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Imuno-hematologia e Imunologia Clínica

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Brasília-DF. 
Imuno-hematologIa
e ImunologIa ClínICa
Elaboração
Eliseu Frank de Araújo
Julio Cesar Pissuti Damalio
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração
Sumário
APrESEntAção ................................................................................................................................. 4
orgAnizAção do CAdErno dE EStudoS E PESquiSA .................................................................... 5
introdução.................................................................................................................................... 7
unidAdE i
IMUNOHEMATOLOGIA ........................................................................................................................... 9
CAPÍtuLo 1
SISTEMA ABO ........................................................................................................................... 9
CAPÍtuLo 2
SISTEMA RH ............................................................................................................................ 17
unidAdE ii
IMUNOLOGIA CLÍNICA ........................................................................................................................ 26
CAPÍtuLo 1
ANTICORpOS ......................................................................................................................... 26
CAPÍtuLo 2
REAçãO dE pRECIpITAçãO E AGLUTINAçãO ......................................................................... 35
CAPÍtuLo 3
QUANTIfICAçãO dA CONCENTRAçãO ANTIGêNICA OU dE ANTICORpOS ............................. 39
CAPÍtuLo 4
IdENTIfICAçãO dE ANTÍGENOS EM CéLULAS E ANTÍGENOS .................................................... 52
CAPÍtuLo 5
METOdOLOGIAS COM USO dE BIOLOGIA MOLECULAR .......................................................... 62
CAPÍtuLo 6
dIAGNóSTICOS LABORATORIAIS (MINISTéRIO dA SAúdE) ......................................................... 67
PArA (não) FinALizAr ..................................................................................................................... 81
rEFErênCiAS .................................................................................................................................. 82
4
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem 
necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela 
atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade 
de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos 
a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma 
competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para 
vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar 
sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a 
como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
5
organização do Caderno 
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de 
forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões 
para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao 
final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e 
pesquisas complementares.
A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos 
e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes 
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor 
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita 
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante 
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As 
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.
Sugestão de estudo complementar
Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, 
discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.
Praticando
Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer 
o processo de aprendizagem do aluno.
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a 
síntese/conclusão do assunto abordado.
6
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões 
sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o 
entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
Exercício de fixação
Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/
conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não 
há registro de menção).
Avaliação Final
Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso, 
que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única 
atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber 
se pode ou não receber a certificação.
Para (não) finalizar
Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem 
ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.
7
introdução
Historicamente a Imunologia surgiu como um ramo da microbiologia e conquistou seu espaço com 
os estudos das doenças infecciosas e suas respectivas respostas. A nossa capacidade de coexistir 
com diversos micro-organismos de nosso ambiente depende de um conjunto de fatores, e um destes 
fatores é o Sistema Imune.
O Sistema Imune, por sua vez, é como um conjunto de células de defesa e/ou ataque eficaz que tem 
a capacidade de distinguir os sinais de perigo para o organismo e protegê-lo contra estes patógenos 
oportunistas. Esta distinção ocorre por comunicação por meio de sinais mediados por citocinas e 
receptores. As células do Sistema Imune estão distribuídas por todo organismo, alojadas nos tecidos, 
e desempenham o papel de sentinelas e circulando por vasos sanguíneos e linfáticos esperando o 
sinal de que o organismo foi invadido.
A Imunologia Clínica tem o objetivo de investigar e orientar o clínico na apuração de diagnósticos das 
patogenicidades por meio de resultados de exames laboratoriais. Para tanto é necessário conhecer 
as estratégias traçadas pelo Sistema Imune, no que tange ao controle e/ou eliminação dos diferentes 
patógenos, além de saber as estratégias de evasão utilizadas pelos patógenos para driblar a defesa e 
o ataque do Sistema Imune.
Obviamente, sob o ponto de vista imunológico, um determinado agente infeccioso não precisa 
se restringir a uma única estratégia patogênica, de modo que a resposta imune eficiente contra o 
determinado micro-organismo pode incluir diversos mecanismos.
objetivos
 » Reconhecer o sistema ABO e seus componentes: antígenos e anticorpos. 
 » Entender a importância do sistema ABO na prática transfusional.
 » Reconhecer do sistema Rh e seus componentes: antígenos e anticorpos. 
 » Entender o Teste de Coombs direto e indireto. 
 » Conhecer a caracterização da Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN) e 
suas implicações em gestações de risco. Antígeno D fraco e parcial.
 » Reconhecer osanticorpos: classes e funções das Igs.
 » Reconhecer as aplicações dos testes imunológicos mais utilizados em Análises 
Clínicas;
 » Caracterizar diagnósticos laboratoriais de várias doenças, de acordo com o 
Ministério da Saúde. 
9
unidAdE iiMunoHEMAtoLogiA
CAPÍtuLo 1
Sistema ABo
É de suma importância a compreensão dos sistemas antigênicos das células sanguíneas. Além das 
aplicações práticas da genética da célula sanguínea, como transfusões de sangue, transplantes e 
estudos com fins antropológicos, a investigação dos antígenos das hemácias oferece uma visão 
ampla de outros aspectos mais básicos da biologia humana. 
O conhecimento de antígenos e anticorpos plaquetários e granulocíticos é menos completo. 
Foram descritos antígenos específicos de plaquetas e granulócitos, contudo a tipagem para esses 
antígenos não está em uso rotineiro. Em contraste, os antígenos de superfície dos linfócitos foram 
estudados mais detalhadamente durante as últimas três décadas. Os antígenos do complexo de 
histocompatibilidade maior são importantes na moderna prática transfusional, mas o estudo 
desse sistema tem um significado mais amplo e levou a um insight dos mecanismos genéticos da 
imunorregulação, transplante e doença.
o Sistema do grupo Sanguíneo ABo
Histórico
Historicamente, a separação dos indivíduos em grupos de acordo com os antígenos presentes 
em suas hemácias foi demonstrada pela primeira vez em 1900–1901, pelo médico austríaco Karl 
Landsteiner. Ao reagir amostras de sangue de diversas pessoas, isolou eritrócitos fazendo diferentes 
combinações entre plasma e hemácias. Encontrou como resultado a presença de aglutinação dos 
glóbulos em alguns casos e sua ausência em outros. Dessa forma, Karl Landsteiner classificou os 
seres humanos em 3 grupos sanguíneos distintos, a saber, A, B e O, e ainda explicou o fato de 
algumas pessoas morrerem depois de transfusões de sangue e outras não. Mais tarde, em 1902, o 
grupo sanguíneo AB foi descrito por von Decastello e Sturli. 
