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Proteínas • Importância: - São as macromoléculas mais versáteis nos sistemas vivos e possuem funções cruciais em essencialmente todos os processos biológicos. - Funcionam como catalisadores, transportam e armazenam outras moléculas, tais como o oxigênio, fornecem apoio mecânico (citoesqueleto) e proteção imunitária (anticorpos), transmitem impulsos nervosos (proteínas receptoras), geram movimento (proteínas musculares: actina e miosina) e controlam o crescimento e a diferenciação (fatores de crescimento, hormônios). - Participam da composição de alimentos largamente consumidos pelo homem, fornecendo uma quantidade de calorias equivalente aos glicídeos. • Propriedades: Permitem que as proteínas participem de tão ampla faixa de funções. - As proteínas são polímeros lineares feitos de unidades monoméricas denominadas aminoácidos; - As proteínas contém uma ampla faixa de grupamentos funcionais: álcoois, tióis, tioéteres, ácidos carboxílicos, carboxamidas e vários grupamentos básicos; - As proteínas podem interagir uma com outra, e com outras macromoléculas biológicas, formando montagens complexas; - Algumas proteínas são bem rígidas, enquanto outras apresentam flexibilidade limitada. • Composição: - α - Aminoácido: É constituído de um átomo de carbono central (carbono α) ligado a 4 substituintes: Grupamento amina, uma carboxila, um átomo de hidrogênio e um grupamento R (cadeia lateral) . Os aminoácidos diferem em relação ao grupamento R. - Na maioria dos casos, o carbono α está ligado a 4 substituintes diferentes e, portanto, pode ser chamado de carbono assimétrico. Como os aminoácidos só possuem 1 carbono assimétrico, teremos 2 estereoisômeros possíveis (enantiômeros): isômero D e isômero L. - Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas. Três modelos para os as possíveis formas L e D do aminoácido alanina (a) Modelo de esferas e bastões (b) Fórmula estrutural espacial (Fórmula estereoquímica) (c) Fórmula estrutural plana (Projeção de Fischer). - As proteínas são construídas a partir de um repertório de 20 aminoácidos. Classificação dos aminoácidos: * Quanto à capacidade do homem de sintetizá-los: Essenciais (devem ser obtidos da dieta) e Não-essenciais. Fontes de aminoácidos essenciais - A quase totalidade da proteína consumida pelo homem é de origem animal e vegetal e somente pequena quantidade é proveniente das chamadas fontes não convencionais. Estas são provenientes de microorganismos como bactérias cultivadas com o uso de derivados de petróleo como fonte de carbono, leveduras provenientes da fermentação da sacarose ara produção de etanol e algumas algas. - As principais fontes de proteínas de origem animal são as carnes, o leite e ovos. - As principais fontes de proteínas de origem vegetal são: trigo, arroz, soja, milho, feijão, tremoço, lentilhas, grão de bico, ervilhas e amendoim. - Com exceção das proteínas de origem animal, as demais apresentam deficiências em um ou mais aminoácidos essenciais, ou podem apresentar problemas nutricionais por estarem acompanhadas por substâncias tóxicas ou de inibidores de enzimas proteolíticas, nesse caso estes devem ser destruídos por um tratamento prévio ao consumo. - Há também maior resistência à hidrólise proteolítica das proteínas de origem vegetal em relação àquelas de origem animal, resultando em um menor aproveitamento do alimento pela perda dos peptídeos residuais não-hidrolisados que podem conter aminoácidos essenciais em quantidades substanciais. A resistência à ação de proteases está ligada à existência de glicoproteínas, cuja estereoquímica não permitiria aproximação da molécula de enzima. - As fontes não-convencionais dificultam a assimilação ou por sua estrutura ou por estarem acompanhadas de elementos aparentemente tóxicos quando ingeridos em quantidades elevadas como os ácidos nucléicos das leveduras e os