sofre autosplicing 
 
- RNase P que faz degradação da extremidade 5’ no processamento de tRNA 
- ribozima cabeça de martelo 
São bastante parecidas com as enzimas, em relação a sua especificidade, atividade de ativação e 
normalmente catalisam transesterificação e hidrólise da ligação fosfodiéster.Podem ser inativadas 
através de alguns mecanismo. 
 
A quantidade de mRNA em uma célula é importante para a regulação de uma expressão 
gênica. Exemplo, precisa de uma proteína em grande quantidade, a taxa de degradação será baixa em 
relação a taxa de síntese. Se quer manter as taxas, tem que ser iguais, ou diminuir a quantidade de 
proteína é aumentar a quantidade de mRNA. 
A degradação pode ser feita na E,coli por endonuclease e exonuclease 5’-3’, em eucariotos 
inferiores acontece o encurtamento da cauda poli (A), remoção da 5’ quepe, tendo degradação no 
sentido 5’-3’, em eucariotos superiores existe uma maquinaria responsável por essa degradação que é o 
exossomo, ​começando pela extremidade 3’ de rRNA, tRNA e mRNA. 
 
A enzima ​polinucleotídeo-fosforilase forma reversivelmente polímeros semelhantes ao RNA a 
partir de ribonucleosídeos 5’-difosfato, adicionando ou removendo ribonucleotídeos na extremidade 
3’-hidroxila do polímero. ​RNA não dependente do molde do DNA 
 
 Regulação da expressão gênica 
 
A concentração celular de um proteína é determinada pelo equilíbrio delicado de ao menos sete 
processos, cada um tendo vários pontos de regulação potenciais. 
1. Síntese do transcrito de RNA primário (transcrição) 
2. Modificação pós transcricional do mRNA 
3. Degradação do RNA mensageiro 
4. Síntese proteica (tradução) 
5. Modificação pós traducional da ptns 
6. Direcionamento e transporte de ptns 
7. Degradação de ptns 
 
Genes constitutivos: ​produtos necessários em todos os momentos na célula, os que geram as enzimas. 
A expressão desses genes é chamada de expressão do gene constitutivo. 
 
Expressão gênica regulada: produtos gênicos que podem aumentar ou diminuir em resposta a sinais 
moleculares. 
Produtos gênicos que aumentam de concentração - ​induzíveis​, o processo de aumentar sua 
expressão é a ​indução​. 
 Produtos gênicos que diminuam em concentração são ​repressíveis​, e o processo é ​repressão​. 
A RNA-polimerase se liga ao DNA nos promotores 
 
A regulação da iniciação da transcrição envolve alterações em como a RNApol interage com 
um promotor. 
A região promotora geralmente está próxima a sequência onde a RNA polimerase vai se ligar, 
e se estiver distante vai gerar uma diminuição na afinidade de ligação das RNA pol ao promotor, assim 
afetando a frequência de iniciação da transcrição. 
 Três tipos de proteínas regulam a iniciação da transcrição pela RNA pol: 
 Fatores de especificidade ( subunidade sigma): alteram a especificidade da RNA-pol para 
um determinado promotor ou conjuntos de promotores.Repressores: ​impedem o acesso da RNApol ao promotor. 
 Ativadores: ​estimulam a interação RNApol-promotor. 
 
Fatores de especificidade - procariotos - A subunidade sigma da RNA pol que controla o reconhecimento 
e a ligação do promotor. Eucariotos - proteína de ligação TATA (TBP) pode ser considerada como fator de 
especificidade. 
Repressores (procariotos)- Se ligam ao sítio específico de DNA, operadores, geralmente próximo de um 
promotor ou dentro. A ligação da RNA-pol ou o seu movimento ao longo do DNA após sua ligação a ele 
(operador), é bloqueada quando o repressor está presente. Exemplo de ​repressor ligado ​(​Regulação 
negativa). 
Alguns casos, o repressor está inativo e a molécula sinalizadora leva o repressor a se ligar ao operador. 
Ativadores - ​se ligam ao DNA e estimulam a atividade da RNApol em um promotor,trata-se de uma 
regulação positiva. Em eucariotos, a distância entre os sítios de ligação de ativadores ou repressores e 
promotores é superada fazendo alças (​looping​) no DNA entre eles. 
 