Destaca-se como importante no Sistema ABO, na prática transfusional, o fato de ser esse o sistema 
que possui maior capacidade de provocar a produção de anticorpos, ou seja, é o mais antigênico. 
Como os eritrócitos humanos não expressam moléculas HLA de classe I e II, essas moléculas de 
10
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
superfície altamente polimórficas têm pouca consequência na transfusão sanguínea. A maior 
barreira imunogenética se constitui, então, nos polimorfismos estruturais nos carboidratos dos 
glicolipídios de superfície das hemácias, cujas diferenças antigênicas são a base do sistema ABO.
Vídeo-aula sobre o sistema ABO 
Antígenos de hemácias
A composição antigênica das hemácias é importante na terapia transfusional. 
Na prática transfusional rotineira, os testes determinam a compatibilidade entre o doador e o receptor 
dos antígenos de grupos sanguíneos de significado clínico. Os anticorpos que reagem com antígenos 
de hemácias podem provocar graves problemas clínicos, entre eles as reações transfusionais 
hemolíticas, a doença hemolítica do recém-nascido e as anemias hemolíticas autoimunes.
Alguns antígenos já são bem definidos bioquimicamente e dividem-se em 2 grupos: carboidratos 
(em que um gene codifica a formação de enzimas que adicionarão açúcares a substratos específicos 
– ABO) ou proteicos (decorrentes de ação direta de um gene – Rh).
Constituição dos anticorpos
Os anticorpos do Sistema ABO – usualmente chamados de aglutininas – estão presentes no plasma 
de indivíduos, contra os antígenos que eles não possuem em suas hemácias, classificados assim de 
anti-A e anti-B.
Esses anticorpos são formados naturalmente contra antígenos que não estão presentes nas 
hemácias. Os estímulos são passivos, gerados por bactérias que colonizam o trato intestinal a partir 
do nascimento. Geralmente, os anticorpos do Sistema ABO são misturas de IgM e IgG (Unidade 
II). Tanto anticorpos ABO classe IgM ou IgG, são capazes de desativar o sistema complemento, 
provocando hemólise intravascular em transfusões incompatíveis.
Indivíduos pertencentes ao grupo de sangue tipo AB não tem anticorpos anti-A ou anti-B. Já os 
indivíduos portadores de sangue tipo A possuem anticorpos anti-B, os pertencentes ao grupo B 
possuem anticorpos anti-A e os indivíduos do grupo O, finalmente, possuem as aglutininas anti-A 
e aglutininas anti-B.
11
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
determinação do grupo sanguíneo ABo
A determinação do grupo sanguíneo é realizada pela identificação de antígenos nas hemácias, usando 
anticorpos anti-A e anti-B. Essa técnica, chamada de tipagem direta, permite que os anticorpos 
sejam reconhecidos na superfície das hemácias, dividindo as pessoas em quatro grupos: sangue A, 
B, O e AB (Figura 1).
figura 1 – determinação do Sistema ABO.
fonte: Immunohematology (Quinley).
transfusões sanguíneas no sistema ABo
A divisão das transfusões sanguíneas no Sistema ABO pode ser feita em dois grandes conjuntos: 
1) isogrupo, quando doador e receptor são do mesmo grupo de acordo com o sistema ABO, e 2) 
heterogrupo, quando o doador e receptor são de grupos sanguíneos diferentes. A escolha do sangue 
deve levar em conta que o indivíduo não pode ser transfundido com um sangue que possua um 
antígeno que ele não tem, justamente porque o anticorpo presente no seu plasma irá reagir contra 
as hemácias transfundidas. 
12
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
O esquema abaixo mostra as transfusões possíveis quanto ao sistema ABO (Figura 2):
figura 2 – Transfusões do Sistema ABO.
fonte: imunofarma.blospot.com – abril/2013.
É interessante abordar que o grupo sanguíneo O pode ser doado para todos os grupos existentes; 
sendo denominados doadores universais. Entretanto, indivíduos portadores do sangue O não 
podem receber sangue de nenhum outro grupo – apenas do seu próprio grupo. O grupo AB, por sua 
vez, pode receber sangue de qualquer outro tipo, constituindo-se receptores universais.
genética
Os antígenos A e B são herdados segundo a Lei de Mendel. O grupo ABO de um indivíduo é 
determinado pela presença de um (homozigótico) ou dois (heterozigótico) dos três alelos: A, B e H, 
cujo gene está localizado no cromossomo 9 (Tabela 1).
Tabela 1 – Genética do Sistema ABO. 
Fenótipo Genótipo Antígenos de hemácias Anticorpos
O
A
B
AB
OO
AO ou AA
BO ou BB
AB
(H)
A
B
A+B
Anti-A+Anti-B
Anti-B
Anti-A
nenhum
fonte: Métodos de laboratório aplicados à clínica, 2009.
13
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Acesse o site http://djalmasantos.wordpress.com/2011/04/30/testes-de-
genetica-35/, publicado pelo Professor Djalma Santos, e observe os vários testes de 
genética. 
Bioquímica
É importante destacar que os produtos dos genes A e B não são os antígenos A e B por si; as 
glicosiltransferases têm como função modificar a membrana celular e levar à síntese dos antígenos 
A e B. Existe uma substância precursora na forma de cadeia lateral oligossacarídica associada com 
glicoesfingolipídeos e glicoproteínas de membrana. Após conversão dessa substância precursora na 
substância H, o precursor imediato dos antígenos A e B está sob influência dos alelos H e h, que 
são herdados independentemente do gene determinando o tipo ABO. O H é comum; o h é raro. Em 
dose simples ou dupla, o gene H apresenta uma enzima, a H-transferase, que converte a substância 
precursora em substância H. A presença de um alelo A ou B determina a atividade da A ou B-transferase 
correspondente, que subsequentemente converterá a substância H em antígeno A ou B.
Quando o antígeno A ou B está ausente das hemácias, o anticorpo correspondente está presente no 
plasma. Ao nascimento, essas iso-hemaglutininas estão ausentes, mas desenvolvem-se durante os 6 
primeirosmeses de vida. Elas surgem como produto da exposição dos polissacarídeos semelhantes a 
ABO que são vistas em micro-organismos, sementes, plantas e outras fontes exógenas. Substâncias 
com atividade antigênica de A, B e H estão amplamente distribuídas nas hemácias, bem como em 
secreções e glândulas mucosas dos tratos gastrointestinal, respiratório e genital. 
