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Brasília-DF. Imuno-hematologIa e ImunologIa ClínICa Elaboração Eliseu Frank de Araújo Julio Cesar Pissuti Damalio Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração Sumário APrESEntAção ................................................................................................................................. 4 orgAnizAção do CAdErno dE EStudoS E PESquiSA .................................................................... 5 introdução.................................................................................................................................... 7 unidAdE i IMUNOHEMATOLOGIA ........................................................................................................................... 9 CAPÍtuLo 1 SISTEMA ABO ........................................................................................................................... 9 CAPÍtuLo 2 SISTEMA RH ............................................................................................................................ 17 unidAdE ii IMUNOLOGIA CLÍNICA ........................................................................................................................ 26 CAPÍtuLo 1 ANTICORpOS ......................................................................................................................... 26 CAPÍtuLo 2 REAçãO dE pRECIpITAçãO E AGLUTINAçãO ......................................................................... 35 CAPÍtuLo 3 QUANTIfICAçãO dA CONCENTRAçãO ANTIGêNICA OU dE ANTICORpOS ............................. 39 CAPÍtuLo 4 IdENTIfICAçãO dE ANTÍGENOS EM CéLULAS E ANTÍGENOS .................................................... 52 CAPÍtuLo 5 METOdOLOGIAS COM USO dE BIOLOGIA MOLECULAR .......................................................... 62 CAPÍtuLo 6 dIAGNóSTICOS LABORATORIAIS (MINISTéRIO dA SAúdE) ......................................................... 67 PArA (não) FinALizAr ..................................................................................................................... 81 rEFErênCiAS .................................................................................................................................. 82 4 Apresentação Caro aluno A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD. Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo. Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira. Conselho Editorial 5 organização do Caderno de Estudos e Pesquisa Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares. A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa. Provocação Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor conteudista. Para refletir Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões. Sugestão de estudo complementar Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso. Praticando Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer o processo de aprendizagem do aluno. Atenção Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a síntese/conclusão do assunto abordado. 6 Saiba mais Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões sobre o assunto abordado. Sintetizando Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos. Exercício de fixação Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/ conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não há registro de menção). Avaliação Final Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso, que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber se pode ou não receber a certificação. Para (não) finalizar Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado. 7 introdução Historicamente a Imunologia surgiu como um ramo da microbiologia e conquistou seu espaço com os estudos das doenças infecciosas e suas respectivas respostas. A nossa capacidade de coexistir com diversos micro-organismos de nosso ambiente depende de um conjunto de fatores, e um destes fatores é o Sistema Imune. O Sistema Imune, por sua vez, é como um conjunto de células de defesa e/ou ataque eficaz que tem a capacidade de distinguir os sinais de perigo para o organismo e protegê-lo contra estes patógenos oportunistas. Esta distinção ocorre por comunicação por meio de sinais mediados por citocinas e receptores. As células do Sistema Imune estão distribuídas por todo organismo, alojadas nos tecidos, e desempenham o papel de sentinelas e circulando por vasos sanguíneos e linfáticos esperando o sinal de que o organismo foi invadido. A Imunologia Clínica tem o objetivo de investigar e orientar o clínico na apuração de diagnósticos das patogenicidades por meio de resultados de exames laboratoriais. Para tanto é necessário conhecer as estratégias traçadas pelo Sistema Imune, no que tange ao controle e/ou eliminação dos diferentes patógenos, além de saber as estratégias de evasão utilizadas pelos patógenos para driblar a defesa e o ataque do Sistema Imune. Obviamente, sob o ponto de vista imunológico, um determinado agente infeccioso não precisa se restringir a uma única estratégia patogênica, de modo que a resposta imune eficiente contra o determinado micro-organismo pode incluir diversos mecanismos. objetivos » Reconhecer o sistema ABO e seus componentes: antígenos e anticorpos. » Entender a importância do sistema ABO na prática transfusional. » Reconhecer do sistema Rh e seus componentes: antígenos e anticorpos. » Entender o Teste de Coombs direto e indireto. » Conhecer a caracterização da Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN) e suas implicações em gestações de risco. Antígeno D fraco e parcial. » Reconhecer osanticorpos: classes e funções das Igs. » Reconhecer as aplicações dos testes imunológicos mais utilizados em Análises Clínicas; » Caracterizar diagnósticos laboratoriais de várias doenças, de acordo com o Ministério da Saúde. 9 unidAdE iiMunoHEMAtoLogiA CAPÍtuLo 1 Sistema ABo É de suma importância a compreensão dos sistemas antigênicos das células sanguíneas. Além das aplicações práticas da genética da célula sanguínea, como transfusões de sangue, transplantes e estudos com fins antropológicos, a investigação dos antígenos das hemácias oferece uma visão ampla de outros aspectos mais básicos da biologia humana. O conhecimento de antígenos e anticorpos plaquetários e granulocíticos é menos completo. Foram descritos antígenos específicos de plaquetas e granulócitos, contudo a tipagem para esses antígenos não está em uso rotineiro. Em contraste, os antígenos de superfície dos linfócitos foram estudados mais detalhadamente durante as últimas três décadas. Os antígenos do complexo de histocompatibilidade maior são importantes na moderna prática transfusional, mas o estudo desse sistema tem um significado mais amplo e levou a um insight dos mecanismos genéticos da imunorregulação, transplante e doença. o Sistema do grupo Sanguíneo ABo Histórico Historicamente, a separação dos indivíduos em grupos de acordo com os antígenos presentes em suas hemácias foi demonstrada pela primeira vez em 1900–1901, pelo médico austríaco Karl Landsteiner. Ao reagir amostras de sangue de diversas pessoas, isolou eritrócitos fazendo diferentes combinações entre plasma e hemácias. Encontrou como resultado a presença de aglutinação dos glóbulos em alguns casos e sua ausência em outros. Dessa forma, Karl Landsteiner classificou os seres humanos em 3 grupos sanguíneos distintos, a saber, A, B e O, e ainda explicou o fato de algumas pessoas morrerem depois de transfusões de sangue e outras não. Mais tarde, em 1902, o grupo sanguíneo AB foi descrito por von Decastello e Sturli. Destaca-se como importante no Sistema ABO, na prática transfusional, o fato de ser esse o sistema que possui maior capacidade de provocar a produção de anticorpos, ou seja, é o mais antigênico. Como os eritrócitos humanos não expressam moléculas HLA de classe I e II, essas moléculas de 10 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA superfície altamente polimórficas têm pouca consequência na transfusão sanguínea. A maior barreira imunogenética se constitui, então, nos polimorfismos estruturais nos carboidratos dos glicolipídios de superfície das hemácias, cujas diferenças antigênicas são a base do sistema ABO. Vídeo-aula sobre o sistema ABO Antígenos de hemácias A composição antigênica das hemácias é importante na terapia transfusional. Na prática transfusional rotineira, os testes determinam a compatibilidade entre o doador e o receptor dos antígenos de grupos sanguíneos de significado clínico. Os anticorpos que reagem com antígenos de hemácias podem provocar graves problemas clínicos, entre eles as reações transfusionais hemolíticas, a doença hemolítica do recém-nascido e as anemias hemolíticas autoimunes. Alguns antígenos já são bem definidos bioquimicamente e dividem-se em 2 grupos: carboidratos (em que um gene codifica a formação de enzimas que adicionarão açúcares a substratos específicos – ABO) ou proteicos (decorrentes de ação direta de um gene – Rh). Constituição dos anticorpos Os anticorpos do Sistema ABO – usualmente chamados de aglutininas – estão presentes no plasma de indivíduos, contra os antígenos que eles não possuem em suas hemácias, classificados assim de anti-A e