bioquimica Km e Vmax

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS
Determinação de Parâmetros Cinéticos Enzimáticos
Julho de 2014
INTRODUÇÃO
O conhecimento de parâmetros cinéticos das atividades enzimáticas é de extrema importância em indústria de alimentos, isso porque as enzimas estão amplamente distribuídas em alimentos e em um produto elas podem ser desejáveis ou não. Sendo assim, tendo o conhecimento dos parâmetros é possível inativar ou não uma enzima em um processamento.
Tendo em mente que a concentração de substrato é um dos fatores que afetam a velocidade de catalise de uma enzima, estudos no passado evidenciam que a velocidade da mesma está relacionada como é evidenciado pelo modelo matemático de Michaelis e Menten de 1909. Este que leva em consideração a consideração a concentração de substrato e a velocidade com que ela ocorre (equação 1). A equação é baseia-se na hipótese que a velocidade da reação diminui ao passo que o complexo enzima substrato (ES), se desfaz (ADAPTADO, MARIOTTO, J. R., 2006).
	
	(Equação 1)
A fim de linearizar o modelo de Michaelis e Menten, foi proposto o modelo de Lineweaver-Burk apresentado (equação 2), este que emprega apenas algumas mudanças algébricas, mas que possui melhor representação quando comparado com o modelo tradicional da equação da reta(LEHNINGER,1995). 
	