Enzimas
A especificidade A, B ou H de uma hemácia é determinada pela atividade de enzimas geneticamente 
determinadas durante o desenvolvimento celular.
Assim, o alelo H determina a expressão de uma H-transferase (α2-L-fucosiltransferase) a qual adiciona 
um resíduo de fucose à galactose terminal da substância precursora produzindo substância H.
O alelo A, por sua vez, determina a expressão de A-transferase (α3-N-acetilgalactosaminiltransfera
se), adicionando N-acetilgalactosamina à galactose terminal da substância H.
Por fim, o alelo B determina a B-transferase (α3-D-galactosiltransferase), que transfere uma 
molécula de galactose na mesma posição.
A principal diferença entre as hemácias do grupo A e do grupo B é o resultado de diferenças 
estruturais entre essas duas moléculas de açúcar.
As hemácias do grupo O não expressam atividade de A-transferase nem de B-transferase. Nos 
indivíduos do grupo sanguíneo AB, estão presentes ambos os alelos A e B, com as duas transferases 
ativas e os dois sítios antigênicos com as especificidades A e B presentes na mesma molécula.
14
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
Antígenos ABo
Os antígenos A e B estão localizados na superfície externa da membrana da hemácia.
Vários antígenos têm especificidade A. A mais frequente é A1; 80% dos indivíduos do grupo A são 
A1 e 20% são A2. A2 e outras variantes reagem mais fracamente com soros de tipagem anti-A que as 
hemácias A1. São conhecidas também variantes mais fracas do grupo A, entre elas A3, Ax, Am, Aend, Ae1 
e outros, e elas constituem menos de 1% do fenótipo do grupo A .
Existem também variantes fracamente reativas do antígeno B, como B3, Bx e Bm1, mas elas ocorrem 
com menor frequência que as variantes do grupo A.
Anticorpos ABo (iso-hemaglutininas)
Em adultos, anticorpos IgM anti-A e/ou anti-B, de ocorrência natural e com especificidade 
complementar ao seu próprio grupo ABO, estão presente, devido a estímulos oriundos de antígenos 
vegetais e também bacterianos. Já em neonatos, os anticorpos IgM estão ausentes nos 3 a 6 primeiros 
meses de vida.
O soro do grupo O contém anti-A, anti-A1 e anti-B.
Determinação dos grupos sanguíneos do sistema ABO
1. Procedimento
TÉCNICA EM LÂMINA
 » Colocar uma gota de sangue homogeneizado, colhido com anticoagulante, em ambas as extremidades da lâmina.
 » Colocar uma gota do soro anti-A sobre a gota de sangue à esquerda da lâmina.
 » Colocar uma gota do soro anti-B sobre a gota de sangue à direita da lâmina.
 » Misturar as gotas com o auxílio de uma pazinha ou ponteira.
 » Fazer a leitura observando se houve ou não aglutinação.
TÉCNICA EM TUBO
 » Tomar 2 tubos de hemólise.
 » Colocar no primeiro tubo uma gota do soro anti-A.
 » Colocar no segundo tubo uma gota do soro anti-B.
 » Em cada um dos tubos adicionar uma gota da suspensão de hemácias a 5% do paciente.
 » Homogeneizar e centrifugar os tubos a 1.500 rpm durante 2 minutos.
 » Fazer a leitura observando se houve ou não aglutinação.
PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS A 5%
 » Em um tubo cônico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante + 9 mL de soro fisiológico (NaCl 0,85%).
 » Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos.
 » Desprezar o sobrenadante.
 » Repetir este procedimento mais 2 vezes.
 » A partir do sedimento de hemácias lavadas, preparar uma suspensão a 5% (50µL do sedimento de hemácias + 950 µL de soro 
fisiológico).
15
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
2. Interpretação
Grupo Sanguíneo Anti-A Anti-B
AB + +
A + -
B - +
O - -
Sinal + indica presença de aglutinação
Sinal – indica ausência de aglutinação
3. Significado clínico
Os grupos sanguíneos são determinados pela presença de antígenos na superfície das células, particularmente as hemácias. Estes antígenos 
possuem natureza bioquímica variada, podendo ser compostos de carboidratos, lipídios, proteínas ou uma mistura destas biomoléculas.
A determinação dos grupos sanguíneos tem importância em várias áreas da saúde:
 » Hemoterapia; medicina transfusional;
 » Neonatologia;
 » Antropologia;
 » Medicina forense etc.
Os tipos sanguíneos mais frequentes são “O+” e “A+”. O sistema ABO é o mais importante na prática transfusional por ser o mais 
imunogênico, seguido pelo sistema Rh.
testes laboratoriais para tipagem ABo
testes pré-transfusionais
a. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do doador
É obrigatória, em todas as unidades coletadas, a determinação estrita do grupo ABO, 
do tipo Rho (D), do antígeno D fraco (Du) nas Rho (D) negativo e dos testes para a 
exclusão das hepatites tipos B e C, doença de Chagas, sífilis, AIDS, anticorpos anti-
HTLV-I/II e anti-HBc. Testes para a pesquisa de anticorpos irregulares e dosagem 
de ALT/TOP devem ser realizados de forma complementar. Recomenda-se também 
a realização de testes para exclusão de malária, anemia falciforme e detecção de 
hemoglobinas anormais.
O sangue total e seus componentes não podem ser transfundidos antes da obtenção 
de resultados finais não reagentes, nos testes de detecção para Hepatites B e C, HIV-
1 e HIV-2, Doença de Chagas, Sífilis, HTLV-I e HTLV-II.
b. Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do receptor
O tratamento com o sangue do receptor deve ser igualmente considerado e 
classificado a fim de averiguar a compatibilidade imunológica entre o doador e o 
receptor. Realizam-se os testes para verificação do grupo ABO e Rh.
16
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
Verifica-se ainda a presença de anticorpos do receptor que potencialmente 
inviabilizariam a transfusão. Além disso, realizam-se os testes de Coombs direto e 
indireto (ver a seguir) e o teste da prova cruzada.
incompatibilidade do sistema ABo
As provas de compatibilidade fazem parte dos testes pré-transfusionais, isto é, fazem parte do 
procedimento que tem por finalidade verificar in vitro a compatibilidade eritrocitária entre o 
doador e o receptor. São executadas em meio de antiglobulina humana (AGH), entre o soro/plasma 
do doente e os eritrócitos do doador.