anti-B. Esses anticorpos são formados naturalmente contra antígenos que não estão presentes nas hemácias. Os estímulos são passivos, gerados por bactérias que colonizam o trato intestinal a partir do nascimento. Geralmente, os anticorpos do Sistema ABO são misturas de IgM e IgG (Unidade II). Tanto anticorpos ABO classe IgM ou IgG, são capazes de desativar o sistema complemento, provocando hemólise intravascular em transfusões incompatíveis. Indivíduos pertencentes ao grupo de sangue tipo AB não tem anticorpos anti-A ou anti-B. Já os indivíduos portadores de sangue tipo A possuem anticorpos anti-B, os pertencentes ao grupo B possuem anticorpos anti-A e os indivíduos do grupo O, finalmente, possuem as aglutininas anti-A e aglutininas anti-B. 11 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I determinação do grupo sanguíneo ABo A determinação do grupo sanguíneo é realizada pela identificação de antígenos nas hemácias, usando anticorpos anti-A e anti-B. Essa técnica, chamada de tipagem direta, permite que os anticorpos sejam reconhecidos na superfície das hemácias, dividindo as pessoas em quatro grupos: sangue A, B, O e AB (Figura 1). figura 1 – determinação do Sistema ABO. fonte: Immunohematology (Quinley). transfusões sanguíneas no sistema ABo A divisão das transfusões sanguíneas no Sistema ABO pode ser feita em dois grandes conjuntos: 1) isogrupo, quando doador e receptor são do mesmo grupo de acordo com o sistema ABO, e 2) heterogrupo, quando o doador e receptor são de grupos sanguíneos diferentes. A escolha do sangue deve levar em conta que o indivíduo não pode ser transfundido com um sangue que possua um antígeno que ele não tem, justamente porque o anticorpo presente no seu plasma irá reagir contra as hemácias transfundidas. 12 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA O esquema abaixo mostra as transfusões possíveis quanto ao sistema ABO (Figura 2): figura 2 – Transfusões do Sistema ABO. fonte: imunofarma.blospot.com – abril/2013. É interessante abordar que o grupo sanguíneo O pode ser doado para todos os grupos existentes; sendo denominados doadores universais. Entretanto, indivíduos portadores do sangue O não podem receber sangue de nenhum outro grupo – apenas do seu próprio grupo. O grupo AB, por sua vez, pode receber sangue de qualquer outro tipo, constituindo-se receptores universais. genética Os antígenos A e B são herdados segundo a Lei de Mendel. O grupo ABO de um indivíduo é determinado pela presença de um (homozigótico) ou dois (heterozigótico) dos três alelos: A, B e H, cujo gene está localizado no cromossomo 9 (Tabela 1). Tabela 1 – Genética do Sistema ABO. Fenótipo Genótipo Antígenos de hemácias Anticorpos O A B AB OO AO ou AA BO ou BB AB (H) A B A+B Anti-A+Anti-B Anti-B Anti-A nenhum fonte: Métodos de laboratório aplicados à clínica, 2009. 13 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I Acesse o site http://djalmasantos.wordpress.com/2011/04/30/testes-de- genetica-35/, publicado pelo Professor Djalma Santos, e observe os vários testes de genética. Bioquímica É importante destacar que os produtos dos genes A e B não são os antígenos A e B por si; as glicosiltransferases têm como função modificar a membrana celular e levar à síntese dos antígenos A e B. Existe uma substância precursora na forma de cadeia lateral oligossacarídica associada com glicoesfingolipídeos e glicoproteínas de membrana. Após conversão dessa substância precursora na substância H, o precursor imediato dos antígenos A e B está sob influência dos alelos H e h, que são herdados independentemente do gene determinando o tipo ABO. O H é comum; o h é raro. Em dose simples ou dupla, o gene H apresenta uma enzima, a H-transferase, que converte a substância precursora em substância H. A presença de um alelo A ou B determina a atividade da A ou B-transferase correspondente, que subsequentemente converterá a substância H em antígeno A ou B. Quando o antígeno A ou B está ausente das hemácias, o anticorpo correspondente está presente no plasma. Ao nascimento, essas iso-hemaglutininas estão ausentes, mas desenvolvem-se durante os 6 primeirosmeses de vida. Elas surgem como produto da exposição dos polissacarídeos semelhantes a ABO que são vistas em micro-organismos, sementes, plantas e outras fontes exógenas. Substâncias com atividade antigênica de A, B e H estão amplamente distribuídas nas hemácias, bem como em secreções e glândulas mucosas dos tratos gastrointestinal, respiratório e genital. Enzimas A especificidade A, B ou H de uma hemácia é determinada pela atividade de enzimas geneticamente determinadas durante o desenvolvimento celular. Assim, o alelo H determina a expressão de uma H-transferase (α2-L-fucosiltransferase) a qual adiciona um resíduo de fucose à galactose terminal da substância precursora produzindo substância H. O alelo A, por sua vez, determina a expressão de A-transferase (α3-N-acetilgalactosaminiltransfera se), adicionando N-acetilgalactosamina à galactose terminal da substância H. Por fim, o alelo B determina a B-transferase (α3-D-galactosiltransferase), que transfere uma molécula de galactose na mesma posição. A principal diferença entre as hemácias do grupo A e do grupo B é o resultado de diferenças estruturais entre essas duas moléculas de açúcar. As hemácias do grupo O não expressam atividade de A-transferase nem de B-transferase. Nos indivíduos do grupo sanguíneo AB, estão presentes ambos os alelos A e B, com as duas transferases ativas e os dois sítios antigênicos com as especificidades A e B presentes na mesma molécula. 14 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA Antígenos ABo Os antígenos A e B estão localizados na superfície externa da membrana da hemácia. Vários antígenos têm especificidade A. A mais frequente é A1; 80% dos indivíduos do grupo A são A1 e 20% são A2. A2 e outras variantes reagem mais fracamente com soros de tipagem anti-A que as hemácias A1. São conhecidas também variantes mais fracas do grupo A, entre elas A3, Ax, Am, Aend, Ae1 e outros, e elas constituem menos de 1% do fenótipo do grupo A . Existem também variantes fracamente reativas do antígeno B, como B3, Bx e Bm1, mas elas ocorrem com menor frequência que as variantes do grupo A. Anticorpos ABo (iso-hemaglutininas) Em adultos, anticorpos IgM anti-A e/ou anti-B, de ocorrência natural e com especificidade complementar ao seu próprio grupo ABO, estão presente, devido a estímulos oriundos de antígenos vegetais e também bacterianos. Já em neonatos, os anticorpos IgM estão ausentes nos 3 a 6 primeiros meses de vida. O soro do grupo O contém anti-A, anti-A1 e anti-B. Determinação dos grupos sanguíneos do sistema ABO 1. Procedimento TÉCNICA EM LÂMINA » Colocar uma gota de sangue homogeneizado, colhido com anticoagulante, em ambas as extremidades da lâmina. » Colocar uma gota do soro anti-A sobre a gota de sangue à esquerda da lâmina. » Colocar uma gota do soro anti-B sobre a gota de sangue à direita da lâmina. » Misturar as gotas com o auxílio de uma pazinha ou ponteira. » Fazer a leitura observando se houve ou não aglutinação. TÉCNICA EM TUBO » Tomar 2 tubos de hemólise. » Colocar no primeiro tubo uma gota do soro anti-A. » Colocar no segundo tubo uma gota do soro anti-B. » Em cada um dos tubos adicionar uma gota da suspensão de hemácias a 5% do paciente. » Homogeneizar e centrifugar os tubos a 1.500 rpm durante 2 minutos. » Fazer a leitura observando se houve ou não aglutinação. PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS A 5% » Em um tubo cônico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante + 9 mL de soro fisiológico (NaCl 0,85%). » Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos. » Desprezar o sobrenadante. » Repetir este procedimento mais 2 vezes. » A partir do sedimento de hemácias lavadas, preparar uma suspensão a 5% (50µL do sedimento de hemácias + 950 µL de soro fisiológico). 15 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I 2. Interpretação Grupo Sanguíneo Anti-A Anti-B AB + + A + - B - + O - - Sinal + indica presença de aglutinação Sinal – indica ausência de aglutinação 3. Significado clínico Os grupos sanguíneos são determinados pela presença de antígenos na superfície das células, particularmente as hemácias. Estes antígenos possuem natureza bioquímica variada, podendo ser compostos de carboidratos, lipídios, proteínas ou uma mistura destas biomoléculas. A determinação dos grupos sanguíneos tem importância em várias áreas da saúde: » Hemoterapia; medicina transfusional; » Neonatologia; » Antropologia; » Medicina forense etc. Os tipos sanguíneos mais frequentes são “O+” e “A+”. O sistema ABO é o mais importante na prática transfusional por ser o mais imunogênico, seguido pelo sistema Rh. testes laboratoriais para tipagem ABo testes pré-transfusionais a. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do doador É obrigatória, em todas as unidades coletadas, a determinação estrita do grupo ABO, do tipo Rho (D), do antígeno D fraco (Du) nas Rho (D) negativo e dos testes para a exclusão das hepatites tipos B e C, doença de Chagas, sífilis, AIDS, anticorpos anti- HTLV-I/II e anti-HBc. Testes para a pesquisa de anticorpos irregulares e dosagem de ALT/TOP devem ser realizados de forma complementar. Recomenda-se também a realização de testes para exclusão de malária, anemia falciforme e detecção de hemoglobinas anormais. O sangue total e seus componentes não podem ser transfundidos antes da obtenção de resultados finais não reagentes, nos testes de detecção para Hepatites B e C, HIV- 1 e HIV-2, Doença de Chagas, Sífilis, HTLV-I e HTLV-II. b. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do receptor O tratamento com o sangue do receptor deve ser igualmente considerado e classificado a fim de averiguar a compatibilidade imunológica entre o doador e o receptor. Realizam-se os testes para verificação do grupo ABO e Rh. 16 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA Verifica-se ainda a presença de anticorpos do receptor que potencialmente inviabilizariam a transfusão. Além disso, realizam-se os testes de Coombs direto e indireto (ver a seguir) e o teste da prova cruzada. incompatibilidade do sistema ABo As provas de compatibilidade fazem parte dos testes pré-transfusionais, isto é, fazem parte do procedimento que tem por finalidade verificar in vitro a compatibilidade eritrocitária entre o doador e o receptor. São executadas em meio de antiglobulina humana (AGH), entre o soro/plasma do doente e os eritrócitos do doador. Essas provas identificam incompatibilidades causadas por anticorpos clinicamente significativos, em especial do sistema ABO, pela gravidade das reações transfusionais que provocam. 17 CAPÍtuLo 2 Sistema rh Na prática transfusional, o sistema do grupo Rh só perde em importância para o ABO, sendo que foi descrito pela primeira vez por Levine e Stetson, em 1939. O termo Rh veio dos resultados de Landsteiner e Wiener que, em 1940, demonstraram que coelhos imunizados com hemácias de macacos rhesus produziam um anticorpo que reagia com hemácias humanas. O sistema Rh é um dos mais polimórficos dos grupos sanguíneos humanos. Os genes Rh estão localizados no cromossomo 1. Até o momento, não tem sua estrutura bioquímica totalmente elucidada. Trata-se de uma proteína com importante papel na integridade da membrana eritrocitária. Os vários determinantes antigênicos do sistema Rh são produtos proteicos de um complexo sistema de genes polimórficos. O conceito de Fisher-Race (DCE) é simples e direto, mas fornece uma aproximação genética do sistema Rh e é conveniente para fins descritivos e para a interpretação da maioria dos problemas clínicos relacionados ao Rh. De acordo com este modelo, três genes intimamente ligados determinam a especificidade das estruturas antigênicas responsáveis pelo tipo Rh das hemácias. Três alelos codominantes são D e d; Ce c; e E e e, com o complexo gênico inteiro sendo herdado como uma unidade. Os antígenos resultantes são denominados D, C, c, E e e. Um antígeno com atividade d nunca foi descrito e o alelo d é considerado amórfico. A denominação Rh positivo aponta para a presença do antígeno D. A incidência do fenótipo D (Rh)-positivo entre os brancos é de 85% e os 15% que não possuem o D (e são geneticamente dd) são considerados Rh negativos. Entre os Rh-positivos, 42% são homozigotos (DD) e 58% são heterozigotos (Dd). Anticorpos relacionados com esse antígeno são importantes na prática transfusional, pois o D é altamente imunogênico; o anti-D pode resultar em graves reações hemolíticas se constituindo uma importante causa de DHRN grave. Os anticorpos contra os vários antígenos Rh geralmente se desenvolvem após uma exposição a hemácias estranhas, como em transfusões ou gestações, mas ocasionalmente podem ocorrer naturalmente. Esses anticorpos geralmente são da classe IgG (Unidade II), não fixam complemento, mas podem causar severa hemólise extravascular. determinação do fator rh O teste mais comum para se determinar o fator Rh é o Teste de Coombs, efetuado com o soro de mesmo nome. Pode ser direto ou indireto. 18 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA teste de Coombs direto O teste de Coombs direto é atualmente chamado de teste de antiglobulina direta (TAD). Este teste avalia se a hemácia do paciente está sensibilizada com anticorpos ou com proteínas do sistema complemento. Para isso, 50 µL de hemácias a 5% são lavadas três vezes com solução salina 0,9% e o sobrenadante da última lavagem é totalmente desprezado. Ao botão das hemácias lavadas é acrescentada duas gotas de soro de Coombs (anti-IgG) ou preferencialmente antiglobulina humana (AGH). A utilização de AGH na fase de Coombs na pesquisa de anticorpos (direto ou indireto) possibilita a detecção de proteínas do sistema complemento. Caso o resultado seja negativo, devem-se acrescentar ao tubo de reação duas gotas de hemácias humanas sensibilizadas com IgG e verificar se houve aglutinação. A positividade na prova de Coombs direto indica que a hemácia está sensibilizada e é recomendada a identificação da classe e do anticorpo. Para identificação de que o anticorpo é contra algum antígeno do sistema eritrocitário, este deve ser eluído dos antígenos do paciente e do eluato analisado (Figura 4). figura 3: Teste de Coombs. Modificado de: <http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html>. Acesso em: 17 abr. 2013. 19 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I Um teste de Coombs direto utilizando anti-soro contra IgG é quase sempre positivo em: » mulheres com anticorpos anti-D circulantes; » recém-nascidos com doença hemolítica de Rh; » pacientes com imunodeficiência; » pacientes com anemia hemolítica induzida por alfa-metildopa; » pacientes com anemia hemolítica autoimune. Resposta durante o curso, em nossas conversas on-line. Procure textos que te ajudem a encontrar a resposta! teste direto da Antiglobulina (tdA) ou Coombs direto O TDA tem por finalidade a detecção de anticorpos ou componentes do complemento fixados às hemácias in vivo ou in vitro. Descrição da técnica: 1. Lavar as hemácias teste de 3 a 4 vezes em salina e preparar uma suspensão de 3 à 5% em salina. 2. Identificar dois tubos (IgG, Poli) e acrescentar 1 gota de suspensão de hemácias em cada tubo. 3. Adicionar de 1 a 2 gotas do soro antiglobulina correspondente a cada tubo. 4. Misturar e centrifugar de 3.000 a 3.600 rpm por 15-20 segundos. 5. Ressuspender gentilmente e examinar a aglutinação. Registrar os resultados. Quando o Coombs direto for negativo com a leitura imediata, deixar 15 minutos em temperatura ambiente, centrifugar e ler novamente. Os resultados negativos deverão ser confirmados adicionando o controle de Coombs, centrifugando e observando a aglutinação: » controle de Coombs positivo valida o resultado negativo do Coombs direto; » controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado do Coombs direto é falso-negativo. Neste caso é necessário repetir a técnica. 20 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para realização de estudos. A presença de aglutinação indica que as hemácias podem estar sensibilizadas por anticorpos ou por componentes do complemento. Para se definir a especificidade do anticorpo devem ser aplicados testes de eluição. teste de Coombs indireto A prova de Coombs Indireto é chamada de Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) e avalia a presença de anticorpos irregulares circulantes no soro de doadores de sangue, receptores, gestantes, pacientes com suspeita de anemias hemolíticas por presença de anticorpos, entre outros (Figura 4). figura 4 – Teste de Coombs Indireto. fonte: < http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html>. Acesso em: 17 abr. 2013. A pesquisa é realizada rotineiramente no soro de doadores de sangue e receptores, utilizando para isso hemácias comerciais fenotipadas do grupo O que apresentam os antígenos para os anticorpos irregulares mais frequentes. Esse teste é obrigatório nos serviços de hemoterapia porque, quando o doador apresenta anticorpos irregulares, esses estariam presentes na bolsa de hemocomponente, podendo reagir com suas hemácias do receptor caso encontrassem antígenos correspondentes. No caso do receptor, é importante o teste, pois, caso esse tenha algum anticorpo irregular, é aconselhável a identificação por duas razões: 1. é possível direcionar a prova de compatibilidade para bolsas que sejam negativas para o antígeno, equacionando tempo e custos; 2. caso o paciente seja um candidato a cirurgia, possibilita que o serviço de hemoterapia providencie com antecedência e tempo hábil as bolsa de sangue compatível. 21 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I Sempre que a PAI é positiva, deve-se proceder à identificação da especificidade do(s) anticorpo(s) irregulares encontrado(s) no soro/plasma. A identificação de anticorpos irregulares deve incluir, obrigatoriamente, o meio no qual a PAI foi reativa. A identificação de anticorpos irregulares (IAI) é realizada com o soro do paciente utilizando um painel de hemácias. Geralmente esse painel apresenta 11 hemácias, em suspensão de 3-5%, numeradas de 1 a 11. As hemácias do painel são do tipo O e possuem os antígenos contra os anticorpos mais frequentes em bancos de sangue. Acompanhando o painel vem um diagrama contendo o perfil fenotípico de cada uma das hemácias. A presença de aglutinação diante dos diferentes eritrócitos permite a identificação do anticorpo. Como exemplo: houve aglutinação nos tubos 1, 2, 3, 8, 10 e 11. Basta procurar em cada uma das colunas do diagrama o perfil de aglutinação obtido. figura 5 – painel de hemácias. fonte: http://pt.scribd.com/doc/54611627/Controle-Imuno-hematologico-Transfusoes. O site Biomedicina Padrão traz a técnica e os testes de Coombs Direto e Indireto: <http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html> <http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html> PAI (COOMBS INDIRETO em) Polietilenoglicol – (Bio PEG®) – tubo Bio PEG® (polietilenoglicol) é uma macromolécula que retira a água do meio de suspensão das hemácias, permitindo uma maior concentração dos anticorpos ao redor das hemácias em suspensão e favorecendo a aglutinação. 