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Sorologia II

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DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA 
VETERINÁRIA
DEPARTAMENTO DE MED. VET. PREVENTIVA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Regente: Prof. Dr. Telmo Vidor
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Reação de Hemaglutinação
(HA)
ANTIGENO
HEMAGLUTINANTE
HEMACEAS LAVADAS A 1%
HEMAGLUTINAÇÃO
H.A.
+
IMUNO - TV
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Reação de hemaglutinação:
titulação do antígeno
diluição: log. 2
IMUNO - TV
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Reação de Inibição 
da Hemaglutinação (IHA)
ANTICORPOS
ANTIGENO
NEUTRALIZAÇÃO
HEMÁCEAS (1%)
SEDIMENTAÇÃO
I.H.A.
1a Fase
2a Fase
+
+
IMUNO - TV
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Reação de inibição da
hemaglutinação (IHA)
1:2
1;4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1;512
1:1024
1:2048
1:4096
IMUNO - TV
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Reação ag. X ac.: 
Imunofluorescência direta
+
SERVE PARA 
 IDENTIFICAR ANTÍGENOS
MATERIAL DE CAMPO
IMUNO - TV
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Vírus da PSC 
Amostra vacinal 
CPA
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Imunofluorescência direta :
diagnóstico de raiva
CVS
CVS
M C
M C
CVS (10%)
+
CONJUGADO
CN (10%)
+
CONJUGADO
1
2
3
4
RESULTADO :
1 e 3 = Sempre
	 Negativo
2 = Sempre
	 Positivo
 4 : 
Se 4=1 negativo;
Se 4=2 posito
IMUNO - TV
*
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Imunofluorescência indireta : 
identificação do antígeno
+
+
ANTIGENO
DESCONHECIDO
1a FASE
2a FASE
ANTICORPO
CONHECIDO
(ESPECIE)
-coelho-
NEGATIVO
POSITIVO
COM PLEXO
Ag + Ac
CONJUGADO
ANTIESPÉCIE
-Anticoelho-
MAT. CAMPO
OU
OU
IMUNO - TV
*
*
*
Imunofluorescência indireta : 
titulagem de anticorpos
+
+
ANTIGENO
CONHECIDO
1a FASE
2a FASE
ANTICORPO
DA ESPÉCIE
PESQUISADA
NEGATIVO
POSITIVO
COM PLEXO
Ag + Ac
CONJUGADO
ANTIESPÉCIE
OU
OU
IMUNO - TV
*
*
*
Fixação de complemento : 
negativo
+
+
Ag
Ac
NÃO HÁ REAÇÃO
SISTEMA
HEMOLÍTICO
NÃO HÁ CONSUMO
DE COMPLEMENTO
O "C" NAO FIXADO, SE FIXA 
NAS HEMÁCEAS DO S.H.
PRODUZINDO HE MÓLISE:
RESULTADO NEGATIVO
1a FASE
2a FASE
3a FASE
Adicionar
IMUNO - TV
COMPLEMENTO
*
*
*
Fixação do complemento : 
positivo
COMPLEXO Ag+Ac CON-
SOME COMPLEMENTO
Ag
COMPLEXO Ag+Ac
COMPLEMENTO
S.H. (sistema hemolítico)
HEMACEAS ADSORVIDAS DE Ac
+
+
Ac ESPECÍFICOS
NÃO SOBRA COMPLEMENTO 
E O S.H. NÃO É HEMOLISADO
REAÇÃO POSITIVA
1a FASE
2a FASE
Adicionar
3a FASE
IMUNO - TV
*
*
*
Fixação de complemento : 
teste
"A"
"O"
"C"
SOROS ANTI :
HEMÓLISE
AUSÊNCIA
DE 
HEMÓLISE
Mat. Campo + “C” + S.H.
Mat. Campo + “C” + S.H.
Mat. Campo + “C” + S.H.