pigmentos em algas. * Quanto ao tipo de cadeia lateral (Grupo R): Apolares, Aromáticos, Polares não- carregados, Polares carregados positivamente e Polares carregados negativamente. Estas cadeias variam em tamanho, forma, carga, capacidade de formação de pontes de hidrogênio e reatividade química. OBS: - Em adição aos 20 aminoácidos que são comuns em todas as proteínas, outros aminoácidos têm sido encontrados como componentes de apenas alguns tipos de proteínas. Cada um deles é derivado de algum dos 20 aminoácidos primários, através de uma reação de modificação que ocorre depois que o aminoácido primário foi inserido na cadeia de uma proteína. Ex.: Prolina � 4-Hidroxiprolina – Encontrado em proteínas da parede celular de vegetais e também no colágeno, uma proteína fibrosa do tecido conjuntivo. Lisina � 5-Hidroxilisina – Encontrado no colágeno. N-Metilisina – Encontrado na miosina, uma proteína muscular. - Aproximadamente 300 aminoácidos adicionais foram encontrados nas células e têm uma grande variedade de funções, mas eles nunca aparecem em proteínas. Ex.: Arginina � Citrulina – Biossíntese de NO Glutamato � N-Acetilglutamato Ornitina Biossíntese de NO: Biossíntese da Ornitina: Conceitos importantes a serem lembrados: * Par Ácido – Base conjugada: * pH: * pKa: É uma medida da tendência da molécula/íon de doar prótons, com esta tendência decrescendo 10 X quando o pKa aumenta de uma unidade. * Equação de Henderson-Hasselbach: � pH = pKa quando [A-] = [HA] * Efeito tampão: Um par ácido-base conjugado (ácido acético – acetato) tem uma importante propriedade: resiste a alterações no pH de uma solução. Em outras palavras, age como um tampão. ÁCIDO = DOADOR DE H+ BASE CONJUGADA = ACEPTOR DE H+ * Titulação de um ácido fraco: Ácido acético Um gráfico da influência da quantidade de base adicionada a uma solução de ácido ou vice-versa é chamado curva de titulação. Na curva, pode-se observar um ponto de inflexão no pH que corresponde ao pKa do ácido fraco que está sendo titulado. Na vizinhança deste pH, uma quantidade relativamente grande de hidroxila produz pouca alteração no pH. Isso ocorre pois neste pH temos a presença do tampão (par ácido – base conjugada = ácido acético – acetato) que impede grandes variações no pH. - Quando um aminoácido cristalino é dissolvido em água, ele existe em solução como um íon dipolar (zwitterion). Na forma dipolar, a amina é protonada (-NH3+) e a carboxila é desprotonada (-COO-). Como tal, o aminoácido pode agir com ácido ou base. As substâncias que exibem esta dupla natureza são ditas anfóteras e frequentemente chamadas de anfólitos, contração de eletrólitos anfóteros. - O estado de ionização de um aminoácido varia com o pH. O estado de ionização de um aminoácido varia com o pH, como mostra a figura abaixo. Em pH ácido, a amina está protonada (-NH3+) e a carboxila sem dissociação (-COOH). A medida que o pH é elevado, o ácido carboxílicoé o primeiro grupamento a perder um próton. A forma dipolar persiste até o pH atingir valores maiores (pH básico), quando a amina protonada perde um próton. ÍON DIPOLAR = ZWITTERION AMINOÁCIDO CRISTALINO - 7 dos 20 aminoácidos têm cadeias laterais facilmente ionizáveis. Estes 7 são capazes de doar ou aceitar prótons para facilitar reações, assim como para formar ligações iônicas. - Em um valor de pH correspondente ao pKa do grupo ionizável, teremos o início da ionização que segue até o estabelecimento de um equilíbrio entre o ácido e a base conjugada (1:1). - Titulação de aminoácidos: Usualmente constrói-se a curva de titulação a partir da adição de base à forma protonada do aminoácido (solução ácida contendo o aminoácido). Os perfis das curvas são diferentes de acordo com a presença ou ausência de grupo ionizável e também de acordo com o tipo de cadeia lateral presente. - pH ácido: Forma protonada - pH básico: Forma ionizada - pK1 = pka da COOH pH = pK1 = Ionização