22 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1. Marcar dois tubos: I e II (ambos devem ser identificados com o número da amostra teste); 2. Em cada tubo, adicionar 2 gotas de soro do paciente e 1 gota do reagente de hemácia de triagem I e II, respectivamente; 3. Acrescentar 2 gotas de Bio PEG® , homogeneizar e nãocentrifugar; 4. Incubar a 37oC por 15 minutos; 5. NÃO centrifugar (pois este potencializador forma um precipitado de proteínas que impede a observação da aglutinação antes da lavagem); 6. Lavar as hemácias 3 vezes com salina (sempre que desprezar os sobrenadantes, agitar os tubos para que ocorra o desprendimento total do botão formado no fundo do tubo; só depois acrescentar novamente a salina); 7. Decantar completamente o sobrenadante final, desprender o botão formado e adicionar 1 gota de soro antigamaglobulina anti-IgG; 8. Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos a 3.400 rpm; 9. Examinar a aglutinação das hemácias e registrar os resultados de acordo com ausência ou presença de aglutinação, anotando sempre a intensidade de aglutinação. Ao resultado negativo é preciso realizar a validação da reação com controle de Coombs: » Controle de Coombs positivo valida o resultado negativo da PAI. » Controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado da PAI é falso-negativo. Nesse caso é preciso repetir a PAI. Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para realização da identificação do(s) anticorpo(s). Neste caso, a transfusão de hemácias deve ser célula(s) antígeno(s) – negativo(s) para o anticorpo identificado. Não se esquecer Ao encaminhar as amostras para o laboratório especializado, enviar também o histórico do paciente (idade, diagnóstico, antecedentes transfusionais, gestação/ aborto, medicação etc.). Observações: para evitar reações falso-positivas, é melhor utilizar o soro Anti-IgG do que o soro antiglobulina poliespecífico. 23 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I doença hemolítica do recém-nascido A doença hemolítica do recém-nascido ocorre quando uma mãe de Rh negativo concebe um filho Rh positivo. Para que a doença ocorra, a mãe necessariamente foi previamente imunizada contra Rh+. Essa imunização pode ter ocorrido por transfusões incorretas, parto prévio de um bebê Rh positivo, descolamentos de placenta e outros casos em que a mãe tenha entrado em contato com sangue Rh positivo. Anticorpos anti-D passam pela placenta e provocam a lise de hemácias, causando uma anemia séria no bebê. A doença é chamada de eritroblastose fetal, porque, na tentativa de compensar a anemia, o organismo do feto libera eritroblastos (hemácias não maduras) na circulação (Figura 6). figura 6 – doença hemolítica do recém-nascido. fonte: <lucianecantalicebiologia.blogspot.com>. Há certos procedimentos que a mãe de Rh negativo pode realizar a fim de evitar a doença hemolítica do neonato. Pode-se destacar o cuidado no contato com sangue de Rh positivo, o diagnóstico do fator Rh do feto através da técnica denominada Reação em Cadeia de Polimerase, a realização do Teste de Coombs para saber se a mãe já está imunizada e ainda o uso de medicamentos como o MATERGAM e RHOGAM, que são imunoglobulinas (IgG) Anti-D usadas profilaticamente na prevenção de anticorpos contra eritrócitos Rh positivos em pessoas Rh negativas que estão sob risco de serem sensibilizadas por esses eritrócitos. Antígeno d fraco (fraca expressão de d) É sabido que um número muito reduzido de pessoas possui hemácias que não são aglutinadas diretamente com soro anti-D, contudo reagem positivamente ao teste da anti-globulina. Durante a incubação com soro anti-D, ocorre sensibilização das hemácias portadoras do fator D fraco. Acrescentando-se a antiglobulina, esta reagirá com os anticorpos sensibilizando as hemácias (anti-D), e assim promovendo a aglutinação. O fator D fraco é um alelo do gene D tão imunogênico quanto o próprio antígeno D. Normalmente hemácias RhD positivas possuem uma densidade antigênica variando entre 15.000 a 30.000 antígenos/célula, dependendo do haplótipo. Isto não é regra, pois alguns fenótipos foram identificados com densidade variando entre 70 e 5.200 antígenos RhD sendo denominados de 24 UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA D fracos. Estes são causados pela substituição de aminoácidos nas porções transmembranosas e intracelulares da proteína RhD devido à mutação no gene RHD. Hemácias com fenótipo D fraco expressam um antígeno RhD intacto ocorrendo em 0,2% a 1% dos caucasianos. Hoje em dia temos mais de 40 tipos de D fracos identificados em nível molecular, nos quais o D fraco tipo 1 e 2 são os mais frequentes. Somado a isso, o fenótipo D fraco carrega o antígeno RhD intacto, o que diminui a probabilidade de formar aloanticorpo anti-D. A distinção entre D fraco e D parcial não deve ser feita pela produção de anti-D. Foi proposto o índex Rhesus para a predição do risco de imunização em indivíduos D fraco. Esse índex foi baseado na densidade antigênica de diferentes anticorpos monoclonais dependendo da 1) quantidade de sítios antigênicos; e 2) afinidade do anticorpo e pode teoricamente variar de 1 (risco baixo, exemplo: RhD normal) a 0 (alto risco exemplo: parcial RhD faltando epítopos ). identificação de Antígeno d fraco Procedimento » Preparar uma suspensão de hemácias a 5%. » Tomar 3 tubos de hemólise, numerá-los de 1 a 3 e proceder segundo o esquema abaixo: Reagentes Tubo 1 (teste) Tubo 2 (controle positivo) Tubo 3 (controle negativo) Suspensão de hemácias 5% (teste) 1 gota - 1 gota Suspensão de hemácias 5% (Rh+) - 1 gota - Soro anti-D 1 gota 1 gota - Albumina bovina 22% - - 1 gota » Incubar em banho-maria 37º C durante 20 minutos. » Lavar 3 vezes com soro fisiológico (2.500 rpm durante 2 minutos). Reagentes Tubo 1 (teste) Tubo 2 (controle positivo) Tubo 3 (controle negativo) Soro de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotas » Homogeneizar e centrifugar a 1.500rpm durante 2 minutos. » Observar se houve ou não aglutinação. Interpretação D fraco positivo .................... se houve aglutinação D fraco negativo .................... se não houve aglutinação 25 IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I Antígeno d parcial O antígeno D é composto de numerosos epítopos e sua expressão parcial foi originalmente definida por indivíduos D apresentando formação de anti-D. Estudos com anticorpos monoclonais resultaram em mais de 30 epítopos altamente conformacionais, envolvendo várias alças extracelulares. Hemácias D parciais são definidas pela ausência de um ou mais epítopos causados pelos rearranjos dos genes RHD e RHCE. Essa configuração genética possibilita microconversões e trocas unidirecionais de fragmentos de gene RHD e RHCE, ou parte deles, levando a formação de alelos RHD-CE-D ou RHCE-D-CE respectivamente. Esses novos alelos aberrantes de Rh não produzem proteínas híbridas, regiões de RhD unidas com RhCE levando à perda de epítopos de D, gerando novos antígenos. Poucos fenótipos D parciais resultam de trocas de um aminoácido apenas. De forma contrária ao D fraco, o polimorfismo ocorre nos segmentos extracelulares da proteína RhD. Indivíduos D parciais podem frequentemente produzir anti-D contra aqueles epítopos ausentes quando expostos à proteína RhD completa. Quais seriam os outros sistemas sanguíneos e suas funções? Que tal fazer uma busca e incorporar este conhecimento? Sugestão de vídeos com aula sobre Sistema ABO e Rh http://www.youtube.com/watch?v=1LG5lTkgP0g http://www.youtube.com/watch?v=mPOIZKCorCI 26 unidAdE iiiMunoLogiA CLÍniCA CAPÍtuLo 1 Anticorpos Classes de anticorpos Anticorpo é caracterizado por uma GLOBULINA sintetizada de linfócitos B e principalmente por plasmócitos, após receber estímulo de um imunógeno, e que possui propriedade de interagir com este de maneira específica. Imunógenos x Antígenos Imunógenos são moléculas capazes de desencadear uma resposta imune adaptativa após sua introdução em humanos ou animais, ou seja, é qualquer substânciaque possa gerar uma resposta imune específica. Antígenos são substâncias que podem se ligar a um determinado anticorpo. Logo, todos os antígenos têm o potencial de induzir anticorpos específicos, no entanto, alguns precisam ligar-se a algum imunógeno para poder fazer isso. Isso quer dizer que todos os imunógenos são antígenos, mas nem todos os antígenos são imunógenos. Às vezes o que pode fazer com que um antígeno não seja um imunógeno é a reação cruzada, definida como a ligação de