Essas provas identificam incompatibilidades causadas por anticorpos clinicamente significativos, 
em especial do sistema ABO, pela gravidade das reações transfusionais que provocam.
17
CAPÍtuLo 2
Sistema rh
Na prática transfusional, o sistema do grupo Rh só perde em importância para o ABO, sendo que foi 
descrito pela primeira vez por Levine e Stetson, em 1939.
O termo Rh veio dos resultados de Landsteiner e Wiener que, em 1940, demonstraram que coelhos 
imunizados com hemácias de macacos rhesus produziam um anticorpo que reagia com hemácias 
humanas.
O sistema Rh é um dos mais polimórficos dos grupos sanguíneos humanos. Os genes Rh estão 
localizados no cromossomo 1. Até o momento, não tem sua estrutura bioquímica totalmente 
elucidada. Trata-se de uma proteína com importante papel na integridade da membrana eritrocitária.
Os vários determinantes antigênicos do sistema Rh são produtos proteicos de um complexo sistema 
de genes polimórficos. O conceito de Fisher-Race (DCE) é simples e direto, mas fornece uma 
aproximação genética do sistema Rh e é conveniente para fins descritivos e para a interpretação da 
maioria dos problemas clínicos relacionados ao Rh.
De acordo com este modelo, três genes intimamente ligados determinam a especificidade das 
estruturas antigênicas responsáveis pelo tipo Rh das hemácias. Três alelos codominantes são D e 
d; Ce c; e E e e, com o complexo gênico inteiro sendo herdado como uma unidade. Os antígenos 
resultantes são denominados D, C, c, E e e. Um antígeno com atividade d nunca foi descrito e o alelo 
d é considerado amórfico.
A denominação Rh positivo aponta para a presença do antígeno D. A incidência do fenótipo 
D (Rh)-positivo entre os brancos é de 85% e os 15% que não possuem o D (e são geneticamente 
dd) são considerados Rh negativos. Entre os Rh-positivos, 42% são homozigotos (DD) e 58% são 
heterozigotos (Dd).
Anticorpos relacionados com esse antígeno são importantes na prática transfusional, pois o D é 
altamente imunogênico; o anti-D pode resultar em graves reações hemolíticas se constituindo uma 
importante causa de DHRN grave.
Os anticorpos contra os vários antígenos Rh geralmente se desenvolvem após uma exposição 
a hemácias estranhas, como em transfusões ou gestações, mas ocasionalmente podem ocorrer 
naturalmente. Esses anticorpos geralmente são da classe IgG (Unidade II), não fixam complemento, 
mas podem causar severa hemólise extravascular.
determinação do fator rh
O teste mais comum para se determinar o fator Rh é o Teste de Coombs, efetuado com o soro de 
mesmo nome. Pode ser direto ou indireto.
18
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
teste de Coombs direto
O teste de Coombs direto é atualmente chamado de teste de antiglobulina direta (TAD). Este teste 
avalia se a hemácia do paciente está sensibilizada com anticorpos ou com proteínas do sistema 
complemento. Para isso, 50 µL de hemácias a 5% são lavadas três vezes com solução salina 0,9% 
e o sobrenadante da última lavagem é totalmente desprezado. Ao botão das hemácias lavadas é 
acrescentada duas gotas de soro de Coombs (anti-IgG) ou preferencialmente antiglobulina humana 
(AGH). A utilização de AGH na fase de Coombs na pesquisa de anticorpos (direto ou indireto) 
possibilita a detecção de proteínas do sistema complemento.
Caso o resultado seja negativo, devem-se acrescentar ao tubo de reação duas gotas de hemácias 
humanas sensibilizadas com IgG e verificar se houve aglutinação. A positividade na prova de 
Coombs direto indica que a hemácia está sensibilizada e é recomendada a identificação da classe e 
do anticorpo. Para identificação de que o anticorpo é contra algum antígeno do sistema eritrocitário, 
este deve ser eluído dos antígenos do paciente e do eluato analisado (Figura 4).
figura 3: Teste de Coombs.
Modificado de: <http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html>. 
Acesso em: 17 abr. 2013.
19
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Um teste de Coombs direto utilizando anti-soro contra IgG é quase sempre positivo 
em:
 » mulheres com anticorpos anti-D circulantes;
 » recém-nascidos com doença hemolítica de Rh;
 » pacientes com imunodeficiência;
 » pacientes com anemia hemolítica induzida por alfa-metildopa;
 » pacientes com anemia hemolítica autoimune.
Resposta durante o curso, em nossas conversas on-line. Procure textos que te ajudem 
a encontrar a resposta!
teste direto da Antiglobulina (tdA) ou Coombs direto
O TDA tem por finalidade a detecção de anticorpos ou componentes do complemento fixados às 
hemácias in vivo ou in vitro.
Descrição da técnica:
1. Lavar as hemácias teste de 3 a 4 vezes em salina e preparar uma suspensão de 3 à 
5% em salina.
2. Identificar dois tubos (IgG, Poli) e acrescentar 1 gota de suspensão de hemácias em 
cada tubo.
3. Adicionar de 1 a 2 gotas do soro antiglobulina correspondente a cada tubo.
4. Misturar e centrifugar de 3.000 a 3.600 rpm por 15-20 segundos.
5. Ressuspender gentilmente e examinar a aglutinação. Registrar os resultados.
Quando o Coombs direto for negativo com a leitura imediata, deixar 15 minutos em temperatura 
ambiente, centrifugar e ler novamente.
Os resultados negativos deverão ser confirmados adicionando o controle de Coombs, centrifugando 
e observando a aglutinação:
 » controle de Coombs positivo valida o resultado negativo do Coombs direto;
 » controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado do Coombs 
direto é falso-negativo. Neste caso é necessário repetir a técnica.
20
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para realização de 
estudos. A presença de aglutinação indica que as hemácias podem estar sensibilizadas por anticorpos 
ou por componentes do complemento. Para se definir a especificidade do anticorpo devem ser 
aplicados testes de eluição.
teste de Coombs indireto
A prova de Coombs Indireto é chamada de Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) e avalia a 
presença de anticorpos irregulares circulantes no soro de doadores de sangue, receptores, gestantes, 
pacientes com suspeita de anemias hemolíticas por presença de anticorpos, entre outros (Figura 4).
figura 4 – Teste de Coombs Indireto.
fonte: < http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html>. Acesso em: 17 abr. 2013.