COOH Forma protonada e Íon dipolar (1:1) - pK2 = pka da NH3+ pH = pK2 = Ionização NH3+ Íon dipolar e Forma ionizada (1:1) - 2 regiões com poder tamponante = pK1 e pK2 - pI = Ponto isoelétrico pH = pI = Término da ionização COOH e Início da ionização NH3+ Íon dipolar pI = (pK1 + pK2 )/2 � neutro - Carga do aminoácido: * Aminoácidos contendo grupo R não-ionizável: Glicina pH < pI = Carga elétrica líquida positiva � Eletrodo negativo (catodo) pH > pI = Carga elétrica líquida negativa � Eletrodo positivo (anodo) FORMA PROTONADA ÍON DIPOLAR FORMA IONIZADA * Aminoácidos contendo grupo R ionizável: Possuem curvas de titulação mais complexas, exibindo 3 estágios correspondentes aos 3 passos de ionizações possíveis (pK1, pK2 e pKR ). Os pontos isoelétricos dos aminoácidos desta classe refletem o tipo de grupo R ionizável presente. Grupo R carregado positivamente (NH3+): pI = (pK2 + pKR)/2 � básico pKR = pK3 Grupo R carregado negativamente (COO-): pI = (pK1 + pKR)/2 � ácido pKR = pK2 Esquemas simplificados das etapas de ionização/curvas de titulação: • Estruturas de Proteínas: - Primária: É a seqüência de aminoácidos de uma dada cadeia peptídica. Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas (ligações amida). A ligação peptídica ocorre entre a carboxila αααα de um aminoácido e a amina αααα de outro. A formação de um dipeptídeo a partir de 2 aminoácidos é acompanhada pela perda de uma molécula de água. * Cada aminoácido em um peptídeo é chamado de resíduo de aminoácido. * Por convenção, a extremidade amínica é considerada como sendo o início de uma cadeia peptídica, e assim a seqüência de aminoácidos em uma cadeia é escrita começando pelo resíduo amino-terminal e terminando no resíduo carboxi-terminal. * Uma cadeia peptídica é constituída de uma parte que se repete regularmente, chamada de cadeia principal e uma parte variável que corresponde às distintas cadeias laterais. A cadeia principal é rica em potencial de formação de pontes de H. Cada unidade contém um grupamento carbonila, que é um bom aceptor de ponte de H e um grupamento NH, que é um bom doador para esta ponte. * A maioria das cadeias peptídicas naturais contém entre 50 e 2000 resíduos de aminoácidos, e são comumente referidas como proteínas. Cadeias com um número menor de resíduos de aminoácidos são chamadas de oligopeptídeos, ou simplesmente peptídeos. * As cadeias peptídicas são flexíveis, mas com restrições de conformação. A ligação peptídica tem um considerável caráter de dupla ligação, o que impede a rotação em torno dela, tornando-a rígida e plana. Deste modo, para um par de aminoácidos unidos por ligação peptídica, 6 átomos situam-se no mesmo plano: o Carbono αααα e o grupamento CO do primeiro aminoácido e o grupamento NH e o Carbono αααα do segundo aminoácido. * Duas configurações são possíveis para uma ligação peptídica plana. Na trans, os 2 carbonos αααα estão em lados opostos da ligação peptídica. Na cis, estes grupamentos estão do mesmo lado da ligação. Quase todas as ligações peptídicas nas proteínas são trans, devido ao menor impedimento estérico. * Ao contrário das ligações peptídicas, as ligações entre a amina e o carbono αααα e entre este e a carbonila são ligações simples. Assim, há uma liberdade de rotação em torno das ligações peptídicas, permitindo que as proteínas se enovelem. - Secundária: Se refere ao arranjo espacial de resíduos de aminoácidos que estejam perto um do outro na seqüência. É estabilizada por pontes de H entre os grupos NH e CO da cadeia principal de aminoácidos próximos na cadeia peptídica. É formada pelo dobramento de cadeias peptídicas em estruturas regulares tais como a alfa hélice e a folha beta-pregueada conforme figura abaixo: * Alfa hélice: Nesse caso, a cadeia peptídica se retorce, formando um bastão firmemente acomodado. Um arcabouço principal firmemente espiralado forma a parte interna do bastão, e as cadeias