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PCR Reação em Cadeia da Polimerase Docente: Dyego Miranda Como acontece a replicação nos seres vivos? Dentro da célula DNA DNA Polimerease + dNTP’s, enzimas, energia... A ideia! Kary Mullis - 1983 Recriar o processo de replicação in vitro Publicou em 1985 Ganhou o Prêmio Nobel da Química em 1993 Polymerase Chain Reaction (PCR) Como funciona? Após a extração do DNA, todo o genoma (todos os genes) foi extraído (incluindo DNA mitocondrial); Nosso objetivo será, por exemplo, estudar apenas 1 gene. Como funciona? DNA (todos os genes) Tampão de reação (pH) dNTP’s (Nucleotídeos A C T G) Polimerase (Taq Polimerase) MgCl2 (íon usado pela Taq) Primers Como funciona? in vivo A enzima helicase rompe as pontes de hidrogênio DNA polimerase promove a replicação do DNA in vitro A calor rompe as pontes de hidrogênio Taq polimerase promove a replicação do DNA Vários ciclos de aumento e diminuição de temperatura, promove a replicação do DNA (amplificação) Desnaturação Anelamento Extensão A reação Termociclador Definição PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular. Vantagens da principal ferramenta em estudos com Biologia Molecular Quantidades mínimas necessárias para o procedimento; Obtenção de uma grande quantidade de produto; Amostra nem sempre puras; Capacidade de amplificar uma única moléculoa de DNA ou RNA; Ferramenta importante para Biotecnologia; Baixo custo. Componentes TaqPolimerase: Possui capacidade de resistir a altas temperaturas sem perder sua função MgCl2: A Taq funciona apenas na presença desse íon, pois o mesmo se liga a Taq para ativá-la Tampão de reação: Ajuda a manter o pH constante para a atividade da Taq dNTPs: Nucleotídeos livres que serão incorporados pela TaqPolimerase durante o processo de replicação da sequência-alvo Primers: Pequenas sequências de DNA, que se paream especificamente a sequência-alvo de interesse para a análise DNA: Vai conter a sequência-alvo de interesse, que servirá de molde para o pareamento específico dos primers. H2O ultra-pura: Serve para diluir a mistura Componentes Todos os componentes da reação obedecem uma concentração ótima para uma reação eficiente; Alguns erros podem ocorrer, prejudicando a reação; Taq Polimerase não estocada em temperaturas baixas; Erro de pipetagem; Contaminação por DNA externo; Temperaturas de ciclagem errada; Primers não-específicos PCR em tempo real (qRT-PCR) Real-time PCR Quantifica as amostras ao mesmo tempo que amplifica o DNA em cada ciclo RT-PCR: Transcriptase Reversa RT-PCR: Reverse Transcription PCR Quando nós precisamos analisar a expressão de um gene, utilizamos a PCR de transcrição reversa cDNA Gene Transcrição Transcrição Reversa RT-PCR PCR Amplificação In vivo In vitro Aplicações Identificação humana (Ciências Forenses); Identificação de espécies; Determinação de mutações; Estudos evolutivos (paleontologia, estudo de populações, hereditariedade, história, etc.); Biotecnologia (clonagem, transgênicos, etc.); Diagnóstico de doenças por patógenos; Susceptibilidade genética; ...
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