um anticorpo com outro anticorpo que não o imunógeno que desencadeou a resposta imune. No início da Imunologia, o anticorpo só era reconhecido por suas propriedades, como a de neutralizar a toxina correspondente ou provocar aglutinação de glóbulos vermelhos e a de promover lise de bactérias e provocar choque anafilático em pessoas ou animais sensibilizados. O conhecimento atual nos mostra que as moléculas de anticorpos são constituídas basicamente de duas subunidades proteicas chamadas cadeias leves (L) e duas subunidades designadas cadeias pesadas (H) do inglês heavy. A Organização Mundial da Saúde adotou a designação genérica de imunoglobulinas para todas as classes ou isotipos (tipos moleculares presentes em todos os indivíduos de uma mesma espécie) de 27 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II globulinas com a estrutura básica da molécula de anticorpo, usando a sigla Ig seguida das maiúsculas A, G, M, D e E para as cinco classes até agora conhecidas. As cinco classes (ou isotipos) diferem entre si (sequência primária de aminoácidos) das cadeias pesadas, sendo as cadeias leves iguais para todas as classes imunoglobulinas. Há, no entanto, dois tipos de cadeias leves com diferentes sequências de aminoácidos. As cadeias pesadas, específicas para cada classe, são também designadas por letras gregas que simbolizam a sua estrutura. Estrutura básica da molécula de anticorpo Os primeiros estudos de imunoglobulinas tiveram foco na IgG. Esta é a que apresenta maior concentração no soro, portanto, sua estrutura pôde ser mais facilmente caracterizada. A molécula de anticorpos de todas as subclasses é representada por um modelo básico constituído de duas cadeias polipeptídicas leves de peso molecular aproximado 23 kDa e duas cadeias pesadas com peso molecular variáveis entre 50 e 75 kDa, dependendo da subclasse a que pertence do anticorpo. Cada cadeia ou subunidade possui uma porção aminoterminal e na porção oposta é a carboxiterminal. Cada Molécula de IgG possui dois sítios de combinação específicos para o determinante antigênico que induziu sua síntese, a sequência de aminoácidos dessas porções é altamente variável e específica para cada imunógeno, apresentando grupos de aminoácidos, característicos do indivíduo que sintetiza a molécula (Figura 7). figura 7 – Estrutura de uma Imunoglobulina. fonte: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253> Veja mais, no artigo sobre imunidade do feto e do recém-nascido, encontrado no site: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253> 28 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA Propriedades gerais das imunoglobulinas Ligação ao antígeno (Ag) As imunoglobulinas são ligadas de forma específica a um ou mais antígenos proximamente relacionados. Cada imunoglobulina liga-se a um determinante antigênico específico. Ligação a antígeno pelos anticorpos é a função primária dos anticorpos e pode resultar em proteção do hospedeiro. A valência do anticorpo refere-se ao número de determinantes antigênicos que uma molécula individual de anticorpo pode se ligar, sendo que é pelo menos duas e em alguns casos mais (IgM – na forma pentâmera). resposta imune adaptativa primária e secundária Nas respostas imunes de primeiro contato com Antígeno (Ag), encontramos imunoglobulinas predominantes como IgM e IgD (na superfície da célula B) , que apresenta como principal característica principal ser mais lenta e menos intensa. Por sua vez, as respostas imunes de segundo contato com o antígeno (Ag), encontramos predominância de IgA, IgE e IgG, e respostas mais rápidas, intensas e especifica. Estrutura Todos os anticorpos são Igs, mas nem todas as Igs são classificadas como anticorpos: anticorpo constitui uma ação e um evento que é característico do funcionamento de uma molécula que se chama Ig. Contudo, também produzimos imunoglobulinas que não tem nenhuma atividade de anticorpo. Em suma, as Igs fazem parte das proteínas do sangue (são proteínas solúveis no sangue), embora possamos encontrar Igs em muitos fluidos e líquidos corporais também. Descobrimento das Igs: foi por meio da análise da mobilidade eletroforética das proteínas do sangue de acordo com o peso molecular de cada uma delas, onde se verificou a presença de um grupo de proteínas que correspondem às albuminas e um grupo que corresponde às globulinas. Dentro das globulinas, proteína que tem forma globosa, existem as globulinas alfa, beta e gama. Assim, as Igs fazem parte do grupo das Gama Globulinas e, na sua formação, é glicoproteica (proteína + polissacarídeo). Produzidas pelas células plasmáticas (LB maduro, únicas células a produzir Ig), esse processo normalmente é de resposta a um imunógeno. Existem eventos casuais e patológicos em que há produção de Ig sem a presença de um imunógeno (processos neoplásicos de células B, por exemplo) e a formação de grupos de células produtoras de Ig sem nenhum estímulo, ou seja, não são moléculas de anticorpos, são apenas Ig. As imunoglobulinas estão divididas em cinco classes diferentes, baseadas nas diferenças em sequências de aminoácidos na região constante das suas cadeias pesadas. A rigor, todas as 29 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II imunoglobulinas de uma mesma classe têm regiões constantes de cadeia pesada muito similares. Essas diferenças podem ser detectadas por estudos de sequências ou por meios sorológicos (i.e. pelo uso de anticorpos dirigidos a essas diferenças) (Figura 8). igg Estrutura: Todas IgGs são classificadas como monômeros (imunoglobulina 7S). As subclasses diferem no número de pontes dissulfeto e comprimento da região da dobradiça. Propriedades: É a mais versátil imunoglobulina porque é capaz de realizar todas as funções das moléculas de imunoglobulinas. a. IgG é a principal Ig no soro – 75% das Ig do soro são IgG. b. IgG é a principal Ig em espaços extra vasculares. c. Transferência placentária – IgG é a única classe de Ig que atravessa a placenta. A transferência é mediada pelo receptor da região Fc do IgG nas células placentárias. Nem todas as subclasses atravessam a placenta com a mesma eficiência; IgG2 não atravessa bem. d. Fixação do complemento – Nem todas as subclasses fixam com a mesma eficiência; IgG4 não fixa complemento. e. Ligação a células – Macrófagos, monócitos, PMNs (células da imunidade inata) e alguns linfócitos (imunidade adquirida) têm receptores para a região Fc da IgG. Nem todas as subclasses se ligam com a mesma eficiência; IgG2 e IgG4 não se ligam a receptores de Fc. Uma consequência direta da ligação a receptores de Fc em PMNs, monócitos e macrófagos é que a célula pode internalizar melhor o antígeno processado. O anticorpo cria um microambiente propício para que o antígeno seja reconhecido e fagocitado pelas células do sistema imune inato. O termo opsonina é usado para descrever substâncias que aumentam essa fagocitose. IgG é uma boa opsonina. Ligação de IgG a receptores de Fc em outros tipos de células resulta na ativação de outras funções. igM Estrutura: IgM é encontrada na sua forma pentâmera (imunoglobulina 19S), mas ela pode também existir como um monômero. Na forma pentâmera todas as cadeias pesadas são idênticas e todas as cadeias leves também se apresentam idênticas. Assim, a valência émáxima e teoricamente 10. IgM tem um domínio extra na cadeia mu (CH4) e ela tem outra proteína covalentemente ligada via uma ponde S-S chamada cadeia J. Esta cadeia funciona em polimerização da molécula a um pentâmero. 30 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA Propriedades: a. IgM é a terceira Ig mais comum no soro. b. IgM é a primeira Ig a ser feita pelo feto e a primeira Ig a ser feita por uma célula B virgem quando é estimulada pelo antígeno. c. Como consequência da sua estrutura pentâmera, IgM é uma boa Ig fixadora do sistema complemento. Assim, anticorpos IgM são muito eficientes em levar à lise de microrganismos. d. IgM também é uma boa Ig aglutinadora, agregando microrganismos para eliminação eventual para fora do corpo. e. IgM liga-se a algumas células via receptores de Fc. f. Ig de superfície de célula B IgM de superfície existe como um monômero e não tem cadeia J, mas tem 20 aminoácidos extras na região C-terminal para se ancorar na membrana. Essas Igs funcionam como receptores para antígeno ou células B e também estão associadas não covalentemente com duas proteínas adicionais na membrana da célula B (Ig-alfa e Ig-beta). As proteínas adicionais, por sua vez, agem como moléculas de transdução de sinal, uma vez que a cauda citoplasmática da molécula de Ig por si mesma é muito curta para transduzir um sinal. O contato entre a superfície da imunoglobulina e um antígeno é necessário antes da transdução do sinal pelas cadeias Ig-alfa e Ig-beta. Os antígenos T-independentes realizam contato entre o antígeno e a superfície da imunoglobulina com expressão suficiente para ativar as células B a se diferenciarem em plasmócitos secretores de anticorpos. Já os antígenos T-dependentes, é necessário um segundo sinal fornecido pelas células T auxiliares para ativar as células B. igA Estrutura: Em forma de dímero, uma cadeia J se associa a ela. Por outro lado, se IgA for encontrada em secreções identificamos outra proteína associada a ela chamada de peça secretora T; sIgA é, às vezes, referida como imunoglobulina 11S. Ao contrário do resto da IgA que é feito no plasmócito, a peça secretora é feita nas células epiteliais e é adicionada à IgA à medida que esta passa através das secreções. A peça secretora ajuda a IgA a ser transportada através da mucosa e também a protege da degradação nas secreções. Propriedades: a. IgA é comum no soro (so perde para IgG). b. IgA é a principal classe de Ig em secreções – lágrimas, saliva, colostro, muco. Uma vez que é encontrada em secreções IgA secretora é importante na imunidade local (de mucosa). 