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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS ENGENHARIA DE ALIMENTOS BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS Determinação de Parâmetros Cinéticos Enzimáticos Julho de 2014 INTRODUÇÃO O conhecimento de parâmetros cinéticos das atividades enzimáticas é de extrema importância em indústria de alimentos, isso porque as enzimas estão amplamente distribuídas em alimentos e em um produto elas podem ser desejáveis ou não. Sendo assim, tendo o conhecimento dos parâmetros é possível inativar ou não uma enzima em um processamento. Tendo em mente que a concentração de substrato é um dos fatores que afetam a velocidade de catalise de uma enzima, estudos no passado evidenciam que a velocidade da mesma está relacionada como é evidenciado pelo modelo matemático de Michaelis e Menten de 1909. Este que leva em consideração a consideração a concentração de substrato e a velocidade com que ela ocorre (equação 1). A equação é baseia-se na hipótese que a velocidade da reação diminui ao passo que o complexo enzima substrato (ES), se desfaz (ADAPTADO, MARIOTTO, J. R., 2006). (Equação 1) A fim de linearizar o modelo de Michaelis e Menten, foi proposto o modelo de Lineweaver-Burk apresentado (equação 2), este que emprega apenas algumas mudanças algébricas, mas que possui melhor representação quando comparado com o modelo tradicional da equação da reta(LEHNINGER,1995). (Equação 2) A equação de Michaelis e Menten descreve o comportamento cinético de um grande número de enzimas, e todas as enzimas que exibem uma dependência hiperbólica da velocidade inicial (Vo) em função da concentração de substrato são ditas seguirem a cinética de Michaelis e Menten. A regra prática de que Km é igual a concentração de substrato quando a velocidade inicial for igual a metade da velocidade máxima vale para as enzimas que seguem cinética de Michaelis e Menten. O parâmetro Km, determinado experimentalmente, é geralmente utilizado para estudo e comparação de enzimas, sendo algumas vezes utilizado como um indicador da afinidade de uma enzima para seu substrato (NELSON, D. L., COX, M. M., 2006). O objetivo desse trabalho foi determinar os parâmetros cinéticos de duas enzimas amilolíticas, identificando a que tem maior afinidade pelo substrato amiláceo. 3.MATERAL E MÉTODOS Para avaliar a cinética enzimática, foram utilizadas duas amilases de fontes diferentes, sendo as enzimas a amiloglicosidase e uma α-amilase fúngica. Esses extratos enzimáticos foram diluídos (1:2000) e 0,5 mL foram adicionados em tubos reacionais contendo também tampão fosfato 50mM pH 7,0 e solução padrão de amido solúvel (1 mg/mL), essas variando de 0 à 2mL. A fim de avaliar a influência do substrato foram realizados 7 ensaios, variando o volume de amido em cada tubo, conforme tabela 1. O volume total dos tubos reacionais foi fixado em 2,5 mL sendo que, as quantidades de tampão fosfato foram diminuídas de acordo com o aumento do volume da solução de amido para que o volume final de 2,5 mL fosse mantido. A reação enzimática ocorreu em banho Maria a 37°C por 15 minutos. Após esse tempo a mesma foi interrompida com a adição de 2,0 mL acido acético (0,2M) e logo após os tubos foram colocados em banho a 100°C para garantir que a reação parasse. A fim de descontar os interferentes, foi realizado um ensaio branco. Tabela 1: composição dos tubos para a reação enzimática. Tubo Amido (mL) Tampão fosfato (mL) Extrato enzimático (mL) 1 0,0 2,0 0,5 2 0,1 1,9 0,5 3 0,2 1,8 0,5 4 0,5 1,5 0,5 5 1,0 1,0 0,5 6 1,5 0,5 0,5 7 2,0 0,0 0,5 Para quantificar a quantidade de açúcares hidrolisados foi utilizado o método com DNS (3,5 DNS). A metodologia consiste em pegar 2,0 mL do tudo de reação enzimática, adicionar 1,0 mL de NaOH (1M) e 1,0 mL de DNS em um banho a 10°C por 5 minutos. Para que as amostras pudessem ser lidas em espectrofotômetro, foram adicionados 6,0 mL de água destilada nos tubos. A leitura foi feita em 546 nm em valores de transmitâncias. Os resultados foram tratados usando a lei de Lambert-Beer para que a transmitância fosse convertida em absrovância. Também se fez uso das equações 1 e 2 para as determinações cinéticas das duas enzimas, sendo os principais parâmetros de Km, Vmax e V0. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os valores de transmitância obtidos nas leituras das amostras para as diferentes enzimas estão expostos nas tabelas 1, para a α-amilase, e 2, para a amiloglicosidase. Tabela 1. Tratamento dos dados da reação enzimática para a enzima α-amilase. Tubo T (%) [S] Amido (mg/mL) [Glicose] (mg/mL) Velocidade de Reação (v) (mg/mLenz.min) 1/[S] 1/V 1 96,8 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 96,3 0,022 0,0006615 0,00198 45,00 503,91 3 95,8 0,044 0,001326 0,00398 22,50 251,30 4 93,3 0,111 0,004704 0,01411 9,00 70,86 5 87,2 0,222 0,01334 0,04002 4,50 24,99 6 75,3 0,333 0,03208 0,09625 3,00 10,39 7 64,0 0,444 0,05285 0,15855 2,25 6,31 Observando a figura 1, pode-se notar que a velocidade é diretamente influenciada com a concentração do substrato. Em concentrações acima de 0,3 mg/mL de amido, a velocidade aumenta, provavelmente por causa que o substrato está em uma quantidade muito maior que a enzima, favorecendo, assim, com que ela atue sobre o amido. Figura 1:variação da velocidade da enzima α-amilase em relação a variação de concentração de substrato(amido). Figura 2: Modelo linearizado de Lineweaver-Burk Utilizando a equação 2, tem-se que para a α-amilase os valores de Km e Vmax foram de 0,4635 e de 0,03916 respectivamente. Tabela 2. Tratamento dos dados da reação enzimática para a enzima amiloglicosidase. Tubo T (%) [S] Amido (mg/mL) [Glicose] (mg/mL) Velocidade de Reação (v) (mg/mLenz.min) 1/[S] 1/V 1 97,7 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 97,3 0,022 0,0005240 0,00157 45,00 636,09 3 96,7 0,044 0,001314 0,00394 22,50 253,65 4 93,8 0,111 0,005203 0,01561 9,00 64,06 5 85,5 0,222 0,01704 0,05111 4,50 19,56 6 79,1 0,333 0,02698 0,08093 3,00 12,36 7 73,0 0,444 0,03723 0,11168 2,25 8,95 Ao observar a figura 3, percebe-se que a enzima amiloglicosidase mantém certa linearidade; diferentemente da α-amilase, quando se comparam o par ordenado 0,22 x 0,04 das figuras 1 e 3. O que também pode ser matematicamente comprovado pelo R2 da curva, uma vez que a curva da amiloglicosidase se mostra mais próxima de uma reta que a curva da α-amilase. Em baixas concentrações de substrato a enzima amiloglicosidase se mostra mais eficaz. Em contrapartida a enzima α-amilase apresenta uma velocidade final maior que a amiloglicosidase; o que não pode ser afirmado com certeza, uma vez que faltam ensaios para comprovar experimentalmente qual delas é mais efetiva. Figura 3:variação da velocidade da enzima amiloglicosidase em relação a variação de concentração de substrato(amido) Fazendo o uso da equação 2, os valores de Km e Vmax da amiloglicosidase foram de 0,3186 e de 0,02159 respectivamente. Figura 4: Modelo linearizado de Lineweaver-Burk Comparando os valores de Km e Vmax das duas enzimas, tabela 3, tem-se que a enzima α-amilase de origem fúngica se mostra com maior afinidade pelo substrato, e também com uma velocidade de quebra do amido maior. Tabela 3: Valores de Km e Vmáx para cada enzima. Enzima Km Vmax Alfa-Amilase 0,4635 0,03916 Amiloglicosidase 0,3186 0,02159 CONCLUSÃO Portanto, a enzima α-amilase se mostra mais eficiente na hidrolise do amido quando comprada com a amiloglicosidase, sendo que esta apresentou Km de 0,4635 e Vmax de 0,03916 em quanto a amiloglicosidase apresentou Km e Vmax de 0,3186 e 0,02159 respectivamente. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS MARIOTTO, J. R. Cinética Enzimática Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf>. Acesso em: 19 de Julho de 2014. NELSON, D. L., COX, M. M. Lehninger- Princípios de Bioquímica. SARVIER. São Paulo.4ª ed. 2006. LEHNINGER, A. L. Bioquímica componentes moleculares das células volume 1. 2. Ed. São Paulo: Editora Edgard Blucher LTDA, 1995.
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