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MARCADORES MOLECULARES MARCADORES GENÉTICOS • A tecnologia molecular suplementou e ampliou as técnicas aplicadas à biologia molecular. • “Sondas Moleculares”: » Detectar locais com variação neutra no DNA; » Variação fenotípica não detectável; » Diferenças em pares únicos de bases ou números de repetições de segmentos específicos; • “Polimorfismos Moleculares” – Cromossomo Homólogo com duas variantes no mesmo local: » a1 – variante no sítio neutro; » a2 – variante heterozigota; • Qualquer característica morfológica ou molecular que diferencia indivíduos, e que seja facilmente detectável é um potencial marcador genético. • “Marcadores genéticos se segregam e se recombinam como todos os outros genes” “Todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA (correspondentemente a regiões expressas ou não do genoma)”. A sequência de nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou não ser conhecidos e em geral são desconhecidos. Marcadores Genéticos: Características Desejáveis •Alto polimorfismo; •reprodutibilidade; •codominante; •amplamente distribuído através do genoma; •discriminação; • ausência de influências ambientais; •barato; •fácil de mensurar. Marcadores “dominantes” Marcadores “codominantes” MARCADORES MORFOLÓGICOS • É um fenótipo de fácil identificação, normalmente determinado por um único alelo. • Características fenotípicas de variação discreta são utilizadas como marcadores morfológicos desde os tempos de Mendel, como fenótipos de fácil identificação visual, tais como: • nanismo; • deficiência clorofítica; • cor de pétala; • morfologia foliar; • cor da semente. Marcadores bioquímicos (moleculares) • Baseado na propriedade de migração das proteínas,as quais podem ser separadas por eletroforese; • Vantagens: – Requer equipamento relativamente simples; • Desvantagens: – Sujeito a influências ambientais; – Limitado em número. Marcadores de DNA (moleculares) • Polimorfismo detectado na seqüência de DNA • Vantagens: •Não é objeto de influências ambientais; •Potencialmente ilimitado em número; • Maior desvantagem é a necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos. Principais Marcadores Moleculares Polimorfismo de DNA Grupos Marcadores baseados em hibridização com uso de enzima de restrição Marcadores baseados em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) Marcadores baseados em hibridização + PCR Marcadores baseados em PCR + enzima de restrição Marcadores baseados em PCR + sequenciamento Marcadores baseados em sequenciamento Marcadores baseados em hibridação de seqüências de DNA RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) • Significa polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição. • São obtidos através de cortes na fita dupla de DNA. • Evidenciados por fragmentação com o uso de enzimas de restrição. • Hibridizados com sondas de DNA marcadas com material radioativo ou fluorocromos. • É necessário que os indivíduos comparados sejam completamente distintos. O que é uma sonda? É um fragmento de DNA marcado (32P, 35S ou biotina), utilizado para detectar moléculas de ácido nucléico com seqüências complementares, por meio de hibridização. O que é hibridização? Pareamento de fitas complementares de DNA ou RNA para produzir hélices duplas do tipo DNA-DNA ou DNA-RNA. Obtenção de Sondas para detecção de marcadores RFLP • Através de transcrição reversa do mRNA do organismo de estudo; • Produção de uma biblioteca de cDNA; • Produção de uma biblioteca genômica; • Amplificação por PCR ; POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO – RFLP Interpretação de bandas RFLP VANTAGENS • Ampla cobertura do genoma; • As sondas podem ser de regiões transcritas ou não; • Nº de marcadores praticamente ilimitado; • Conservação e reutilização das membranas. LIMITAÇÕES • Mão-de-obra intensiva; • Inexistência de uma biblioteca de sondas disponíveis; • Requer pessoal técnico qualificado; • Instalações adequadas. RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) Significa polimorfismo de DNA amplificado ao acaso, e se caracteriza pela presença ou ausência de banda. Princípio: • Usa primers aleatórios de pequeno tamanho (usualmente 10 pb); • Amplifica seqüências desconhecidas de DNA. • Utiliza um primer único ao invés de um par de primers; Visão Geral da Técnica Interpretação do padrão de bandas RAPD • Polimorfismo de DNA entre indivíduos pode ser devido a: •Ausência do sítio do primer. •Surgimento de um novo sítio. •Ao comprimento da região amplificada entre sítios de primer. Vantagens • Grande número de fragmentos • Técnica simples e rápida • Primers aleatórios são facilmente adquiridos, sem a necessidade de informação