A pesquisa é realizada rotineiramente no soro de doadores de sangue e receptores, utilizando para 
isso hemácias comerciais fenotipadas do grupo O que apresentam os antígenos para os anticorpos 
irregulares mais frequentes. Esse teste é obrigatório nos serviços de hemoterapia porque, quando 
o doador apresenta anticorpos irregulares, esses estariam presentes na bolsa de hemocomponente, 
podendo reagir com suas hemácias do receptor caso encontrassem antígenos correspondentes.
No caso do receptor, é importante o teste, pois, caso esse tenha algum anticorpo irregular, é aconselhável 
a identificação por duas razões:
1. é possível direcionar a prova de compatibilidade para bolsas que sejam negativas 
para o antígeno, equacionando tempo e custos; 
2. caso o paciente seja um candidato a cirurgia, possibilita que o serviço de hemoterapia 
providencie com antecedência e tempo hábil as bolsa de sangue compatível.
21
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Sempre que a PAI é positiva, deve-se proceder à identificação da especificidade do(s) anticorpo(s) 
irregulares encontrado(s) no soro/plasma. A identificação de anticorpos irregulares deve incluir, 
obrigatoriamente, o meio no qual a PAI foi reativa.
A identificação de anticorpos irregulares (IAI) é realizada com o soro do paciente utilizando um painel 
de hemácias. Geralmente esse painel apresenta 11 hemácias, em suspensão de 3-5%, numeradas 
de 1 a 11. As hemácias do painel são do tipo O e possuem os antígenos contra os anticorpos mais 
frequentes em bancos de sangue. Acompanhando o painel vem um diagrama contendo o perfil 
fenotípico de cada uma das hemácias. A presença de aglutinação diante dos diferentes eritrócitos 
permite a identificação do anticorpo. Como exemplo: houve aglutinação nos tubos 1, 2, 3, 8, 10 e 11. 
Basta procurar em cada uma das colunas do diagrama o perfil de aglutinação obtido.
figura 5 – painel de hemácias.
fonte: http://pt.scribd.com/doc/54611627/Controle-Imuno-hematologico-Transfusoes.
O site Biomedicina Padrão traz a técnica e os testes de Coombs Direto e Indireto:
<http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html>
<http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-direto.html>
PAI (COOMBS INDIRETO em) Polietilenoglicol – (Bio PEG®) – tubo 
Bio PEG® (polietilenoglicol) é uma macromolécula que retira a água do meio de 
suspensão das hemácias, permitindo uma maior concentração dos anticorpos ao 
redor das hemácias em suspensão e favorecendo a aglutinação.
22
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA:
1. Marcar dois tubos: I e II (ambos devem ser identificados com o número da 
amostra teste);
2. Em cada tubo, adicionar 2 gotas de soro do paciente e 1 gota do reagente 
de hemácia de triagem I e II, respectivamente;
3. Acrescentar 2 gotas de Bio PEG® , homogeneizar e nãocentrifugar;
4. Incubar a 37oC por 15 minutos;
5. NÃO centrifugar (pois este potencializador forma um precipitado de 
proteínas que impede a observação da aglutinação antes da lavagem);
6. Lavar as hemácias 3 vezes com salina (sempre que desprezar os 
sobrenadantes, agitar os tubos para que ocorra o desprendimento total 
do botão formado no fundo do tubo; só depois acrescentar novamente 
a salina);
7. Decantar completamente o sobrenadante final, desprender o botão 
formado e adicionar 1 gota de soro antigamaglobulina anti-IgG;
8. Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos a 3.400 rpm;
9. Examinar a aglutinação das hemácias e registrar os resultados de 
acordo com ausência ou presença de aglutinação, anotando sempre a 
intensidade de aglutinação.
Ao resultado negativo é preciso realizar a validação da reação com controle de 
Coombs:
 » Controle de Coombs positivo valida o resultado negativo da PAI.
 » Controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado 
da PAI é falso-negativo. Nesse caso é preciso repetir a PAI.
Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para 
realização da identificação do(s) anticorpo(s).
Neste caso, a transfusão de hemácias deve ser célula(s) antígeno(s) – negativo(s) 
para o anticorpo identificado.
Não se esquecer
Ao encaminhar as amostras para o laboratório especializado, enviar também o 
histórico do paciente (idade, diagnóstico, antecedentes transfusionais, gestação/
aborto, medicação etc.).
Observações: para evitar reações falso-positivas, é melhor utilizar o soro Anti-IgG do 
que o soro antiglobulina poliespecífico.
23
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
doença hemolítica do recém-nascido
A doença hemolítica do recém-nascido ocorre quando uma mãe de Rh negativo concebe um filho Rh 
positivo. Para que a doença ocorra, a mãe necessariamente foi previamente imunizada contra Rh+. 
Essa imunização pode ter ocorrido por transfusões incorretas, parto prévio de um bebê Rh positivo, 
descolamentos de placenta e outros casos em que a mãe tenha entrado em contato com sangue Rh 
positivo. Anticorpos anti-D passam pela placenta e provocam a lise de hemácias, causando uma 
anemia séria no bebê. A doença é chamada de eritroblastose fetal, porque, na tentativa de compensar 
a anemia, o organismo do feto libera eritroblastos (hemácias não maduras) na circulação (Figura 6).
figura 6 – doença hemolítica do recém-nascido. 
fonte: <lucianecantalicebiologia.blogspot.com>. 
Há certos procedimentos que a mãe de Rh negativo pode realizar a fim de evitar a doença hemolítica 
do neonato. Pode-se destacar o cuidado no contato com sangue de Rh positivo, o diagnóstico do 
fator Rh do feto através da técnica denominada Reação em Cadeia de Polimerase, a realização do 
Teste de Coombs para saber se a mãe já está imunizada e ainda o uso de medicamentos como o 
MATERGAM e RHOGAM, que são imunoglobulinas (IgG) Anti-D usadas profilaticamente na 
prevenção de anticorpos contra eritrócitos Rh positivos em pessoas Rh negativas que estão sob risco 
de serem sensibilizadas por esses eritrócitos. 
Antígeno d fraco (fraca expressão de d)
É sabido que um número muito reduzido de pessoas possui hemácias que não são aglutinadas 
diretamente com soro anti-D, contudo reagem positivamente ao teste da anti-globulina. Durante 
a incubação com soro anti-D, ocorre sensibilização das hemácias portadoras do fator D fraco. 