31 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II c. Normalmente IgA não fixa complemento, a menos que esteja agregada. d. IgA pode se ligar a algumas células – PMNs e alguns linfócitos. igd Estrutura: IgD existe somente como um monômero. Propriedades: a. IgD é encontrada em baixos níveis no soro; seu papel no soro é não está totalmente estabelecido. b. IgD encontrada em superfícies de célula B onde funciona como um receptor para antígeno. IgD na superfície de células B tem aminoácidos extras na região C-terminal para ancoramento à membrana. Ela também se associa com as cadeias beta de Ig- alfa e Ig-beta. c. IgD liga complemento. igE Estrutura: IgE existe como um monômero e tem um domínio extra na região constante. Propriedades: a. IgE é a Ig sérica menos comum, uma vez que se liga fortemente com receptores de Fc em basófilos e mastócitos mesmo antes da interação com o antígeno. b. Envolvida em reações alérgicas – Como consequência da sua ligação a basófilos e mastócitos, IgE é envolvida em reações alérgicas. Ligação do alergeno à IGe nas células resulta na liberação de vários mediadores farmacológicos que resulta em sintomas alérgicos. c. IgE também participa em doenças parasitárias por helmintos. Uma vez que os níveis sorológicos de IgE aumentam em doenças parasitárias, a quantificação dos níveis de IgE auxilia no diagnóstico de infecções parasitárias. Eosinófilos têm receptores de Fc para IgE e a ligação de eosinófilos a helmintos cobertos por IgE resulta na morte do parasita. d. IgE não fixa complemento. 32 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA figura 8 – Classes de Imunoglobulinas. fonte: < http://www.rbi.fmrp.usp.br/imunobiol/aulas/t3.htm> Funções das imunoglobulinas a. Neutralização de toxinas O reconhecimento do antígeno é realizado pela interação do determinante antigênico com o sítio do anticorpo especifico. Em geral, os sítios combinatórios dos anticorpos são direcionados contra bactérias, fungos, vírus e seus produtos. Reconhecem também epítopos presentes em parasitas protozoários e metazoários. A interação entre um antígeno (por exemplo: presente na superfície de uma bactéria), com o anticorpo por si só não leva necessariamente a sua destruição. Como exceção, temos a interação entre certas toxinas bacterianas (como a diftérica ou tetânica) e anticorpo, onde ocorre completa neutralização do produto microbiano. A neutralização da toxina, nestes casos, é suficiente para impedir os sintomas das doenças que são mediados pela toxina. A ligação antígeno-anticorpo, em geral, prepara para a etapa efetora que é mediada por outros agentes. b. Aglutinação Os produtos do sistema complemento também alteram a superfície dos organismos invasores, induzindo-os aderir uns aos outros, promovendo assim a aglutinação (prendem vários antígenos ao mesmo tempo). c. Citotoxidade celular dependente de anticorpo Anticorpos específicos ao interagirem com epítopos de membrana de uma célula- alvo podem dar origem a um fenômeno denominado ADCC (do inglês antibody 33 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II dependent cell mediated cytotoxicity), que pode ser mediado por granulócitos. Há experimentos in vitro que descrevem a morte de esquistossomos após opsonização por anticorpo IgE e atividade ADCC mediada por eosinófilos. d. Opsonização por IgG Na fagocitose é necessário o envolvimento entre componentes da partícula a ser interiorizada e receptores de membrana da célula fagocitária. Assim, um microrganismo pode ser reconhecido por células fagocitárias através de receptor para manose, que reconhece resíduos deste açúcar na superfície da partícula a ser ingerida, quando a partícula estranha estiver opsonizada por anticorpos específicos do isotipo IgG. O processo se torna muito mais eficiente em virtude da existência de receptores de membrana dos fagócitos que reconhecem a região Fc da IgG. A opsonização por anticorpos IgG não somente aumenta expressivamente a taxa de fagocitose (número de partículas ingeridas por fagócito) como também pode levar a um aumento da digestão da partícula ingerida (no fagossomo) por ativação do metabolismo da célula fagocitária. e. Lise Um dos mais importantes produtos da cascata do complemento é o complexo lítico, que por definição é a combinação de múltiplos fatores do complemento sendo designado C5b6789. Seu efeito é direto na ruptura das membranas celulares de bactérias e outros organismos invasores. Enzimas e outros produtos do complemento atacam as estruturas de alguns vírus tornando-os não virulentos. f. Quimiotaxia O fragmento C5a induz a quimiotaxia pelos neutrófilos e macrófagos, promovendo a migração de grandes quantidades desses fagócitos para o local do agente antigênico. g. Ativação de mastócitos e basófilos e eosinófilos Os fragmentos C3a, C4a e C5a ativam os mastócitos e basófilos, induzindo-os a liberar histamina, heparina e várias outras substâncias para os fluidos locais. Como consequência, há um aumento no fluxo sanguíneo local, extravasamento de líquido e proteína plasmática para os tecidos e, de reações teciduais locais que ajudam a inativar e imobilizar o agente antigênico.Os mesmos fatores desempenham papel importante na inflamação e na alergia. h. Efeitos inflamatórios Além dos efeitos inflamatórios causados pela inflamação dos mastócitos e basófilos, a ação de vários outros produtos do complemento contribuem para a inflamação local induzindo o aumento do fluxo sanguíneo já estava aumentado, aumentando o extravasamento de proteínas a partir dos capilares e a favorecendo a coagulação de proteínas nos espaços teciduais, evitando assim a movimentação do organismo invasor através dos tecidos. 34 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA Anticorpos monoclonais Por definição anticorpos monoclonais (mAbs, na sigla em inglês) são anticorpos produzidos por um único clone de um linfócito B parental, sendo idênticos em relação em suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Foi descrito pela primeira vez em 1975, em artigo na revista Nature por César Milstein e Georges Köhler que dividiram o Prêmio Nobel de Medicina no ano de 1984 com o dinamarquês Niels Kaj Jerne. Os mAbs são produzidos em ambiente laboratorial com linfócitos B gerados por camundongos com sistemas imunológicos estimulados pelos antígenos de interesse. São chamados de anticorpos murinos que usados de forma continuada durante uma terapia, estimulam uma reação imunológica ao anticorpo próprio. Dessa forma, o uso dos mAbs ficou limitado durante duas décadas à produção de kits para diagnósticos ou à pesquisa científica (Figura 9). Esse problema foi resolvido com a humanização dos anticorpos murinos por modernas técnicas de engenharia genética. Na técnica, os genes responsáveis pela produção dessas proteínas são modificados de forma a eliminar essa reação imunológica do organismo humano. O processo de humanização não deve alterar a afinidade do anticorpo com o respectivo antígeno e possibilita assim a sua aplicação continuada em procedimentos terapêuticos. Os mais significativos avanços no uso de mAbs se encontram na área de oncologia, uma vez uma nova geração de medicamentos em desenvolvimento está baseada na capacidade dos mAbs em reconhecer antígenos específicos de tumores e induzir uma resposta imune contra as células cancerosas. Mais ainda, os mAbs podem ser modificados e atuarem como portadores de radioisótopos ou toxinas às células tumorais ampliando, assim, seu espectro de aplicação terapêutica. figura 9 – Mostra a técnica para produção de anticorpos monoclonais a partir de hibridomas. fonte: <biologia12eportefolio.blogspot.com> 35 CAPÍtuLo 2 reação de precipitação e aglutinação título do anticorpo A produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada às diluições dos soros utilizadas para a realização do teste, já que os ensaios não são quantitativos. Nestes ensaios, as partículas antigênicas são misturadas com seriadas diluições do soro do paciente e como resultado de produção de anticorpos considera-se a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. Esta diluição é chamada de título do anticorpo. Por exemplo, se estudarmos a produção de anticorpos contra espécies de Leishmania, que causam calazar, em uma população de área endêmica do Brasil é comum ser observada aglutinação de formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na maioria das pessoas. Este resultado é porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium, Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que apresentam reação cruzada com Leishmania donovani. De forma contrastante, o