 
 
O processo de looping é facilitado em alguns casos por proteínas chamadas de ​reguladores 
arquitetônicos ​que se ligam a sítios de intervenção e facilitam o ​looping ​do DNA. Tem uma interação entre 
ativadores e a RNApol no promotor que é mediada por coativadores. Esses reguladores facilitam o contato 
dos ativadores, com o coativador e a RNApol II. 
 Proteínas regulatórias têm domínios separados de ligação de DNA 
 
​Ptns regulatórias geralmente se ligam a sequências de DNA específicas de ativação ou repressão da 
região promotora através da disponibilidade de sítios de ligações de hidrogênios que são distintos 
dependendo dos 4 tipos de bases complementares. Elas normalmente se ligam ao sulco maior, mas também 
é possível no sulco menor. São as cadeias laterais de aminoácidos das ptns regulatórias que se ligam aos 
pares de bases por meio de ligações de hidrogênios. Arg (citosina e guanina) e Asp (timina- adenina) . 
 
Outras possibilidade do reconhecimento das proteínas regulatória seria os palíndromos, que podem 
formar certas estruturas na fita de DNA, como grampos entre outros que são reconhecidas pelas ptns 
regulatórias. 
 Motivos de ligação do DNA: 
Hélice-volta-hélice - uma volta beta entre dois segmentos helicoidais, um segmento é de reconhecimento 
 
da sequência de DNA. 
Dedo de zinco - uma alça alongada que é estabilizada por um único Zn2+ que é coordenado por 4 Cys, 
ou dois Cys e dois His. São encontrados vários desses motivos na ptn. Não é comum em bactérias. 
 
Domínios de interação proteína-proteína 
Motivos estruturais: 
Zíper de leucina - é uma alfa hélice anfipática com uma série de resíduos de aas hidrofóbicos 
concentrados de um lado, com a superfície hidrofóbica formando a área de contato entre os dois 
polipeptídios de um dímero. A cada sete posições ocorre resíduos de leucina lado a lado. 
 
Hélice-alça-hélice ​básica- duas alfa hélices anfipáticas ligadas por uma alça de comprimento variável, 
esse motivo é importante para interação com o DNA, fazendo o reconhecimento da sequência, e também na 
formação de dímeros. 
 
Muitos genes bacterianos são reunidos e regulados em óperons 
Óperons- grupo de genes e o promotor, acrescido de sequências adicionais que funcionam juntas na 
regulação. São comuns óperons com dois a seis genes transcritos, alguns contém 20 ou mais genes e são 
regulados por um promotor. 
 
Óperon lac - dois genes envolvidos no metabolismo da lactose, os beta-galactosidase , que quebra a 
lactose em galactose e glicose e/ou a polimerização da lactose em alolactose, e os da galactosídeo-permease 
(lactose permease) que transporta lactose para o interior da célula. 
 
 REGULAÇÃO NEGATIVA DO ÓPERON LAC 
O óperon lac tem 3 genes que codificam a expressão de três proteínas, ​beta-galactosidase (Z), 
galactosídeo-permease (Y), e o tiogalactosídeo-transacetilase (A)​. O gene lac A é responsável por 
modificar os galactosídeos tóxicos para facilitar sua remoção da célula. 
Na ausência de lactose, os genes lac óperon são reprimidos. Mutações no operador ou em outro gene, o 
gene I, resultam na síntese constitutiva de produtos gênicos. 
O gene I é o repressor lac, o operador que ele se liga é adjacente ao sítio de início da transcrição. O 
repressor lac é transcrito a partir do seu próprio promotor, independente dos genes óperon lac. Ele tem dois 
sítios de ligação secundário para o repressor Lac [operador] 
 
 
O promotor (Pi) fica separado do repressor Lac, 
quando o repressor é expresso ele se liga ao operador O​3 e 
O​1 na região promotora dos outros genes do óperon Lac, 
ele também pode se ligar a outros operadores como o O ​1 ​E 
O​2 ​, como mostrar no desenho ao lado. 
É formado uma alça no DNA que impede a transcrição 
pela RNA-polimerase. O repressor ele pode ser desligado, 
se acontecer isso a lactose vai pode entrar na célula, ela se 
liga ao repressor gerando uma modificação nele que se 
solta da região operadora. Assim há maior chances da 
expressão do óperon Lac, quem faz a dissociação do 
repressor com a região operadora é a alolactose. [ 
EXEMPLO DE REPRESSOR INATIVO] 
 