Acrescentando-se a antiglobulina, esta reagirá com os anticorpos sensibilizando as hemácias 
(anti-D), e assim promovendo a aglutinação. O fator D fraco é um alelo do gene D tão imunogênico 
quanto o próprio antígeno D.
Normalmente hemácias RhD positivas possuem uma densidade antigênica variando entre 15.000 
a 30.000 antígenos/célula, dependendo do haplótipo. Isto não é regra, pois alguns fenótipos foram 
identificados com densidade variando entre 70 e 5.200 antígenos RhD sendo denominados de 
24
UNIDADE I │ IMUNOHEMATOLOGIA 
D fracos. Estes são causados pela substituição de aminoácidos nas porções transmembranosas e 
intracelulares da proteína RhD devido à mutação no gene RHD. Hemácias com fenótipo D fraco 
expressam um antígeno RhD intacto ocorrendo em 0,2% a 1% dos caucasianos.
Hoje em dia temos mais de 40 tipos de D fracos identificados em nível molecular, nos quais o D 
fraco tipo 1 e 2 são os mais frequentes. Somado a isso, o fenótipo D fraco carrega o antígeno RhD 
intacto, o que diminui a probabilidade de formar aloanticorpo anti-D.
A distinção entre D fraco e D parcial não deve ser feita pela produção de anti-D. Foi proposto o índex 
Rhesus para a predição do risco de imunização em indivíduos D fraco. Esse índex foi baseado na 
densidade antigênica de diferentes anticorpos monoclonais dependendo da 1) quantidade de sítios 
antigênicos; e 2) afinidade do anticorpo e pode teoricamente variar de 1 (risco baixo, exemplo: RhD 
normal) a 0 (alto risco exemplo: parcial RhD faltando epítopos ). 
identificação de Antígeno d fraco
Procedimento
 » Preparar uma suspensão de hemácias a 5%.
 » Tomar 3 tubos de hemólise, numerá-los de 1 a 3 e proceder segundo o 
esquema abaixo:
Reagentes Tubo 1 
(teste)
Tubo 2 
(controle positivo)
Tubo 3 
(controle negativo)
Suspensão de hemácias 5% (teste) 1 gota - 1 gota
Suspensão de hemácias 5% (Rh+) - 1 gota -
Soro anti-D 1 gota 1 gota -
Albumina bovina 22% - - 1 gota
 » Incubar em banho-maria 37º C durante 20 minutos.
 » Lavar 3 vezes com soro fisiológico (2.500 rpm durante 2 minutos).
Reagentes Tubo 1 
(teste)
Tubo 2 
(controle positivo)
Tubo 3 
(controle negativo)
Soro de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotas
 » Homogeneizar e centrifugar a 1.500rpm durante 2 minutos.
 » Observar se houve ou não aglutinação.
Interpretação
D fraco positivo .................... se houve aglutinação 
D fraco negativo .................... se não houve aglutinação
25
IMUNOHEMATOLOGIA │ UNIDADE I
Antígeno d parcial 
O antígeno D é composto de numerosos epítopos e sua expressão parcial foi originalmente definida 
por indivíduos D apresentando formação de anti-D. Estudos com anticorpos monoclonais resultaram 
em mais de 30 epítopos altamente conformacionais, envolvendo várias alças extracelulares.
Hemácias D parciais são definidas pela ausência de um ou mais epítopos causados pelos rearranjos 
dos genes RHD e RHCE. Essa configuração genética possibilita microconversões e trocas 
unidirecionais de fragmentos de gene RHD e RHCE, ou parte deles, levando a formação de alelos 
RHD-CE-D ou RHCE-D-CE respectivamente. Esses novos alelos aberrantes de Rh não produzem 
proteínas híbridas, regiões de RhD unidas com RhCE levando à perda de epítopos de D, gerando 
novos antígenos.
Poucos fenótipos D parciais resultam de trocas de um aminoácido apenas. De forma contrária 
ao D fraco, o polimorfismo ocorre nos segmentos extracelulares da proteína RhD. Indivíduos D 
parciais podem frequentemente produzir anti-D contra aqueles epítopos ausentes quando expostos 
à proteína RhD completa.
Quais seriam os outros sistemas sanguíneos e suas funções? Que tal fazer uma busca 
e incorporar este conhecimento? 
Sugestão de vídeos com aula sobre 
Sistema ABO e Rh
http://www.youtube.com/watch?v=1LG5lTkgP0g
http://www.youtube.com/watch?v=mPOIZKCorCI
26
unidAdE iiiMunoLogiA 
CLÍniCA
CAPÍtuLo 1
Anticorpos
Classes de anticorpos
Anticorpo é caracterizado por uma GLOBULINA sintetizada de linfócitos B e principalmente por 
plasmócitos, após receber estímulo de um imunógeno, e que possui propriedade de interagir com 
este de maneira específica.
Imunógenos x Antígenos 
Imunógenos são moléculas capazes de desencadear uma resposta imune adaptativa 
após sua introdução em humanos ou animais, ou seja, é qualquer substânciaque 
possa gerar uma resposta imune específica. Antígenos são substâncias que podem 
se ligar a um determinado anticorpo. Logo, todos os antígenos têm o potencial 
de induzir anticorpos específicos, no entanto, alguns precisam ligar-se a algum 
imunógeno para poder fazer isso. Isso quer dizer que todos os imunógenos são 
antígenos, mas nem todos os antígenos são imunógenos. Às vezes o que pode 
fazer com que um antígeno não seja um imunógeno é a reação cruzada, definida 
como a ligação de um anticorpo com outro anticorpo que não o imunógeno que 
desencadeou a resposta imune.
No início da Imunologia, o anticorpo só era reconhecido por suas propriedades, como a de neutralizar 
a toxina correspondente ou provocar aglutinação de glóbulos vermelhos e a de promover lise de 
bactérias e provocar choque anafilático em pessoas ou animais sensibilizados.
O conhecimento atual nos mostra que as moléculas de anticorpos são constituídas basicamente de 
duas subunidades proteicas chamadas cadeias leves (L) e duas subunidades designadas cadeias 
pesadas (H) do inglês heavy.
A Organização Mundial da Saúde adotou a designação genérica de imunoglobulinas para todas as 
classes ou isotipos (tipos moleculares presentes em todos os indivíduos de uma mesma espécie) de 
27
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
globulinas com a estrutura básica da molécula de anticorpo, usando a sigla Ig seguida das maiúsculas 
A, G, M, D e E para as cinco classes até agora conhecidas. 