laterais se projetam para fora em uma disposição helicoidal. A alfa hélice é estabilizada por pontes de H entre os grupamentos NH e CO da cadeia principal. O sentido de giro de uma hélice pode ser para direita ou esquerda, sendo mais comum para direita devido ao menor impedimento estérico entre as cadeias laterais e a principal. O CO DE CADA AMINOÁCIDO FORMA PONTE DE H COM O NH A 4 MONÔMEROS ADIANTE NA CADEIA PEPTÍDICA. * Folha beta-pregueada: Nesse caso, a cadeia é quase totalmente distendida. Dois ou mais filamentos peptídicos são unidos por pontes de H formando folhas beta- pregueada. As cadeias laterais de aminoácidos adjacentes apontam para sentidos opostos. Filamentos peptídicos adjacentes podem se estender em sentidos opostos (antiparalela) ou no mesmo sentido (paralela). Na folha antiparalela, pontes de H entre grupamentos NH e CO conectam cada aminoácidos a um só aminoácido em um filamento adjacente. Na folha paralela, pontes de H conectam cada aminoácido em uma fita com dois diferentes aminoácidos no filamento adjacente. Muitos filamentos, tipicamente 4 ou 5 mas até 10 ou mais, podem se reunir em folha beta- pregueada. Tais folhas podem ser puramente paralelas, antiparalelas ou mistas. FOLHA BETA-PREGUEADA ANTIPARALELA FOLHA BETA-PREGUEADA PARALELA - Terciária: Se refere ao arranjo espacial de resíduos de aminoácidos que estão bem longe na seqüência. É a estrutura compacta e assimétrica assumida por uma cadeia peptídica, sendo também chamada de estrutura tridimensional ou conformação da proteína. É estabilizada por ligações entre os grupos R de aminoácidos que estão distantes na cadeia peptídica. Um ou mais tipos de ligação podem estar presentes na estrutura da proteína dependendo dos aminoácidos presentes. Tipos de ligações entre os Rs: - Ponte dissulfeto (entre Rs que contenham S); - Ponte salina ou ligação iônica (entre Rs carregados contrariamente); - Interação hidrofóbica ou ligação de Van der Walls (entre Rs hidrofóbicos); - Ponte de H (entre Rs polares não-carregados).* As Pontes dissulfeto são formadas pela oxidação de um par de resíduos de cisteína. A unidade resultante de cisteínas ligadas é chamada de cistina. Proteínas extracelulares freqüentemente têm várias pontes dissulfeto, enquanto geralmente as intracelulares não a contém. * Em um meio aquoso, o enovelamento das proteínas é impulsionado pela forte tendência dos aminoácidos hidrófobos de serem excluídos da água. A cadeia peptídica, portanto se enovela, de modo que suas cadeias laterais hidrófobas fiquem imersas e que suas cadeias polares com carga elétrica fiquem na superfície. Isto ocorre pois um sistema é termodinamicamente mais estável quando os grupamentos hidrófobos são aglomerados do que quando projetados para o meio aquoso. * O destino da cadeia principal que acompanha as cadeias laterais hidrófobas é também importante. Um NH ou CO peptídico não pareado prefere a água do que um meio apolar. O segredo para imergir um segmento de cadeia principal em um ambiente hidrófobo é parear todos os seus grupamentos NH e CO por pontes de H. Este pareamento é bem conseguido em uma alfa hélice ou folha beta-pregueada. * Interações de van der Waals entre cadeias laterais hidrocarbonadas, firmemente acondicionadas, dos aminoácidos hidrófobos também contribuem para a estabilidade das proteínas. AMINOÁCIDOS HIDRÓFOBOS = AMARELO; AMINOÁCIDOS COM CARGA = AZUL; OUTROS = BRANCO (A) VISÃO EXTERNA DE UMA PROTEÍNA ENOVELADA EM MEIO AQUOSO (B) CORTE TRANSVERSAL * A estrutura terciária pode conter somente um tipo de estrutura secundária ou os dois tipos. PROTEÍNA CONTENDO FOLHAS BETA-PREGUEADAS PROTEÍNA CONTENDO ALFA HÉLICES E ALFA-HÉLICES * Algumas proteínas que existem em um ambiente hidrófobo, em membranas, apresentam uma distribuição inversa de aminoácidos: os hidrófobos estão na superfície, para interagir com o meio, enquanto os hidrófilos são protegidos do ambiente