 
REGULAÇÃO POSITIVA DO ÓPERON LAC 
A fonte primária de energia não é a lactose, sim a GLICOSE, mesmo que tenha lactose no meio, a bactéria 
vai preferir a glicose, porque ela já vai ter os genes de utilização da metabolização da glicose construtivo, que 
são sempre expresso. Caso ela escolha a glicose terá que metabolizar os genes do óperon lac, isso só ocorre na 
AUSÊNCIA de glicose. 
Glicose em altas concentrações, tem muitas moléculas de ATP, mas quando está em baixa quantidade, esse 
ATP é consumido ocorrendo desfosforilação, se tornando AMP que se transforma em AMP cíclico (cAMP) que 
atua como coativador da RNA-polimerase. A proteína receptora de cAMP ou CRP é uma ptn ativadora do 
óperon Lac 
 
Quando a lactose está AUSENTE, o repressor se liga ao operador e impede a transcrição dos genes 
lac. Não importa se a glicose está ausente ou presente. 
 
Se a lactose estiver presente, o repressor se dissocia do operador. Mesmo se a glicose e a lactose 
estiverem disponíveis, mas a quantidade de cAMP estiver baixa não ocorre a formação do CRP-cAMP, a 
RNA pol pode até iniciar a transcrição, resultando em um baixo nível de expressão gênica. 
 
Quando a lactose está presente e tem baixo nível de glicose, o nível de cAMP aumenta, formando o 
complexo CRP-cAMP que facilita a ligação da RNA pol, resultando no alto nível de expressão gênica. 
 
 O CRP-cAMP é um ​regulon​, pois regula vários óperons. 
 
 ÓPERON DO TRIPTOFANO 
 
Existem diversos genes que são importantes na síntese de triptofano na célula de bactérias. Tem dois tipos 
de regulação, uma negativa e outra positiva 
 A regulação negativa é semelhante, mas o oposto a do óperon lac. Existe um repressor do óperon do 
triptofano que é capaz de se ligar a triptofanos livres na célula, quando ocorre essa ligação o repressor muda sua 
conformação e podese ligar a região operadora, bloqueando a transcrição do óperon do triptofano. Ou seja, se já 
tem triptofano suficiente na célula não é necessário iniciar a síntese de mais triptofano. 
 
 
Atenuação da transcrição - ​o mRNA que transcreve o óperon do triptofano logo no início tem uma região 
chamada de peptídeo líder onde tem quatro sequências bem conservadas. 
Na sequência 1 tem um códon que traduz Metionina (onde começa a tradução), nessa sequência tem dois 
triptofano seguidos. A sequência 3 pode parear com a sequência 2 e/ou a 4. O determina esse pareamento é a 
presença em altas ou baixas concentrações de triptofano. 
Em ​altas concentrações​, aumenta a concentração de tRNA de triptofano, o ribossomo rapidamente traduz 
a sequência 1 e bloqueia a sequência 2 antes da sequência 3 ser transcrita. A transcrição contínua leva à 
atenuação na ​estrutura atenuadora semelhante a um terminador formada pela ​sequências 3 e 4 rica em Guanina 
 
e Citosina seguida de Uracilas (gera uma desestabilização, onde o RNApol e mRNA se dissociam). 
 
Em baixas concentrações de triptofano, o ribossomo pausa nos códons Trp na sequência 1. A 
formação da estrutura pareada entre as sequências 2 e 3 impede a atenuação,pois a sequência não está mais 
disponível para formar a estrutura do atenuador com a sequência 4. Não impede a transcrição a estrutura 2:3, ao 
contrário da 3:4. 
 
 
 ​TRADUÇÃO 
 
Propriedades-chave do código genético 
- um códon é um triplete de nucleotídeos que codifica um aminoácido específico, 
- a fase de leitura é sucessiva e sem sobreposição ( na maior partes dos casos) 
- sequência de DNA fita simples ou mRNA tem três fases de leitura possíveis 
- cada códon codifica um tipo de aminoácido que direciona a síntese de proteínas específicas 
 
São 64 códons possíveis, 61 codificam aminoácidos e 3 códons sinalizam a parada.Pode ter vários códons 
para um aminoácido. 
 