genética. • Pequena quantidade de DNA • Pouca mão-de-obra; • Visualização direta das bandas no gel; • Não requer biblioteca genômica para o organismo em estudo; • Não necessita de radioisótopos; • Distribuição em todo o genoma; • Baixo custo; • Uso cotidiano em programas de melhoramento. Desvantagens • Dominante. • Falta de um conhecimento a priori do produto amplificado. • Problemas com reprodutibilidade Microssatélites – SSR (Simple Sequence Repeats) • Significa Seqüências Simples Repetidas, a qual consiste de pequenas seqüências de nucleotídeos (1 a 4) repetidas em tandem. • Essas seqüências são distribuídas ao acaso no genoma e constituem a classe de marcador mais polimórfica hoje disponível. BASE GENÉTICA • Amplificação de SSR através de PCR utilizando-se um par de “primers” específicos (20 a 30 pb). • Polimorfismo extensivo resultante da presença de diferentes números de elementos simples repetidos. • Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco. VANTAGENS • Codominante • Multialélico • Elevado conteúdo de informação de polimorfismo – PIC • Microssatélites são freqüentes e distribuídos ao acaso (cobertura completa do genoma). LIMITAÇÕES • Requer biblioteca de fragmentos genômico para o organismo de interesse; • Grande mão-de-obra; • Pessoal especializado; • Equipamentos sofisticados (sequenciador automático). OUTROS MARCADORES UTILIZADOS • SCAR – (Sequence Characterized Amplified Regions), que analisam regiões de seqüências de caracteres amplificados; • STS – (Sequence Tagged Sites), que analisam seqüências em sítios alvo. Padrão de bandas SCAR Padrão de bandas STS VNTR (Variable Number of Tandem Reapeats) • Seqüências adjacentes que se repetem em número variável; • Loco variável com seqüências idênticas repetidas lado a lado com 15 a 100 pares de bases, com até 50 repetições; • “DNA fingerprinting” , muito usado na ciência forense; Marcadores cromossômicos Gene TP53 • O TP53 é o gene supressor tumoral mais estudado em cânceres humanos e atua na regulação do desenvolvimento e do crescimento celular Fonte: p53.free.fr/p53_info/image_info/p53_gene2.jpg 11 éxons Priscilla Silva Rosa de Almeida Gene TP53 • Proteína p53 – Resposta celular a várias formas de estresse • Bloqueio do ciclo celular nos pontos de checagem • Reparo • Apoptose • Senescência – Manutenção da integridadegenômica e controle da proliferação celular TP53 é um Gene Supressor de Tumor p53+/+ p53+/- p53-/- 1% at 18 months % mice with tumor 75% at 6 months 2% at 9 months Donehower et al. 1992 Mutações Somáticas em TP53 são Frequentes em Cânceres Humanos Mutações Germinativas em TP53 Predispõem a Vários Tipos de Câncer Tumor spectrum in TP53 mutation carriers 5.9 1.5 1.5 1.7 2.5 3.2 3.4 6.8 12.8 15.4 16 28.9 0 5 10 15 20 25 30 Other Ovary Skin Colorectum Stomach Leuk/Lymph. Lung Adrenal gland Bones Brain Soft tissues Breast >80% Olivier et al. Cancer Res. 2003 Proteína p53 é Alvo de Vários Vírus Priscilla Silva Rosa de Almeida Gene TP53 • Polimorfismo de TP53 – SNP = single nucleotide polymorphism: variações na seqüência de DNA, uma base nitrogenada – Freqüência maior que 1% na população – 14 polimorfismos diferentes Gene TP53 • Em células com o TP53 mutado ou inativo, há um acúmulo de defeitos genéticos que culminam com a transformação maligna, pois não ocorre apoptose • O polimorfismo de TP53 causa impacto na seqüência codificante do gene, além de se associar a um maior risco para o desenvolvimento de alguns tipos de câncer Priscilla Silva Rosa de Almeida Gene TP53 • Polimorfismo do códon 72 de TP53 – Seqüência codificante do gene • Alteração estrutural da proteína p53 • Alelos p53Arg e/ou p53Pro – Genótipos: p53Arg/Arg, p53Arg/Pro e p53Pro/Pro Priscilla Silva Rosa de Almeida Gene TP53 • Polimorfismo do códon 72 de TP53 – Distribuição geográfica das variantes – Diferenças funcionais das variantes – Longevidade – Suscetibilidade ao câncer – Prognóstico Genotipagem do polimorfismo do códon 72 do gene TP53 • Amostras são submetidas a duas reações de PCR, utilizando os primers para genotipagem dos alelos p53Arg e p53Pro • Produtos da PCR analisados em gel de poliacrilamida Genotipagem do polimorfismo do códon 72 do gene TP53 Gene HER2 • O HER2 é um gene que codifica uma proteína do mesmo nome. Outros nomes que podem ser aplicados são: ERBB2, c-erb-b2 e c-neu. Este gene está amplificado em cerca de 20% dos casos de câncer de mama e de ovário (por exemplo), ou seja, o número de genes por célula do tumor é maior que o número normal (cada gene normalmente tem sempre duas cópias, também chamadas de alelos). • A presença desta amplificação caracteriza tumores mais agressivos → PCR Obrigada!!!!
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