no interior da proteína. AQUAPORINA (CANAL DE ÁGUA) - Quaternária: Proteínas constituídas de mais de uma cadeia peptídica exibem um quarto nível de organização estrutural. Para estas proteínas, a sua conformação final é a estrutura quaternária. Cada cadeia peptídica em tal proteína é chamada de uma subunidade. A estrutura quaternária se refere ao arranjo espacial de subunidades e à natureza de suas interações. Na maioria dos casos, as subunidades são mantidas juntas por interações não covalentes. O tipo mais simples de estrutura quaternária é um dímero, constituído de duas subunidades idênticas. Estruturas quaternárias mais complicadas também são comuns. Mais de um tipo de subunidade pode estar presente. TETRÂMERO α2β2 DA HEMOGLOBINA HUMANA Resumo das estruturas possíveis (níveis de organização estrutural) em uma proteína: A seqüência de aminoácidos determina completamente a estrutura tridimensional, e daí todas as outras propriedades de uma proteína. A seqüência de aminoácidos, por sua vez, é determinada pela seqüência da molécula de DNA. Proteínas globulares X Fibrosas A conformação final das proteínas se refere à estrutura terciária, caso a proteína seja formada por apenas uma cadeia peptídica, ou à estrutura quaternária, caso a proteína possua mais de uma cadeia peptídica. Em função do aspecto ou formato de sua conformação, as proteínas podem ser classificadas em globulares ou fibrosas. Proteínas Fibrosas: • Apresentam propriedades que conferem resistência mecânica, flexibilidade e suporte às estruturas nas quais são encontradas; • Possuem cadeias polipeptídicas arranjadas em feixes; • Geralmente possuem um único tipo de estrutura secundária; • São insolúveis em água � Alta ocorrência de aminoácidos hidrofóbicos tanto na parte externa qto interna da ptn. Ex.: Queratina (sua molécula é composta por duas cadeias em alfa-hélice; várias moléculas se unem para formar a fibra de queratina), colágeno (sua molécula é composta por três cadeias em alfa-hélice; várias moléculas se unem para formar a fibra colágena), Fibroína (sua molécula é formada por uma cadeia em folha beta). Proteínas Globulares: • Funções: enzimas, ptns transportadoras, motoras e regulatórias; • Apresentam formas esféricas ou globulares; • Parte externa: Aminoácidos hidrofílicos; • Parte interna: Aminoácidos hidrofóbicos; • Geralmente possuem mais de um tipo de estrutura secundária � Alfa-hélice + Folha beta-pregueada. • Desnaturação (Desenovelamento): - É uma mudança da estrutura tridimensional original da proteína, sem alteração da seqüência de aminoácidos, isto é, da estrutura primária da proteína. A extensão desta mudança não é sempre bem definida. - Para muitas proteínas, uma comparação do grau de desnaturação à medida que aumenta a concentração de desnaturante revelou uma transição relativamente abrupta da forma enovelada (original) para a desenovelada (desnaturada) sugerindo que apenas estes dois estados de conformação estão presentes em algum grau significativo. PROTEÍNA ENOVELADA PROTEÍNA DESNATURADA - O enovelamento específico de uma proteína é resultado de um grande número de interações que têm natureza cooperativa. Se uma proteína for colocada em condições sob as quais alguma parte da estrutura protéica seja termodinamicamente instável, haverá desenovelamento desta parte da estrutura e com isso as interações entre ela e o restante da proteína serão perdidas. A perda destas interações, por sua vez, desestabilizará o restante da estrutura. Assim, é provável que as condições que levam à perturbação de qualquer parte da estrutura de uma proteína desmontem completamente a proteína. - As conseqüências do enovelamento cooperativo podem ser ilustradas considerando-se os conteúdos de uma solução de proteína em condições correspondentes ao meio da transição entre as formas enovelada e desnaturada. A solução não conterá proteínas meio-desnaturadas, mas uma