A fase de leitura começa quando a tradução de uma molécula de mRNA é iniciada, sendo mantida 
pela maquinaria de síntese que vai lendo a mensagem sequencialmente, de um códon para outro. 
Se algum nucleotídeo for pulado, todos os códons subsequentes ficarão fora de registro, resultando 
em uma proteína ‘errada’’ com seq de aas distorcida. Para iniciar a tradução é necessário o ​códon de 
iniciação AUG que codifica a Metionina. ​Os códons de paradas ( UAA,UAG e UGA) ​determina o 
término da tradução. 
 
Fase de leitura aberta (ORF) - ​ fase de leitura sem códon de parada. 
 
Degeneração do código genético - ​quando uma aminoácido pode ser codificado por mais de um 
códon, essa degeneração não é uniforme, alguns aas são codificados por até 6 códons, outros por até 4 ou 
 
3. Esses códons são idênticos em todas as espécies mostrando um ancestral comum na escala evolutiva. 
Um códon não pode sintetizar dois aminoácidos diferentes. 
O pareamento entre o códon e anticódon - o alinhamento entre os dois RNAs é antiparalelo, 3 
pareamentos diferentes são feitos quando o anticódon do tRNA contém inosinato. 
 
Hipótese da oscilação 
1. As duas primeiras bases de um códon no mRNA sempre estabelecem pareamentos fortes de bases 
do tipo watson Crick co as bases correspondentes no anticódon do tRNA e conferem a maior parte 
da especificidade do código. 
2. A primeira base do anticódon (lendo na direção 5’-3’, essa base pareia com a terceira base do 
códon) determina o número de códons reconhecidos pelo tRNA. Quando a base do anticódon é ​C 
ou A​, o pareamento de base é ​específico​, e apenas um códon é reconhecido por aquele tRNA. 
 Quando o primeiro ​base é U ou G, a ligação é ​menos específica​, e dois códons diferentes podem 
ser ligados.Quando inosina (I) é o primeiro nucleotídeo (oscilante) de um anticódon, três códons diferentes 
podem ser reconhecidos - o número máximo para qualquer tRNA. 
3. Quando um aminoácido é especificado por diversos códons diferentes, os códons que diferem em uma 
das duas primeiras bases requerem tRNAs diferentes. 
4. Um mínimo de 32 tRNAs são necessários para traduzir todos os 61 códons (31 para codificar os 
aminoácidos e 1 para o início da tradução). 
 
 
A base oscilante (ou terceira base) do códon contribui para a especificidade, como pareia de forma 
frouxa, ela permite uma dissociação rápida entre tRNA e seu códon durante a síntese. Se todas as 3 bases 
tivessem fortes pareamentos, a dissociação seria muito lenta, limitando a velocidade da síntese. 
 
Mutações sem sentido - ​um novo par de bases substitui outro​. ​São mutações silenciosas, ​nas 
quais os nucleotídeos são diferentes, mas o aa codificado permanece o mesmo. 
Mutação de transição - uma purina ou pirimidina é substituída por outra purina ou pirimidina.Ex: 
G-C substituído por A-T. As mudanças geralmente são pequenas nessa proteína codificada. 
 
 Modificação da fase de leitura 
Não existe mudança de fase de leitura na tradução, quando estabelecido o quadro de leitura 
os códons são traduzidos sem haver sobreposição. No entanto, às vezes pode acontecer modificações 
que são importante para variedade de proteínas. 
Genes sobrepostos gag e pol do vírus do sarcoma de Rous - o mRNA do vírus é lido pelo 
ribossomo que não para no códon de parada, pois pula um nucleotídeo e muda a leitura do mRNA, assim 
é produzido duas proteína gag e pol ( transcriptase reversa do vírus) que ficam unidas e depois não 
separadas por um enzima. 
 
Edição do RNA ​: envolver a adição, deleção ou alteração de nucleotídeos no RNA afetando o transcrito 
traduzido. 
Ex: citocromo-oxidase das mitocôndrias de trypanosoma brucei - inserção de 4 resíduos de U produz um 
quadro de leitura revisada. Uma classe de RNA guias complementares ao produto editado, agem como 
molde para o processo de edição. O pareamento não é do tipo Watson-Crick. 
 