soro de pacientes infectados, que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6400 (título). Como pode ser observado, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica é de 1:600 enquanto nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes. imunoprecipitação As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar precipitações resultantes da interação antígeno-anticorpo, ambos inicialmente solúveis. Nessa técnica é necessário que a molécula antigênica seja multivalente quanto ao numero de epítopos e, preferencialmente, os anticorpos sejam policlonais. Para anticorpos monoclonais, a especificidade única exige que o epítopo esteja acessível e presente em quantidade grande na molécula. Os anticorpos policlonais derivam de diferentes linhagens de linfócitos B, isto é, são imunoglobulinas com estruturas diferentes, produzidas em resposta a um antígeno específico, cada uma com especificidade para um epítopo diferente desse antígeno. Dado que a maioria dos antígenos é muito complexa e possui numerosos epítopos que são reconhecidos por diferentes linfócitos, cada linfócito é ativado para proliferar e se diferenciar em plasmócitos resultando em anticorpos com resposta policlonal. Entre os vários fatores físico-químicos e imunológicos que interferem na quantidade de precipitado formado, os principais são as concentrações de relativas de antígeno e de anticorpo. O máximo de precipitação é observado quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, diminuindo na presença de excesso de um ou outro componente. 36 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA A curva de precipitação clássica pode ser obtida quando ao anticorpo e concentração constante se adiciona o antígeno em diferentes concentrações apresentando aspecto parabólico (Figura 10). A precipitação será máxima na zona de equivalência ou de proporções ideais de antígeno e anticorpo, e à medida que se adiciona mais antígeno, o imunocomplexo se dissolve. A zona de excesso de anticorpo (ou falta de antígeno) é chamada de pró-zona e proporciona resultado falso-negativo para a pesquisa de anticorpo. Essa falha é inaceitável, pois justamente quando há mais anticorpos o resultado será negativo. Para solucionar esse problema, devem ser utilizadas diferentes diluições do anticorpo diante da concentração fixa do antígeno. figura 10. Curva de precipitação: quantidade de precipitação formada na interação antígeno-anticorpo com concentração fixa de anticorpo (vermelho) e quantidade crescente de antígeno (verde). Na zona de equivalência se observa o imunocomplexo na sua máxima estrutura de malha, permitindo que o imunoprecipitado seja visível, especialmente em meio gelidificado. Nas zonas de excesso de anticorpo (pró-zona) ou de excesso de antígeno (pós-zona) o tamanho molecular dos imunocomplexo não permite sua visualização, gerando resultados falso-negativos. fonte: Imunoensaios cap. 5. A visualização de precipitados em meio líquido é difícil, pois tanto as amostras de soros com anticorpos quanto às soluções antigênicas apresentam turvação e coloração próprias e variáveis. As técnicas manuais de precipitação atualmente e uso são realizadas em meio gelidificado, o que facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação. No entanto, requerem períodos de horas a dias para a migração molecular e a formação do imunocomplexo. imunoaglutinação Fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas de precipitação, diferindo na adsorção do antígeno ou do anticorpo a micropartículas insolúveis ou células e permitindo leitura visual e rápida. A técnica não permite discriminar frações dos componentes antigênicos como a imunoprecipitação, mas permite a utilização de antígenos purificados e complexos fixados a micropartículas ou células. Além disso, pode ser mais sensível que a imunoprecipitação e permite a detecção de pequenas quantidades de anticorpos, especialmente nas técnicas de microaglutinação. 37 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II A característica mais marcante da imunoaglutinação é que seja o anticorpo ou antígeno é apresentadona forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células, ou adsorvido artificialmente a micropartículas ou células. Pode ser direta ou indireta (Figuras 11 e 12). Teste de aglutinação ocorre quando há a formação de agregados suficientemente grandes de micropartículas ou células com múltiplos determinantes antigênicos (ou anticorpos), interligados por pontes moleculares de anticorpos (ou antígenos). Ocorrem várias interações entre os sítios combinatórios idênticos (dos anticorpos) simultaneamente com determinantes antigênicos iguais. Estes agregados facilitam a visualização do imunocomplexo, que pode ocorrer em questão de minutos ou algumas horas, e a leitura pode ser a olho nu ou lupa. A execução da técnica pode ser determinada em tubo, lamina ou placa de micro cavidades, sempre com o envolvimento de diferentes fatores na formação dos agregados, tais como: » classe do anticorpo envolvido; » concentração iônica e pH do meio; » presença de macromoléculas, íons, enzimas e conservantes; » tempo e temperatura; » padronização adequada da suspensão de micropartículas ou células; » concentração ótima do antígeno ou anticorpo a ser fixado nas micropartículas ou células; » estabilidade da ligação do antígeno/anticorpo e acessibilidade dessa molécula nas micropartículas ou células. Como vantagens da reação de imunoaglutinação temos: » elevada sensibilidade; » baixo custo; » leitura visual; » facilidade de execução; Podemos ainda listar algumas desvantagens: » reprodutibilidade dos lotes de reagentes; » acessibilidade molecular para interação antígeno-anticorpo; » estabilidade da ligação do antígeno-anticorpo no suporte; 38 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA figura 11 – Imunoaglutinação direta. Modificado de: <http://www.abah.com.br/content/ABAAABM8oAE/imunoprecipitacao#> figura 12 – Imunoaglutinação indireta (passiva). Modificado a partir de: <http://www.abah.com.br/content/ABAAABM8oAE/imunoprecipitacao#>. 39 CAPÍtuLo 3 quantificação da concentração antigênica ou de anticorpos Historicamente, os ensaios imunológicos foram e têm sido os principais responsáveis pelo conhecimento que se tem do sistema imune. Além deste aspecto relacionado ao conhecimento científico básico, estes ensaios são importantes na clínica para a detecção de infecções, de doenças autoimunes e de estados de imunodeficiência. Podem ainda ser utilizados para detectar a presença de antígenos (além de anticorpos), na diferenciação do estágio de uma doença de acordo com a classe de Ig produzida, na seleção de doadores e receptores de órgãos para transplantes, na avaliação do prognóstico da doença, no sucesso de um tipo de terapia etc. A amplitude da realização de ensaios imunológicos permite a utilização de técnicas não quantitativas que são visualizadas por meio de reações de precipitação e aglutinação; podem, ainda, utilizar técnicas quantitativas, com a utilização de marcadores enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase, citometria de fluxo) ou radioisótopos (Radioimunoensaio). Os testes de precipitação e aglutinação são menos sensíveis que os ensaios imunoenzimáticos, porque os complexos Antígeno-Anticorpo para serem visualizados precisam apresentar um tamanho adequado. Na prática, os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis (proteínas, glicoproteínas) enquanto os de aglutinação para a detecção de antígenos particulados (hemácias, bactérias, células diversas). radioimunoensaio (riA) O radioimunoensaio é considerado um método de alta sensibilidade na análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo. Ele permite medidas rápidas e precisas mesmo em preparações não purificadas. Também apresenta limiar de detecção na ordem de nanogramas ou picogramas. Entre as limitações do ensaio destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional. Na rotina pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Encontramos inúmeras variações deste ensaio, contudo o princípio utilizado é o mesmo, ou seja, a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra (Figura 13). radioimunoensaio direto No radioimunoensaio direto, coloca-se uma quantidade fixa e limitada de anticorpo que é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. O antígeno não ligado é removido após um período de incubação e faz-se a 40 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva. radioimunoensaio de competição No radioimunoensaio de competição, coloca-se uma quantidade fixa do antígeno em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. O anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem, após um período de incubação, e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva. radioimunoensaio de captura No radioimunoensaio de captura, coloca-se uma quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após um período de incubação remove-se o antígeno não ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva. No radioimunoensaio clássico os reagentes são: » o anticorpo; » o antígeno marcado; » o antígeno frio contido nas amostras e padrões. figura 13: Radioimunoensaio fonte: Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica, capítulo 6. 