mistura 1:1 de proteínas enoveladas e desnaturadas. - A desnaturação pode ser causada por uma série de agentes físicos e químicos. O grau de mudanças que cada um destes agentes pode causar na estrutura enovelada da proteína pode ser diferente para diferentes proteínas. Agentes desnaturantes: * Calor: Promove a destruição das pontes de H e interações hidrofóbicas que estabilizam a estrutura tridimensional da proteína. Em geral, há coagulação da proteína. * Solução concentrada de Uréia: Possui analogia estrutural com a ligação peptídica. Assim, pode formar pontes de H com cadeias laterais e/ou ligações peptídicas presentes na proteína levando a uma desestabilização das pontes de H intramoleculares com conseqüente desenovelamento da proteína. * Solventes Orgânicos (álcool, acetona): Sua ação depende da sua polaridade e portanto da sua capacidade de interagir com cadeias laterais da proteína por meio de pontes de H ou promovendo a ruptura de ligações hidrofóbicas. O efeito desnaturante pode ser diminuído utilizando-se baixas temperaturas. * Ácidos e Bases fortes: O tratamento com tais substâncias leva a alteração da carga líquida da proteína. Em valores extremos de pH extremos, o excesso de cargas positivas ou negativas leva a repulsões que provocam uma desestabilização da estrutura enovelada da proteína. - A desnaturação pode ser caracterizada, qualquer que seja o agente utilizado, por alterações de determinadas propriedades dessa macromolécula: Diminuição da solubilidade (precipitação, floculação, coagulação), modificaçãoda viscosidade da solução, aumento da reatividade química das cadeias laterais, perda da atividade biológica no caso de enzimas ou hormônios, modificação da mobilidade eletroforética. - A desnaturação pode ser ou não um processo reversível; tudo vai depender do grau de alteração que ocorreu na estrutura da proteína. No caso de um processo reversível, a proteína renatura quando colocada em condições em que a sua forma enovelada for estável. • Caracterização de Proteínas: - Reações de coloração: São importantes tanto na detecção quanto na dosagem de aminoácidos e proteínas. * Ninhidrina: Os grupos α amino de aminoácidos, peptídeos e proteínas reagem com a Ninhidrina formando um complexo de cor púrpura, quando a solução é aquecida. A intensidade da cor é proporcional à concentração de aminoácidos, sendo a técnica utilizada para determinação quantitativa dos mesmos. Os iminoácidos (prolina e hidroxiprolina) formam complexo amarelo. + COMPLEXO PÚRPURA AMINOÁCIDO NINHIDRINA * Biureto: A reação com o Biureto ocorre devido a presença de pelo menos duas ligações peptídicas, dando positivo para peptídeos com mais de 2 aminoácidos e proteínas e negativo para aminoácidos. Ocorre a formação de um complexo de coordenação com o cobre de cor púrpura, em meio alcalino. A intensidade da cor é proporcional à concentração de proteínas, sendo a técnica utilizada para determinação quantitativa das mesmas. Reagente de Biureto: Água, Sulfato de cobre pentaidratado, Tartarato duplo de sódio e potássio, Hidróxido de sódio. OH- PROTEÍNA + Cu2+ � COMPLEXO Cu2+ - PROTEÍNA - Reações de precipitação: * Ânions de ácidos complexos: Observa-se a formação de um sal insolúvel onde a proteína atua como cátion. Em geral, o ânion é proveniente dos ácidos tricloroacético, tânico ou fosfotúngstico. Essas precipitações são feitas em meio ácido em relação ao pI da proteína. Ex.: Ácido Tricloroacético + ptn = Tricloroacetato de proteína. * Cátions de metais pesados: Observa-se a formação de um sal insolúvel onde a proteína atua como ânion. Os cátions metálicos utilizados podem ser Ag+, Zn2+, Hg2+ ou Cu2+. Essas precipitações são feitas em meio básico em relação ao pI da proteína. Ex.: Acetato de Chumbo + ptn = Proteinato de chumbo • Purificação de Proteínas: As proteínas podem ser purificadas de acordo com diferentes propriedades: Solubilidade, Tamanho, Carga