As cinco classes (ou isotipos) diferem entre si (sequência primária de aminoácidos) das cadeias 
pesadas, sendo as cadeias leves iguais para todas as classes imunoglobulinas. Há, no entanto, dois 
tipos de cadeias leves com diferentes sequências de aminoácidos. As cadeias pesadas, específicas 
para cada classe, são também designadas por letras gregas que simbolizam a sua estrutura.
Estrutura básica da molécula de anticorpo
Os primeiros estudos de imunoglobulinas tiveram foco na IgG. Esta é a que apresenta maior 
concentração no soro, portanto, sua estrutura pôde ser mais facilmente caracterizada. 
A molécula de anticorpos de todas as subclasses é representada por um modelo básico constituído de 
duas cadeias polipeptídicas leves de peso molecular aproximado 23 kDa e duas cadeias pesadas com 
peso molecular variáveis entre 50 e 75 kDa, dependendo da subclasse a que pertence do anticorpo.
Cada cadeia ou subunidade possui uma porção aminoterminal e na porção oposta é a carboxiterminal. 
Cada Molécula de IgG possui dois sítios de combinação específicos para o determinante antigênico 
que induziu sua síntese, a sequência de aminoácidos dessas porções é altamente variável e específica 
para cada imunógeno, apresentando grupos de aminoácidos, característicos do indivíduo que 
sintetiza a molécula (Figura 7).
figura 7 – Estrutura de uma Imunoglobulina.
fonte: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253>
Veja mais, no artigo sobre imunidade do feto e do recém-nascido, encontrado no 
site: <http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253>
28
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
Propriedades gerais das imunoglobulinas
Ligação ao antígeno (Ag) 
As imunoglobulinas são ligadas de forma específica a um ou mais antígenos proximamente 
relacionados. Cada imunoglobulina liga-se a um determinante antigênico específico. Ligação 
a antígeno pelos anticorpos é a função primária dos anticorpos e pode resultar em proteção do 
hospedeiro. A valência do anticorpo refere-se ao número de determinantes antigênicos que uma 
molécula individual de anticorpo pode se ligar, sendo que é pelo menos duas e em alguns casos mais 
(IgM – na forma pentâmera).
resposta imune adaptativa primária e secundária
Nas respostas imunes de primeiro contato com Antígeno (Ag), encontramos imunoglobulinas 
predominantes como IgM e IgD (na superfície da célula B) , que apresenta como principal 
característica principal ser mais lenta e menos intensa. Por sua vez, as respostas imunes de segundo 
contato com o antígeno (Ag), encontramos predominância de IgA, IgE e IgG, e respostas mais 
rápidas, intensas e especifica.
Estrutura
Todos os anticorpos são Igs, mas nem todas as Igs são classificadas como anticorpos: anticorpo 
constitui uma ação e um evento que é característico do funcionamento de uma molécula que se 
chama Ig. Contudo, também produzimos imunoglobulinas que não tem nenhuma atividade de 
anticorpo. Em suma, as Igs fazem parte das proteínas do sangue (são proteínas solúveis no sangue), 
embora possamos encontrar Igs em muitos fluidos e líquidos corporais também. 
Descobrimento das Igs: foi por meio da análise da mobilidade eletroforética das proteínas do sangue 
de acordo com o peso molecular de cada uma delas, onde se verificou a presença de um grupo 
de proteínas que correspondem às albuminas e um grupo que corresponde às globulinas. Dentro 
das globulinas, proteína que tem forma globosa, existem as globulinas alfa, beta e gama. Assim, 
as Igs fazem parte do grupo das Gama Globulinas e, na sua formação, é glicoproteica (proteína + 
polissacarídeo). 
Produzidas pelas células plasmáticas (LB maduro, únicas células a produzir Ig), esse processo 
normalmente é de resposta a um imunógeno. Existem eventos casuais e patológicos em que há 
produção de Ig sem a presença de um imunógeno (processos neoplásicos de células B, por exemplo) 
e a formação de grupos de células produtoras de Ig sem nenhum estímulo, ou seja, não são moléculas 
de anticorpos, são apenas Ig. 
As imunoglobulinas estão divididas em cinco classes diferentes, baseadas nas diferenças em 
sequências de aminoácidos na região constante das suas cadeias pesadas. A rigor, todas as 
29
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
imunoglobulinas de uma mesma classe têm regiões constantes de cadeia pesada muito similares. 
Essas diferenças podem ser detectadas por estudos de sequências ou por meios sorológicos (i.e. pelo 
uso de anticorpos dirigidos a essas diferenças) (Figura 8).
igg
Estrutura: Todas IgGs são classificadas como monômeros (imunoglobulina 7S). As subclasses 
diferem no número de pontes dissulfeto e comprimento da região da dobradiça.
Propriedades: É a mais versátil imunoglobulina porque é capaz de realizar todas as funções das 
moléculas de imunoglobulinas.
a. IgG é a principal Ig no soro – 75% das Ig do soro são IgG.
b. IgG é a principal Ig em espaços extra vasculares.
c. Transferência placentária – IgG é a única classe de Ig que atravessa a placenta. A 
transferência é mediada pelo receptor da região Fc do IgG nas células placentárias. 
Nem todas as subclasses atravessam a placenta com a mesma eficiência; IgG2 não 
atravessa bem.
d. Fixação do complemento – Nem todas as subclasses fixam com a mesma eficiência; 
IgG4 não fixa complemento.
e. Ligação a células – Macrófagos, monócitos, PMNs (células da imunidade inata) e 
alguns linfócitos (imunidade adquirida) têm receptores para a região Fc da IgG. 
Nem todas as subclasses se ligam com a mesma eficiência; IgG2 e IgG4 não se 
ligam a receptores de Fc. Uma consequência direta da ligação a receptores de Fc em 
PMNs, monócitos e macrófagos é que a célula pode internalizar melhor o antígeno 
processado. O anticorpo cria um microambiente propício para que o antígeno seja 
reconhecido e fagocitado pelas células do sistema imune inato. O termo opsonina 
é usado para descrever substâncias que aumentam essa fagocitose. IgG é uma boa 
opsonina. Ligação de IgG a receptores de Fc em outros tipos de células resulta na 
ativação de outras funções.
igM
Estrutura: IgM é encontrada na sua forma pentâmera (imunoglobulina 19S), mas ela pode também 
existir como um monômero. Na forma pentâmera todas as cadeias pesadas são idênticas e todas as 
cadeias leves também se apresentam idênticas. Assim, a valência émáxima e teoricamente 10. IgM 
tem um domínio extra na cadeia mu (CH4) e ela tem outra proteína covalentemente ligada via uma 
ponde S-S chamada cadeia J. Esta cadeia funciona em polimerização da molécula a um pentâmero.