 
 Outras modificações é a desaminação da adenosina formando inosina, em citidina é formado a 
uracila. 
A tradução de Apoliproteínas B de tamanhos diferentes no fígado e no intestino são codificadas pelo 
mesmo mRNA produzido a partir do gene da apoB-100, quando uma citidina-desaminase APOBEC do 
intestino liga-se ao códon CAA (Gln) do mRNA, ela converte o C em U, formando UAA (códon de 
parada). Ou seja, no fígado a ptn é toda traduzida, no intestino a tradução é parada antes formando a 
apoB-48. 
 SÍNTESE PROTEICA 
Ribossomo ​ formado de proteínas e rRNAs. 
Bactérias 70S ( 30S e 50S); eucariotos 80S (60S e 40S) complexo 
RNA transportador ​formado por​ ​73 -93 resíduos nucleotídeos 
folha - de- trevo com 4 braços, o do anticódon, D, do aminoácido e braço T/C. 
 
 CINCO ESTÁGIOS 
Estágio 1 - ​ativação de aminoácidos ( citosol) 
O grupamento carboxil de cada aminoácido é ativado para facilitar a formação da ligação peptídica 
e um elo deve ser estabelecido entre cada novo aa e a informação contida no mRNA que o codifica. Essa 
ligação covalente dos aas em cada tRNA específico gasta ATP, utilizando enzimas ativadorasdependentes 
de Mg2+, conhecidas como ​aminoacil-tRNA-sintases. 
 
Estágio 2 - Iniciação 
O mRNA se liga à subunidade menor do ribossomo e ao aminoacil-tRNA iniciador, depois a 
subunidade maior se liga formando um complexo de iniciação. O aminoacil-tRNA estabelece um 
pareamento de bases com o códon AUG do mRNA, que sinaliza o começo do polipeptídeo. Processo 
requer GTP promovido por fatores de iniciação. 
 
Estágio 3 - Alongamento 
O polipeptídeo nascente é alongado pela adição de unidades sucessivas de aminoácidos, as quais 
são ligadas covalentemente após serem levadas até o ribossomo e posicionadas corretamente pelo 
respectivo tRNA, o qual, por sua vez, realiza um pareamento de bases com o códon correspondente no 
mRNA. O alongamento requer proteínas citosólicas conhecidas como fatores de alongamento. A ligação de 
cada aminoacil-tRNA que entra e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA são facilitados pela 
hidrólise de GTP à medida que cada resíduo é adicionado ao polipeptídeo nascente. 
 
Estágio 4:​ ​Terminação e reciclagem do ribossomo 
A conclusão da cadeia polipeptídica é sinalizada por um códon de parada no mRNA. O novo 
polipeptídeo é liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas denominadas fatores de liberação, e o 
ribossomo é reciclado para um novo ciclo de síntese. 
 
Estágio 5:​ ​Enovelamento e processamento pós-traducional 
Para que possa atingir sua forma biologicamente ativa, o novo polipeptídeo precisa dobrar-se em 
sua conformação tridimensional apropriada. Antes ou depois de dobrar-se, o novo polipeptídeo pode sofrer 
processamento enzimático, incluindo remoção de um ou mais aminoácidos (geralmente da extremidade 
aminoterminal); adição de grupamentos acetil, fosforil, metil, carboxil, ou outros grupos a certos resíduos 
de aminoácidos; clivagem proteolítica, e/ou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos. 
 
Aminoacilação do tRNA pelas aminoacil-tRNA-sintases - 
Etapa 1 -formação de um intermediário ligado à enzima, o ​aminoacil-adenilato​ (aminoacil-AMP) 
 
Etapa 2 - o grupo aminoacila é transferido do aminoacil-AMP ligado à enzima para o seu tRNA 
específico. Ligação éster entre o aa e o tRNA 
 
Edição pelas aminoacil-tRNA- sintases 
 
Quantidade de energia de ligação disponível entre a enzima e o substrato - 
Ex: A valina é parecida com a Isoleucina, no entanto a interação que cada um tem com a enzima é 
diferente, devido a presença de um grupo de metileno no Ile. A quantidade de energia de ligação é um 
mecanismo de edição, pois possibilita o reconhecimento feito pela enzima do substrato correto, como o Ile 
tem o grupo de metileno ocorre a intensificação da ligação com o substrato, formando Ile-AMP ( 
intermediário). 
 Sítio de edição - que é separado do sítio de ligação do aminoácido ao tRNA, não é mais 
considerado a disponibilidade de fazer a interação, mas o tamanho do aminoácido. A valina que é 
pequena acaba entrando no sítio hidrolítico, onde é hidrolisada e não completa a primeira etapa (formação 
do intermediário). 
Também pode ocorrer a hidrólise da ligação do éster entre aminoácidos e tRNA nos 
aminoacil-tRNA, essa hidrólise é bem acelerada em tRNA carregados incorretamente. 
 