e Afinidade de ligação. Em geral, as misturas de proteínas são sujeitas a uma série de separações, cada uma baseada em uma propriedade diferente, até chegar a uma proteína pura. - As etapas iniciais visam diminuir a solubilidade da proteína desejada com o intuito de precipitá-la. Técnicas empregadas: * Precipitação isoelétrica: Em valores de pH afastados do pI, a solubilidade da proteína é maior, devido ao aumento da sua carga líquida, o que favorece a repulsão entre as moléculas de proteína e possibilita a formação de uma maior camada de solvatação. No pI, como a carga líquida é zero, a força de repulsão entre as moléculas e a camada de solvatação são menores, o que favorece a agregação e floculação das moléculas. (Adição de solução ácida diluída gota-a-gota) * Salting out: Este nome é dado ao fenômeno de diminuição da solubilidade de proteínas em altas concentrações de sal. À medida que a concentração iônica aumenta, há um decréscimo na atividade de água, o que diminui as interações entre a água e os grupos polares das proteínas, favorecendo uma maior interação entre as moléculas protéicas, tornando-as mais suscetíveis à aglomeração. Como resultados tem-se a precipitação da proteína. A concentração de sal em que uma proteína precipita difere de uma proteína para outra. Assim, o salting out pode ser usado para purificar proteínas. O Sulfato de amônio é o sal mais usado devido à sua alta solubilidade e água. * Solventes Orgânicos (em baixas temperaturas): A adição de tais solventes a uma solução aquosa de proteína diminui sua solubilidade levando a precipitação da proteína. Isto se deve ao abaixamento da constante dielétrica da solução. Esta constante mede a polaridade do solvente, ou seja, a sua capacidade de entrar entre 2 íons de cargas opostas e separá-los, solvatando-os. (água – 80; etanol – 24) - Posteriormente utilizam-se técnicas mais poderosas e discriminativas que separam de acordo com tamanho, carga e afinidade. Estas técnicas são variações da Cromatografia em coluna. * A separação se baseia nas diferentes afinidades que os solutos de uma mistura tem pela fase estacionária (material sólido que preenche a coluna e que será permeado pela fase móvel) e pela fase móvel (solvente que carreia os solutos). * Quanto menor a afinidade entre certo soluto e a fase estacionária, menor o tempo de retenção deste soluto e mais rápido este eluirá da coluna. Cromatografia de Troca Iônica * A separação é baseada na carga líquida da proteína. * Fase estacionária: Resina catiônica (trocadora de ânions) ou aniônica (trocadora de cátions). Ex.: Resina aniônica: Proteínas com carga positiva terão maior afinidade pela fase estacionária e terão maior tempo de retenção, enquanto as proteínas com carga negativa eluirão mais rapidamente. Cromatografia de Filtração em Gel ou Exclusão Molecular * A separação é baseada no tamanho da proteína. * Fase estacionária: Grãos porosos muito hidratados (Gel). * Moléculas pequenas podem entrar nos grãos, mas as grandes não conseguem penetrar através do poro. As moléculas grandes eluirão primeiro pois tem um menor volume a ser percorrido. Cromatografia de Afinidade * A separação é baseada alta afinidade da proteína desejada por grupamentos químicos específicos (ligante). * Fase estacionária: Material sólido unido por ligação covalente ao ligante. * As proteínas indesejadas eluem e a desejada fica retida na coluna. Sua eluição se dá através da adição de uma solução de ligantes na coluna. • Análise de Proteínas: Eletroforese em Gel de Poliacrilamida * A separação é baseada na migração diferencial de proteínas carregadas devido a aplicação de um campo elétrico. * A migração de uma proteína em um gel durante a eletroforese é uma função da sua carga, tamanho e forma. * É um método mais analítico pois pequenas quantidades de amostra são aplicadas.
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