HEMÓLISE
IMUNO - TV
Soros
*
*
*
Reação de
soroneutralização 
VIRUS
ANTICORPOS
PRESENÇA DO
EFEITO DO VIRUS:
NEGATIVO
AUSÊNCIA DO
EFEITO DO VIRUS:
POSITIVO
+
SISTEMA INDICADOR 
DO VIRUS
1
2
 NEGATIVO
 POSITIVO
IMUNO - TV
*
*
*
Ensaio imunoenzimático
-- E L I S A --
2. Lavagem
Cromógeno
Porção da Enzima
(peroxidase)
Ligante
(anti IgG)
IMUNO - TV
1. Sensibilização da Placa
 com antígeno
8. Desenvolvimento da cor
7. Adição do Cromógeno
6. Lavagem
5. Adição do Ligante
4. Lavagem
3. Adição do Ac. de Teste
*
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*
Elisa sanduíche
ELISA SANDUÍCHE PARA DETEÇÃO DE AG (ou de captura)
ELISA DUPLO SANDUÍCHE PARA DETEÇÃO DE AG
Ac específico
Ag da amostra
Ac específico marcado
Ac específico preso ao suporte
Substrato
*
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Elisa competitivo
ELISA COMPETITIVO PARA DETECÇÃO DE AC
Ag preso 
ao suporte
Ac da amostra testada
Ac específico conjugado
Substrato cromogênico
*
*
*
Elisa competitivo 
para detecção de ag
ELISA COMPETITIVO PARA DETECÇÃO DE AG
Ag preso ao suporte
Ag da amostra
Ac específico conjugado
Ac específico
Ag da amostra
Ag conjugado
Substrato
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Elisa de captura
para detecção de Ac
AC monoclonal 
anti-IgM
IgM da amostra
Monoclonal Anti-IgM marcada com enzima
Substrato
Ag preso ao suporte
Ac da amostra
Ag marcado
*
*
*
Sem texto
	Diversos antígenos se caracterizam por terem a propriedade de aglutinar eritrócitos, ou seja, são hemaglutinantes. 
	Os mixo e paramixovírus possuem esta propriedade por serem portadores (na superfície de seus envelopes) de projeções de hemaglutininas que se aderem à receptores da membrana dos eritrócitos. Estes receptores são mucoproteínas com resíduos de ácido N-acetilneuramínico (NANA). A hemaglutinina destes vírus são glicoproteínas ricas em fucose, galactose,mano- se e glicosamina , que favorecem a ligação com os receptores das hemáceas.
	Esta propriedade de aglutinar serve para determinar as concentrações destes antígenos. São feitas diluições seriadas de base logarítmica 2 (log2) com um diluente tipo salina tamponada. As diluições são feitas em microplacas com 96 cavidades, sendo que cada diluição fica numa cavidade. Inicia-se em 1:2, seguindo-se na mesma proporção. Após feita a diluição, adiciona-se uma suspensão de hemáceas lavadas a 1%. Onde houver antígeno suficiente, haverá a formação de um tapete de hemáceas. Quando a diluição for alta e não houver mais antígeno suficiente, as hemáceas sedimentarão formando um pequeno botão, que escorrerá ao se inclinar a placa
	Diz-se que a diluição mais alta do antígeno que hemaglutinar completamente, terá uma unidade hemaglutinante (UHA); a diluição anterior terá 2 UHA e a anterior a esta terá 4 UHA. Pois será com 4 UHA que se fará o teste de Inibição da Hemaglutinação.
	LER TEXTO DO SLIDE ANTERIOR
	Nas linhas, A,B,C...., estão diluídos os antígenos e nas colunas as respectivas diluições. Para interpretar as reações observadas, deve-se levar em conta as seguintes definições:
1. H.A. completa: reação onde não há formação de botão;
2. H.A. incompleta: reação onde se formou um botão parcial;
3. H.A. negativa: onde forma um botão que escorre ao inclinar a placa. 
Título do antígeno: é a recíproca da maior diluição, onde houve hemaglutinação completa. Assim sendo, observa-se que:
Linha A: o título do antígeno é:	64 (26)
Linha B: o título do antígeno é:	16 (24)
Linha C: o título do antígeno é:	1.024 (210)
Linha D: o título do antígeno é:	=ou>que 4096 (212)
Linha E: o título do antígeno é:	128 (27)
Linha F: o título do antígeno é:	menor que 2 (21)
Linha G: o título do antígeno é:	4 (22)
Linha H: Controle das hemáceas. Não há aglutinação pois não tem antígeno.