41 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II Aplicações » Testes que necessitem de alta sensibilidade; » triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue; » pesquisa; » pesquisa de drogas na urina ou soro de atletas ELiSA (Enzyme-Linked immunoassay) O ensaio de ELISA é um dos tipos de testes mais empregados nos laboratórios hoje em dia, visto que oferece simplicidade, sensibilidade e dependendo do kit a especificidade superior a de vários testes. A metodologia deste ensaio se mostrou tão eficaz, a ponto de substituir os testes de Radioimunoensaio (RIA), justamente por ser um teste mais estável e permitir o armazenamento do kit por um período bem maior sem que seus reagentes sofram degradação. Os testes de ELISA podem ser classificados em testes Homogêneos e Heterogêneos. Nos testes homogêneos, a atividade enzimática é alterada como parte de uma reação imunológica. Neste tipo de ensaio não há necessidade de separar o imunocomplexo formado dos imunoreagentes livres. As técnicas homogêneas são especialmente elaboradas para a dosagem de drogas e haptenos, mas não tiveram seu uso difundido nos laboratórios de análises clínicas, já que este apresenta problemas na dosagem de proteínas. Por outro lado, os ensaios heterogêneos são amplamente empregados na imunologia. Neste tipo de ensaio, a atividade enzimática do imunoreagente marcado não está diretamente envolvidana reação propriamente dita; no entanto, os reagentes ligados e os reagentes livres devem ser separados uns dos outros. Ensaios de ELiSA heterogêneos O princípio básico do ELISA heterogêneo se baseia no uso de um antígeno ou anticorpo conjugado com uma enzima que, ao reagir com seu substrato, dá origem a um produto colorido, quimioluminescente ou fluorescente. Se for usado o método colorimétrico, a mudança de cor é monitorada a olho nu ou com o uso de um espectrofotômetro para determinar a proporção entre a quantidade de cor produzida e a quantidade de analito presente. Existe uma quantidade enorme de materiais que podem ser usados como suporte para a colocação do antígeno ou do anticorpo. O mais comum é se fazer uso de microplacas de poliestireno, pois estas, além de serem pequenas, evitando desperdício de material, permitem que se faça a análise de uma grande quantidade de amostras (Figura 14). A técnica de ELISA heterogênea é feita com algumas etapas de lavagem, como forma de separar os imunoreagentes ligados dos que não estão ligados. Esta técnica permite ainda se fazer uso de ensaios competitivos e não competitivos, podendo ainda dosar antígenos ou anticorpos, neste último caso, todos os isotipos de anticorpos podem ser dosados, tudo depende da especificidade do anticorpo usado. 42 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA figura 14: Ensaio de ELISA heterogêneo fonte: <www.liaccentralsorologica.com.br>. Ensaios competitivos Rotineiramente este tipo de ensaio é usado para se dosar antígenos, neste caso eles possuem fixados ao suporte sólido anticorpos ou antígenos específicos. Estes métodos são também chamados de métodos de reagente limitados, pois o antígeno e o anticorpo são usados em quantidades limitadas. Quando o ensaio usa um anticorpo específico fixado na fase sólida, adiciona-se a amostra do paciente contendo o antígeno mais o antígeno marcado, com isso eles irão competir pelo anticorpo fixado na fase sólida. Com a dosagem da amostra do paciente procede-se a um controle do reagente, onde se adiciona apenas o antígeno marcado com um tampão na fase sólida, com isso tem-se o parâmetro negativo para, assim, poder comparar com o resultado obtido com a amostra do paciente. Isto é necessário, pois o sinal detectado na amostra do paciente é inversamente proporcional à quantidade de analito presente na amostra, ou seja, quanto mais analito na amostra, menor o sinal. Existem variações do ensaio competitivo em que o antígeno é fixado na fase sólida e o ensaio pode ser realizado em duas etapas. Nesse caso, numa primeira fase adiciona-se o soro do paciente no suporte, incuba- se, posteriormente procede-se à lavagem para a remoção de tudo que não ficou ligado ao suporte sólido, e então adiciona-se o conjugado e procede-se à nova incubação. Nesta etapa, o conjugado irá se ligar ao antígeno livre do suporte sólido, posteriormente, procede-se a uma nova lavagem e executa-se a fase de revelação e leitura (Figura 15). Os ensaios competitivos são ideais para dosagem de moléculas relativamente pequenas que podem ser obtidas com relativa pureza em grandes quantidades, a fim de serem marcadas com uma enzima. Como os ensaios competitivos requerem pequenas quantidades de anticorpo, eles são ideais para o uso em sistemas que há pequenas quantidades de anticorpo. 43 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II figura 15: ELISA competitivo fontes: <http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html> e <http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html>. Ensaios não competitivos indiretos Temos neste tipo de ensaio um dos mais empregados nas rotinas laboratoriais de análises clínicas. Assim como os ensaios competitivos, eles podem usar antígenos ou anticorpos fixados a fase sólida. Quando se faz uso de um antígeno fixado a fase sólida, o anticorpo específico presente na amostra se ligará a este. Posteriormente o anticorpo será detectado com a adição de uma imunoglobulina marcada específica para o anticorpo em questão. Se compararmos os testes competitivos com os não competitivos, veremos que estes oferecem maior especificidade e menor sensibilidade; no entanto, isto é, dependente da afinidade e pureza dos reagentes imunológicos. Para detectar diferentes isotipos de imunoglobulina, são utilizadas imunoglobulinas marcadas específicas para um determinado isotipo. Este tipo de ensaio é muito empregado quando se deseja detectar anticorpos para um determinado agente infeccioso ou autoanticorpos (Figura 16). Para este tipo de teste, pode-se usar suporte de microplacas de poliestireno, nitrocelulose, esferas e microesferas. Quando um anticorpo é ligado à fase sólida, estes ensaios são classificados de ensaios de captura ou sanduíche, pois o antígeno presente na amostra, que pode ser um anticorpo também, será capturado pelo anticorpo fixado ao suporte sólido. Posteriormente adiciona-se um anticorpo marcado para um epítopo diferente do antígeno em questão, que completará o sanduíche. Existem inúmeras variações deste tipo de ensaio. O antígeno capturado pode ser uma imunoglobulina qualquer, uma proteína viral ou um antígeno qualquer que tenha, no mínimo, dois epítopos diferentes. Este tipo de ensaio requer que uma grande quantidade de anticorpo esteja fixada na fase sólida, no entanto, oferece uma grande sensibilidade. Os ensaios de ELISA não competitivos podem ser modificados para incorporar camadas adicionais de reagentes imunes, com isso se obtém o aumento na sensibilidade do ensaio, no entanto, isto acaba influenciando no custo e no tempo de execução do teste. A aplicação mais comum é o complexo avidina-biotina, que proporciona um aumento significativo na sensibilidade do teste. O anticorpo 44 UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA biotinilado é normalmente usado como o segundo anticorpo do sanduíche. Ele então é posto para reagir com uma mistura previamente preparada de avidina e peroxidase biotinilada. Esta peroxidase pode ser desenvolvida com agentes quimioluminescentes como forma de aumentar a sensibilidade. figura 16: ELISA não competitivo fonte: http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html. outras variações do ELiSA Uma das variantes do ELISA é a que usa a membrana de nitrocelulose como suporte sólido, chamada de ensaio Dot Blot. Neste tipo de ensaio, o antígeno ou anticorpo é fixado à membrana. Normalmente esta reação é observada pela produção de um produto colorido na membrana, este é apenas um ensaio qualitativo. Os ensaios de Dot Blot podem ser modificados de forma a apresentar uma maior sensibilidade e podem-se tornar semi-quantitativos desde que se use um densitômetro para ler a cor da reação. Problema: solução possível Densidade ótica do controle do PBS elevado. Aumentar o número de lavagens. Densidade ótica do controle negativo elevado. Bloquear os sítios da fase sólida que não reagiram; aumentar a diluição do conjugado. Substituir o conjugado por um de maior pureza. Adicionar de 1 a 5% de soro normal da mesma espécie usada no conjugado ao tampão de diluição; trocar o tipo de suporte usado. 45 IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II Controle positivo com valores baixos. Tenha certeza de que o suporte usado é o correto. Aumente a pureza do anticorpo ou do antígeno de captura; aumente o tempo de ou a temperatura de incubação, verificando antes se ambas estão corretas. Quando a amostra está pouco diluída, apresenta um resultado moderado, no entanto, quando está muito diluída, apresenta um valor fora da escala de leitura do aparelho. Dilua mais a amostra. O ensaio apresenta valores baixos para tudo (amostra e controles). Verifique a integridade do substrato e do tampão, certifique-se se o pH do
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