Interação entre uma aminoacil-tRNA-sintase e um tRNA 
O reconhecimento do tRNA pelo aminoacil-tRNA ocorre pela a presença de pontos específicos e da 
estrutura de enovelamento tridimensional do tRNA. Os pontos e a estrutura são diferentes para cada tipo de 
tRNA. Alguns casos apenas uma base é responsável pelo reconhecimento. 
 
Códon de iniciação AUG - existem dois tRNA de metionina 
Em ​Procariotos ​têm um tRNA metionina e um tRNA metionina formilada. A Met-tRNA sintase 
reconhece os dois tRNA apesar de seres diferentes. O aminoácido incorporado em resposta ao códon de 
iniciação é o formilado, que impede a ligação do tRNA em outros códons. Em eucariontes, o tRNA que 
inicia é a metionina 
A iniciação da síntese de um polipeptídeo nas bactérias requer ​a subunidade 30S do ribossomo​, o 
mRNA que codifica o polipeptídeo a ser produzido, ​o fMet-tRNAfMet iniciador​, um conjunto de três 
proteínas denominadas ​fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3), GTP, a ​subunidade 50S do ribossomo e 
Mg. ​ O alinhamento correto do AUG iniciador no ribossomo, depende da sequência shine Dalgarno. 
 
A iniciação nas células eucarióticas requer vários fatores de iniciação, as extremidades 3’ e 5’ dos 
mRNAs de eucariotos são unidas pelo complexo protéico eIF4F. A subunidade eIF4E liga-se ao quepe 5’, 
e a proteína eIF4G liga-se à proteína ligadora da cauda poli(A) (PABP) na extremidade 3’ do mRNA. A 
proteína eIF4G também se liga ao eIF3, unindo o mRNA circularizado à subunidade 40S do ribossomo. 
Eucariotos não tem shine Dalgarno como bactérias, mas tem esse complexo que se move pela o mRNA 
até encontrar o AUG. 
 
A atividade enzimática que catalisa a formação da ligação peptídica é chamada de 
peptidil-transferase e que é feita pela subunidade maior do ribossomo, essa ligação peptídica é feita entre 
os aminoácidos formados. 
 
Terminação da síntese de proteínas em bactérias​. 
A terminação ocorre em resposta a um códon de parada no sítio A. Primeiro, um fator de liberação, 
RF (RF-1 ou RF-2, dependendo do códon de parada presente), liga-se ao sítio A. Isso causa a hidrólise da 
ligação éster entre o polipeptídeo nascente e o tRNA no sítio P e a liberação do polipeptídeo completo. 
Finalmente, o mRNA, o tRNA desacilado e o fator de liberação saem do ribossomo, o qual se dissocia em 
 
suas subunidades 30S e 50S, auxiliado pelo fator de reciclagem do ribossomo (RRF), pelo IF-3 e pela 
energia fornecida pela hidrólise de GTP mediada por EF-G. O complexo formado pela subunidade 30S e 
pelo IF-3 está pronto para iniciar um outro ciclo de tradução. 
 
Importância do elevado custo energético da síntese proteica 
​Cada um dos compostos fosfatados altamente energéticos gastos nesse processo têm papel fundamental na 
manutenção do alinhamento correto entre cada novo códon no mRNA e o seu respectivo aminoácido na 
extremidade crescente do polipeptídeo. Essa energia permite uma altíssima fidelidade na tradução 
biológica da mensagem genética do mRNA para a sequência de aminoácidos das proteínas. 
 
 MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS 
 
Modificações aminoterminais e carboxiterminais 
Modificação de aminoácidos individuais- 
Ligação de cadeias laterais de carboidratos 
Adição de grupos isoprenila - ​ancorar a ptn na membrana 
Adição de grupos prostéticos 
Processamento proteolítico 
Formação de pontes dissulfeto 
 
 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
 
Importância da tecnologia do DNA - permitiu um avanço enorme nas ciências biológicas, pois 
possibilitou estudar as proteínas, entender sua catálise enzimática, estrutura (função), e também teve 
avanços nas rotas de informações e no metabolismo celular. A tecnologia possibilitou os estudos de 
processos bioquímicos mais complexos através do isolamento e estudo dos componentes de forma 
particular. Além disso, rompeu a maior dificuldade que era a baixa quantidade de substância de interesse, 
por meio de métodos que manipulamessa quantidade. 
 
 CLONAGEM DO DNA 
Deve-se cortar o gene do cromossomo maior, anexá-lo a uma porção muito menor de DNA 
transportador e permitir que microrganismos façam muitas cópias dessa porção. O resultado é a 
amplificação seletiva de um determinado gene ou segmento de DNA, facilitando seu isolamento e estudo. 
A clonagem envolve cinco procedimentos gerais: 
1. cortar o DNA-alvo em locais precisos​.Endonucleases específicas de sequência 
(endonucleases de restrições) fornecem as tesouras moleculares necessárias. 
2. Selecionar uma pequena molécula transportadora de DNA capaz de autorreplicação - 
Vetores de clonagem, geralmente plasmídeos ou DNAs virais 
3. Juntar dois fragmentos de DNA de modo covalente - A enzima DNA-liga liga o vetor de 
clonagem e o DNA a ser clonado. Moléculas de DNA compostas por segmentos ligados de 
modo covalente a partir de duas ou mais fontes são chamadas de DNAs recombinantes. 
4. Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira que 
irá proporcionar a maquinaria enzimática para a replicação do DNA. 
5. Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém DNA recombinantes. 
 
Esses métodos utilizados são chamados de tecnologia do DNA recombinante ou, engenharia 
genética. 
 
 
 
Endonucleases de restrição - reconhecem e clivam o DNA em sequências específicas (de 
reconhecimento ou sítios de restrição) para gerar um conjunto de fragmentos menores. 
DNA-ligases ​- responsável por ligar os fragmentos ao vetor de clonagem adequado. 
Sistema de restrição-modificação​ - endonuclease de restrição e a metilase 
 
Tipos de endonucleases de restrição 
 Tipo I e III são complexos grandes com múltiplas subunidades,contendo atividades tanto de 
endonuclease quanto de metilase. AMBAS se movem ao longo do DNA em uma reação com gasto de 
ATP. 
 Tipo I - clivam o DNA em sítios aleatórios que podem estar a mais de 1.000 pb da sequência de 
reconhecimento. 
 Tipo III​ - clivam o DNA a cerca de 25 pb da sequência de reconhecimento. 
Tipo II - ​não requer gasto de ATP e catalisam a clivagem hidrolítica de ligações fosfodiésteres 
específicas no DNA dentro da própria sequência de reconhecimento. 
 
Algumas endonucleases restrição fazem cortes ordenados nas duas fitas do DNA, deixando dois a 
quatro nucleotídeos de um fita sem par em cada extremidade resultante. 
Fitas sem pares são chamadas de ​extremidades 
adesivas ​, pois formam pares de bases entre si ou 
com extremidades adesivas complementares de 
outro fragmento. IMPORTÂNCIA!! 
 
Extremidades cegas - quando endonucleases clivam 
ambas as fitas do DNA nas ligações fosfodiésteres 
opostas, sem deixar nenhuma base sem par nas 
extremidades. 
Linkers​:novas sequências de DNA que são feita 
através da inserçãode fragmentos sintéticos de DNA. 
 