 
	Se tivermos um anticorpo específico contra o antígeno hemaglutinante, este será capaz de reagir com o antígeno e inibir esta capacidade de aglutinar as hemáceas. Este teste é denominado de Inibição da Hemaglutinação. O teste é realizado em duas etapas e serve para titular Ac.
	Dilui-se os soros a serem testados, seriadamente de 1:2 a 1:256 p.ex., em PBS (Phosphat Buffer Solution). Após, adiciona-se 4 UHA. do antígeno e espera-se em torno de 30 minutos (o tempo varia com o tipo de antígeno que está sendo utilizado), para que haja a reação do Ag x Ac. 
	Após esse tempo adiciona-se uma suspensão de hemáceas lavadas na concentração de 1% e espera-se que sedimentem. A sedimentação normal será observada nos controles das hemáceas, onde não se colocará o antígeno. Aí não haverá aglutinação e um botão se formará ao sedimentar.
	A interpretação dos resultados :
	Onde a sedimentação for igual aos controles, ou seja formação do botão que escorre ao inclinar a placa, não há presença de antígeno livre, logo ele foi inibido pelos anticorpos. A recíproca da diluição mais alta onde houve a inibição total, será o título do soro. Onde houver aglutinação das hemáceas, é sinal que o antígeno está livre, logo não havia anticorpos para inibi-lo. Na diluição em que isto acontecer, diz-se que é negativa. Para cada agente existe uma diluição limite. Normalmente um soro será negativo quando a diluição 1:4 for negativa.
	LER TEXTO DO SLIDE ANTERIOR
 Nas linhas estão diluídos os soros a serem testados e nas colunas as respectivas diluições. Os resultados foram os seguintes:
Linha A:	64 (26)
Linha B:	8 (23)
Linha C:	Menor que 2 (21)
Linha D:	Negativo
Linha E:	8 (23)
Linha F:	512 (29)
Linha G:	32 (25)
Linha H:	Controle das hemáceas
Paralelamente também deve ser feito o controle das 4 UHA., através de uma retrotitulagem, ou seja, o título do Ag. deve ser confirmado (obrigatoriamente 4 UHA.). Caso não haja as 4 unidades, o teste deve ser repetido, pois se as unidades estiverem abaixo, os títulos dos soros serão mais altos, caso contrário serão mais baixos.
	A Imunofluorescência direta (IFD) se baseia numa reação Ag x Ac, na qual os anticorpos são conhecidos e marcados com uma substância fluorescente (isotiocianato de fluoresceina de cor verde ou rodamina de cor vermelha). Este produto é chamado de conjugado.
	O material suspeito é colocado numa lâmina, através de uma impressão e fixado com acetona durante 10 minutos. Sobre esse material se coloca o conjugado na diluição recomendada pelo fabricante do produto e coloca-se em câmara úmida por 30 minutos para haver a reação Ag x Ac. Passado esse tempo, faz-se três lavagens com PBS, visando a retirada do excesso de conjugado, cobrindo-se o material com uma lamínula contendo PBS e glicerina a 50%. Leva-se o preparado ao microscópio de Imunofluorescência para leitura.
	Se a fluorescência for positiva, quer dizer que os Ac marcados se fixaram no Ag., sendo o resultado positivo. Se por exemplo, o conjugado for anti-leptospira, isso quer dizer que o material tinha leptospira. 
	Nos casos negativos não se observará absolutamente nada, ficando o campo totalmente escuro. 
	Este teste é usado normalmente para identificar antígenos. Tem a vantagem de ser rápido, no entanto é de custo alto, considerando que para cada agente se precisa de um conjugado específico.
	No diagnóstico da RAIVA, o teste de IFD. é um pouco modificado, considerando a necessidade de ter controles negativos e positivos. Como mostra o desenho. Numa lâmina se coloca material positivo(CVS) de cérebro de camundongo infectado com vírus, e em outra o material de campo (MC) suspeito.
 Em um tubo de ensaio se mistura o conjugado com cérebro positivo a 10%. ). O conjugado será neutralizado. Este conjugado é colocado sobre uma impressão do cérebro positivo (CVS) e sobre uma impressão do material de campo. Ao microscópio, estes materiais, tanto o de campo como o com CVS, terão que dar negativos obrigatoriamente , pois o conjugado está neutralizado. Este será o controle NEGATIVO.