	(Equação 2)
A equação de Michaelis e Menten descreve o comportamento cinético de um grande número de enzimas, e todas as enzimas que exibem uma dependência hiperbólica da velocidade inicial (Vo) em função da concentração de substrato são ditas seguirem a cinética de Michaelis e Menten. A regra prática de que Km é igual a concentração de substrato quando a velocidade inicial for igual a metade da velocidade máxima vale para as enzimas que seguem cinética de Michaelis e Menten. O parâmetro Km, determinado experimentalmente, é geralmente utilizado para estudo e comparação de enzimas, sendo algumas vezes utilizado como um indicador da afinidade de uma enzima para seu substrato (NELSON, D. L., COX, M. M., 2006).
O objetivo desse trabalho foi determinar os parâmetros cinéticos de duas enzimas amilolíticas, identificando a que tem maior afinidade pelo substrato amiláceo.
 3.MATERAL E MÉTODOS
	Para avaliar a cinética enzimática, foram utilizadas duas amilases de fontes diferentes, sendo as enzimas a amiloglicosidase e uma α-amilase fúngica.
	Esses extratos enzimáticos foram diluídos (1:2000) e 0,5 mL foram adicionados em tubos reacionais contendo também tampão fosfato 50mM pH 7,0 e solução padrão de amido solúvel (1 mg/mL), essas variando de 0 à 2mL. A fim de avaliar a influência do substrato foram realizados 7 ensaios, variando o volume de amido em cada tubo, conforme tabela 1. O volume total dos tubos reacionais foi fixado em 2,5 mL sendo que, as quantidades de tampão fosfato foram diminuídas de acordo com o aumento do volume da solução de amido para que o volume final de 2,5 mL fosse mantido. A reação enzimática ocorreu em banho Maria a 37°C por 15 minutos. Após esse tempo a mesma foi interrompida com a adição de 2,0 mL acido acético (0,2M) e logo após os tubos foram colocados em banho a 100°C para garantir que a reação parasse. A fim de descontar os interferentes, foi realizado um ensaio branco.
Tabela 1: composição dos tubos para a reação enzimática.
	Tubo
	Amido (mL)
	Tampão fosfato (mL)
	Extrato enzimático (mL)
	1
	0,0
	2,0
	0,5
	2
	0,1
	1,9
	0,5
	3
	0,2
	1,8
	0,5
	4
	0,5
	1,5
	0,5
	5
	1,0
	1,0
	0,5
	6
	1,5
	0,5
	0,5
	7
	2,0
	0,0
	0,5
	Para quantificar a quantidade de açúcares hidrolisados foi utilizado o método com DNS (3,5 DNS). A metodologia consiste em pegar 2,0 mL do tudo de reação enzimática, adicionar 1,0 mL de NaOH (1M) e 1,0 mL de DNS em um banho a 10°C por 5 minutos. Para que as amostras pudessem ser lidas em espectrofotômetro, foram adicionados 6,0 mL de água destilada nos tubos. A leitura foi feita em 546 nm em valores de transmitâncias.
	Os resultados foram tratados usando a lei de Lambert-Beer para que a transmitância fosse convertida em absrovância. Também se fez uso das equações 1 e 2 para as determinações cinéticas das duas enzimas, sendo os principais parâmetros de Km, Vmax e V0.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
	Os valores de transmitância obtidos nas leituras das amostras para as diferentes enzimas estão expostos nas tabelas 1, para a α-amilase, e 2, para a amiloglicosidase.
	Tabela 1. Tratamento dos dados da reação enzimática para a enzima α-amilase.
	Tubo
	T (%)
	[S] Amido (mg/mL)
	[Glicose] (mg/mL)
	Velocidade de Reação (v) (mg/mLenz.min)
	1/[S]
	1/V
	1
	96,8
	0,00
	0,00
	0,00
	0,00
	0,00
	2
	96,3
	0,022
	0,0006615
	0,00198
	45,00
	503,91
	3
	95,8
	0,044
	0,001326
	0,00398
	22,50
	251,30
	4
	93,3
	0,111
	0,004704
	0,01411
	9,00
	70,86
	5
	87,2
	0,222
	0,01334
	0,04002
	4,50
	24,99
	6
	75,3
	0,333
	0,03208
	0,09625
	3,00
	10,39
	7
	64,0
	0,444
	0,05285
	0,15855
	2,25
	6,31
	Observando a figura 1, pode-se notar que a velocidade é diretamente influenciada com a concentração do substrato. Em concentrações acima de 0,3 mg/mL de amido, a velocidade aumenta, provavelmente por causa que o substrato está em uma quantidade muito maior que a enzima, favorecendo, assim, com que ela atue sobre o amido.
Figura 1:variação da velocidade da enzima α-amilase em relação a variação de concentração de substrato(amido).
Figura 2: Modelo linearizado de Lineweaver-Burk
	Utilizando a equação 2, tem-se que para a α-amilase os valores de Km e Vmax foram de 0,4635 e de 0,03916 respectivamente.
	Tabela 2. Tratamento dos dados da reação enzimática para a enzima amiloglicosidase.
	Tubo
	T (%)
	[S] Amido (mg/mL)
	[Glicose] (mg/mL)
	Velocidade de Reação (v) (mg/mLenz.min)
	1/[S]
	1/V
	1
	97,7
	0,00
	0,00
	0,00
	0,00
	0,00
	2
	97,3
	0,022
	0,0005240
	0,00157
	45,00
	636,09
	3
	96,7
	0,044
	0,001314
	0,00394
	22,50
	253,65
	4
	93,8
	0,111
	0,005203
	0,01561
	9,00
	64,06
	5
	85,5
	0,222
	0,01704
	0,05111
	4,50
	19,56
	6
	79,1
	0,333
	0,02698
	0,08093
	3,00
	12,36
	7
	73,0
	0,444
	0,03723
	0,11168
	2,25
	8,95
	Ao observar a figura 3, percebe-se que a enzima amiloglicosidase mantém certa linearidade; diferentemente da α-amilase, quando se comparam o par ordenado 0,22 x 0,04 das figuras 1 e 3. O que também pode ser matematicamente comprovado pelo R2 da curva, uma vez que a curva da amiloglicosidase se mostra mais próxima de uma reta que a curva da α-amilase. Em baixas concentrações de substrato a enzima amiloglicosidase se mostra mais eficaz. Em contrapartida a enzima α-amilase apresenta uma velocidade final maior que a amiloglicosidase; o que não pode ser afirmado com certeza, uma vez que faltam ensaios para comprovar experimentalmente qual delas é mais efetiva.
Figura 3:variação da velocidade da enzima amiloglicosidase em relação a variação de concentração de substrato(amido)
	Fazendo o uso da equação 2, os valores de Km e Vmax da amiloglicosidase foram de 0,3186 e de 0,02159 respectivamente.
 
Figura 4: Modelo linearizado de Lineweaver-Burk
	Comparando os valores de Km e Vmax das duas enzimas, tabela 3, tem-se que a enzima α-amilase de origem fúngica se mostra com maior afinidade pelo substrato, e também com uma velocidade de quebra do amido maior.
	Tabela 3: Valores de Km e Vmáx para cada enzima.
	Enzima
	Km
	Vmax
	Alfa-Amilase
	0,4635
	0,03916
	Amiloglicosidase
	0,3186
	0,02159
CONCLUSÃO
Portanto, a enzima α-amilase se mostra mais eficiente na hidrolise do amido quando comprada com a amiloglicosidase, sendo que esta apresentou Km de 0,4635 e Vmax de 0,03916 em quanto a amiloglicosidase apresentou Km e Vmax de 0,3186 e 0,02159 respectivamente.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS
MARIOTTO, J. R. Cinética Enzimática Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf>. Acesso em: 19 de Julho de 2014.
NELSON, D. L., COX, M. M. Lehninger- Princípios de Bioquímica. SARVIER. São Paulo.4ª ed. 2006.
LEHNINGER, A. L. Bioquímica componentes moleculares das células volume 1. 2. Ed. São Paulo: Editora Edgard Blucher LTDA, 1995.