 
 VETORES DE CLONAGEM 
Plasmídeos ​- molécula de DNA circular que se replica separadamente do cromossomo hospedeiro 
1. tem ​origem de replicação ou ​ori, sequência onde a replicação é iniciada 
por enzimas celulares; 
2. contém genes que conferem ​resistência aos antibióticos tetraciclina (Tet 
r) e ampicilina (Amp r), permitindo a seleção de células que contém o plasmídeo 
intacto ou uma versão recombinante do plasmídeo. 
3. várias sequências de reconhecimento únicas no pBR322 são alvo para 
endonuclease de restrição , fornecendo sítios onde o plasmídeo pode ser cortado e 
inserido em um DNA exógeno. 
4. o ​tamanho pequeno que facilita sua entrada nas células e a manipulação 
bioquímica 
 
 O número de cópias de plasmídeos depende do tipo de origem usada. Se for 
utilizar dois plasmídeos diferentes em uma célula é necessário que tenham 
origens diferentes,para que a regulação de um não interfira na do outro. 
Transformação - ​o plasmídeo e a célula bacteriana, geralmente a E.coli são incubados juntos a 0 grau 
celsius em uma solução de cloreto de cálcio, em seguida, submetidos a choque térmico, alterando 
rapidamente a temperatura para entre 37-43 graus celsius. Assim a célula bacteriana captam o DNA 
 
plasmidial. ​Eletroporação ​- impulso elétrico 
Marcadores de seleção - ​pode permitir tanto o crescimento de uma célula (seleção positiva) quanto 
matar a célula (seleção negativa). Marcador de triagem é um gene que codifica uma ptn que leva a célula 
a produzir uma molécula colorida ou fluorescente (quando a célula transporta o plasmídeo) 
 
1. O pBR322 (plasmídeo) é clivado no elemento de resistência à ampicilina onde tem o gene PstI; 
2. Fragmentos de DNA clonados são ligados ao plasmídeo clivado. Onde a ligação é bem-sucedida, o 
elemento de amp é interrompido. O de resistência à tetraciclina permanece intacto. 
3. Células de E.coli são transformadas e, então, cultivadas em placas de ágar contendo tetraciclina 
para isolar as linhagens que incorporam o plasmídeo. 
4. Após a seleção de células transformadas, todas as colônias têm plasmídeos e a ágar contém 
tetraciclina. 
5. Colônias individuais são transferidas para posições correspondentes em placas adicionais. Uma 
contendo tetraciclina, a outra tetraciclina e ampicilina. 
6. As células que crescem em tetraciclina (mas não em tetraciclina + ampicilina) contêm plasmídeos 
recombinantes com resistência à ampicilina interrompida, portanto o DNA exógeno. Células com 
plasmídeo, mas sem DNA exógeno, mantêm a resistência à ampicilina e crescem em ambas as 
placas. 
 
Bacteriófagos λ ( para fragmentos de DNA maiores) 
- região inútil é retirada e coloca o DNA de interesse 
- Mais eficiente que a ​transformação bacteriana​ com ​plasmídeos 
- 40.000 e 53.000 bp só é empacotado com esse comprimento, menor o fago não empacota 
 
Cosmídeos 
- podem conter DNAs exógenos de até 48 kb. 
- não possuem os genes dos fagos 
 
 Cromossomos artificiais bacterianos (BAC) 
- clonagem de segmentos muito longos ( 100.000 a 300.000 pb) 
- usam de uma a duas cópias por célula 
- tem marcadores de seleção e de triagem ( beta galactosidase ) 
- parede celular tem que ser rompida para introduzir a cópia 
- produto azul: se o gene intacto for expresso; produto branco: expressão do gene interrompida 
 
Cromossomos artificiais de leveduras (YACs) 
- ​condições essenciais para manter dentro da levedura, origem de replicação, dois marcadores de 
seleção e sequências especializadas (telômeros e centrômeros) necessárias para a estabilidade e a 
segregação adequadas dos cromossomos na divisão celular; 
- o vetor é propagado como um plasmídeo bacteriano circular para se isolado e purificado; 
- ocorre a clivagem por BamHI, o cromossomo fica linear com extremidades teloméricas; 
- outra clivagem divide o vetor em dois braços cada um com um marcador de seleção diferentes; 
- o fragmento de DNA humano é adicionado entre os marcadores, ocorrendo a transformação 
- O YAC transforma as células de levedura (preparadas pela remoção da parede celular para formar 
esferoplastos) e as células são selecionadas para X e Y; as células sobreviventes propagam as 
inserções de DNA 
 
Alteração de genes clonados produz proteínas alteradas 
Aminoácidos específicos da estrutura primária podem ser substituídos individualmente por ​mutagênese 
 
sítio-direcionada. Se os sítios de restrição adequados se situam ao lado da sequência a ser alterada,