 Em outro tubo de ensaio se mistura o conjugado com cérebro normal a 10%, ou seja, o conjugado ficará livre; este conjugado será colocado sobre uma impressão do cérebro positivo (CVS) e sobre uma impressão com o material de campo. Ao microscópio o material com CVS, terá que ser positivo obrigatoriamente, pois o conjugado está ativo e o material é positivo. Este será o controle POSITIVO.
 Se a impressão do material de campo com conjugado ativo for igual à impressão do CVS + conjugado ativo, o resultado será POSITIVO. Caso seja igual à impressão com conjugado neutralizado, será NEGATIVO.
	A Imunofluorescência Indireta (IFI), é realizada em duas etapas:
 O material de campo suspeito é fixado numa lâmina com acetona. Sobre ele se coloca um soro conhecido contra o agente suspeito (incubar 30 min.). Este soro é preparado geralmente em coelhos. Caso o material contenha este agente, os anticorpos específicos do soro de coelho se fixarão nele. Caso não haja tal agente, os anticorpos serão lavados pelo PBS, não ficando nenhum Ac. fixado.
 Após a lavagem com PBS. será colocado um conjugado anti-espécie, e no caso, anti-coelho (incubar em câmara úmida por 30 minutos). 
 No caso dos Ac. do soro do coelho terem se fixado na primeira fase, eles serão identificados pelo conjugado que é anti-coelho e o teste será POSITIVO.
 No caso dos Ac. do soro do coelho não terem se fixado na primeira fase, não haverá Ac de coelho e o conjugado será lavado pelo PBS e o teste será NEGATIVO. 
 Este teste é vantajoso por ser mais barato, pois se usará somente um conjugado, que é o reagente mais caro. Os soros específicos poderão ser preparados no próprio laboratório, contra os diferentes agentes etiológicos cujo diagnóstico sejam necessários.
	O teste de IFI para identificar e titular Ac., segue a mesma técnica descrita anteriomente, com uma modificação:
PRIMEIRA FASE: o antígeno é conhecido, e sobre ele se coloca um soro a ser testado de um animal suspeito ou do qual queremos titular Ac. Em ambos casos o soro deve ser diluído na diluição recomendada tecnicamente (p. ex.: para diagnóstico os Ac. deverão ser positivos na diluição de 1:10 e na titulagem para um animal vacinado a diluição deverá ser de 1:140). Incubar em câmara úmida por 30 minutos.
SEGUNDA FASE: após lavagem com PBS para retirar o soro não fixado no antígeno, coloca-se o conjugado anti-espécie (no caso, da espécie da qual se retirou o soro). Incubar por 30 minutos.
RESULTADO:
	POSTIVO: Quando houver fluorescência, pois isso indica que os Ac. do soro do animal coletado se fixaram no antígeno conhecido;
	NEGATIVO: Quando não houver fluorescência, pois isso indica que os Ac. do soro do animal coletado não se fixaram no antígeno conhecido.
 No caso de titulagem de anticorpos, o título do soro será a recíproca da maior diluição que der fluorescência brilhante, num escore de 1 a 4 (Quanto maior o escore, mais brilhante será a reação).
	Normalmente as reações Ag x Ac promovem a fixação do “C”. Em alguns casos este fato é utilizado para visualizar a reação, identificando Ag e Ac. O teste de Fixação do Complemento (FC), é realizado em três etapas:
 O material de campo é preparado e colocado em tubo de ensaio e adiciona-se a ele um soro conhecido, correspondente à suspeita. Deixa-se incubar por 15 a 30 minutos para ocorrer a reação Ag x Ac.
 Uma vez ocorrida a reação, adiciona-se complemento (soro fresco de cobaio) e deixa-se incubar por 15 min. Neste caso, como não houve a reação Ag x Ac. não haverá consumo de “C” na reação e ele fica livre.
 Passado os 15 min. coloca-se o sistema hemolítico-SH- (hemáceas de carneiro sensibilizadas com anticorpos anti-hemáceas). Ora, este sistema é ávido por complemento. Como o “C” estava livre, será consumido pelo SH., promovendo a lise das hemáceas.
	Como o complemento foi consumido pelo SH., isto indica que não houve reação Ag x Ac na primeira mistura do material de campo com o soro conhecido. O teste é negativo.
 
	
	Os procedimentos são os mesmos descritos no teste anterior, só que neste caso ocorreu o seguinte:
 Houve uma reação positiva entre o material de campo e os anticorpos do soro conhecido;
 Quando o complemento foi adicionado, foi totalmente consumido na reação. Ou seja, não sobrou nada de complemento;
 
 Quando o SH. foi adicionado não havia complemento livre e portanto não houve hemólise. Isto indica uma reação positiva, isto é, o material de campo corresponde ao soro conhecido.
	Um exemplo deste teste é a FC. para diagnóstico da Febre Aftosa para o qual adota-se o seguinte procedimento:
 Distribui-se em tubos os três soros conhecidos anti Febre Aftosa: anti A, anti O e anti C, na diluição previamente determinada para cada um;
 Adiciona-se aos soros uma porção do material de campo suspeito da doença, previamente preparado, deixando incubar 30 minutos a 37oC ;
 Adiciona-se o complemento (soro de cobaio), previamente titulado, incubando por 15 minutos;
 Após, coloca-se então o sistema hemolítico, também previamente titulado, e incuba-se por mais 15 minutos.
INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO:
	Onde houve hemólise, significa que o complemento não foi consumido na reação do soro e o material de campo, portanto NEGATIVO;
	Onde não houve hemólise, significa que o complemento foi todo consumido na reação do soro com o material de campo, portanto POSITIVO. 
NESTE CASO POSITIVO PARA AFTOSA, SOROTIPO A
	Existem vários tipos de Soroneutralização (SN). Será descrito o teste de SN para identificar anticorpos, que na maioria das doenças, título de 1:4, significa infecção em um
dado momento na vida do animal.
	Em placas de cultivo celular de 96 cavidades, dilui-se o soro coletado dos animais nas diluições de 1:2 e 1:4, usando o meio de cultivo de crescimento celular;
	Adiciona-se aos soros diluídos, igual volume de vírus conhecido, na dose de 100 DI50% (esta dose é um padrão internacional recomendado). Mistura-se bem e incuba-se por 1 hora a 37oC para que a reação Ag x Ac aconteça.. 
 	Semear então as células em todas as cavidades onde houver a mistura soro e vírus. As células a serem utilizadas, deverão ter boa sensibilidade ao vírus do teste, pois elas detectarão o vírus ativo. As placas serão incubadas a 37oC por 3-5 dias, quando então se fará a leitura das placas, para observar a presença / ausência de Efeito Citopático (ECP) do vírus.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
	A presença de ECP., significa que o vírus ficou livre, portanto não havia Ac. específicos no soro testado; o animal está negativo para a doença.
	A ausência de ECP., significa que o vírus foi neutralizado, portanto havia Ac. específicos no soro do animal testado; o animal está positivo para a doença.
	O teste de ELISA se baseia na identificação da reação do Ag xAc. através de um ligante ao anticorpo que possui na extremidade oposta uma enzima que muda de cor com a intensidade da reação. Geralmente o ligante é uma anti-IgG marcada com peroxidase. A prova pode ser direta, indireta ou sanduíche.
	A placa de ELISA é sensibilizada com um antígeno conhecido, de modo que o Ag fica aderido ao fundo da placa. Faz-se após uma lavagem;
	Adiciona-se o soro teste na diluição recomendada (diagnóstico ou vacinação) e se faz outra lavagem para retirada do excesso do soro;
 	Adiciona-se o conjugado que se ligará ou não ao anticorpo e se faz nova lavagem para retirar o conjugado que não se ligou;
 	Por último se coloca o cromógeno (substrato) que na presença da peroxidase desenvolverá cor. Quanto maior a quantidade de Ac. fixado no Ag, maior será a intensidade da cor.
	INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
 	Se houver desenvolvimento de cor, significa que o Ac. do soro teste estava presente e o conjugado se fixou a ele; soro positivo.
 	Se não houver desenvolvimento de cor, significa que não havia Ac no soro teste e o conjugado não se fixou; soro negativo.
Sem texto
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