30
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
Propriedades: 
a. IgM é a terceira Ig mais comum no soro.
b. IgM é a primeira Ig a ser feita pelo feto e a primeira Ig a ser feita por uma célula B 
virgem quando é estimulada pelo antígeno.
c. Como consequência da sua estrutura pentâmera, IgM é uma boa Ig fixadora do 
sistema complemento. Assim, anticorpos IgM são muito eficientes em levar à lise 
de microrganismos.
d. IgM também é uma boa Ig aglutinadora, agregando microrganismos para eliminação 
eventual para fora do corpo.
e. IgM liga-se a algumas células via receptores de Fc.
f. Ig de superfície de célula B 
IgM de superfície existe como um monômero e não tem cadeia J, mas tem 20 aminoácidos extras 
na região C-terminal para se ancorar na membrana. Essas Igs funcionam como receptores para 
antígeno ou células B e também estão associadas não covalentemente com duas proteínas adicionais 
na membrana da célula B (Ig-alfa e Ig-beta). As proteínas adicionais, por sua vez, agem como 
moléculas de transdução de sinal, uma vez que a cauda citoplasmática da molécula de Ig por si 
mesma é muito curta para transduzir um sinal. O contato entre a superfície da imunoglobulina e 
um antígeno é necessário antes da transdução do sinal pelas cadeias Ig-alfa e Ig-beta. Os antígenos 
T-independentes realizam contato entre o antígeno e a superfície da imunoglobulina com expressão 
suficiente para ativar as células B a se diferenciarem em plasmócitos secretores de anticorpos. Já os 
antígenos T-dependentes, é necessário um segundo sinal fornecido pelas células T auxiliares para 
ativar as células B.
igA
Estrutura: Em forma de dímero, uma cadeia J se associa a ela. Por outro lado, se IgA for encontrada 
em secreções identificamos outra proteína associada a ela chamada de peça secretora T; sIgA é, às 
vezes, referida como imunoglobulina 11S. Ao contrário do resto da IgA que é feito no plasmócito, a 
peça secretora é feita nas células epiteliais e é adicionada à IgA à medida que esta passa através das 
secreções. A peça secretora ajuda a IgA a ser transportada através da mucosa e também a protege 
da degradação nas secreções.
Propriedades:
a. IgA é comum no soro (so perde para IgG).
b. IgA é a principal classe de Ig em secreções – lágrimas, saliva, colostro, muco. Uma 
vez que é encontrada em secreções IgA secretora é importante na imunidade local 
(de mucosa).
31
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
c. Normalmente IgA não fixa complemento, a menos que esteja agregada.
d. IgA pode se ligar a algumas células – PMNs e alguns linfócitos.
igd
Estrutura: IgD existe somente como um monômero.
Propriedades:
a. IgD é encontrada em baixos níveis no soro; seu papel no soro é não está totalmente 
estabelecido.
b. IgD encontrada em superfícies de célula B onde funciona como um receptor para 
antígeno. IgD na superfície de células B tem aminoácidos extras na região C-terminal 
para ancoramento à membrana. Ela também se associa com as cadeias beta de Ig-
alfa e Ig-beta.
c. IgD liga complemento.
igE
Estrutura: IgE existe como um monômero e tem um domínio extra na região constante.
Propriedades:
a. IgE é a Ig sérica menos comum, uma vez que se liga fortemente com receptores de 
Fc em basófilos e mastócitos mesmo antes da interação com o antígeno.
b. Envolvida em reações alérgicas – Como consequência da sua ligação a basófilos e 
mastócitos, IgE é envolvida em reações alérgicas. Ligação do alergeno à IGe nas 
células resulta na liberação de vários mediadores farmacológicos que resulta em 
sintomas alérgicos.
c. IgE também participa em doenças parasitárias por helmintos. Uma vez que os níveis 
sorológicos de IgE aumentam em doenças parasitárias, a quantificação dos níveis 
de IgE auxilia no diagnóstico de infecções parasitárias. Eosinófilos têm receptores 
de Fc para IgE e a ligação de eosinófilos a helmintos cobertos por IgE resulta na 
morte do parasita.
d. IgE não fixa complemento.
32
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
figura 8 – Classes de Imunoglobulinas.
fonte: < http://www.rbi.fmrp.usp.br/imunobiol/aulas/t3.htm>
Funções das imunoglobulinas
a. Neutralização de toxinas
O reconhecimento do antígeno é realizado pela interação do determinante 
antigênico com o sítio do anticorpo especifico. Em geral, os sítios combinatórios 
dos anticorpos são direcionados contra bactérias, fungos, vírus e seus produtos. 
Reconhecem também epítopos presentes em parasitas protozoários e metazoários. 
A interação entre um antígeno (por exemplo: presente na superfície de uma 
bactéria), com o anticorpo por si só não leva necessariamente a sua destruição. Como 
exceção, temos a interação entre certas toxinas bacterianas (como a diftérica ou 
tetânica) e anticorpo, onde ocorre completa neutralização do produto microbiano. 
A neutralização da toxina, nestes casos, é suficiente para impedir os sintomas das 
doenças que são mediados pela toxina. A ligação antígeno-anticorpo, em geral, 
prepara para a etapa efetora que é mediada por outros agentes.
b. Aglutinação
Os produtos do sistema complemento também alteram a superfície dos organismos 
invasores, induzindo-os aderir uns aos outros, promovendo assim a aglutinação 
(prendem vários antígenos ao mesmo tempo).
c. Citotoxidade celular dependente de anticorpo
Anticorpos específicos ao interagirem com epítopos de membrana de uma célula-
alvo podem dar origem a um fenômeno denominado ADCC (do inglês antibody 
33
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
dependent cell mediated cytotoxicity), que pode ser mediado por granulócitos. Há 
experimentos in vitro que descrevem a morte de esquistossomos após opsonização 
por anticorpo IgE e atividade ADCC mediada por eosinófilos. 
d. Opsonização por IgG
Na fagocitose é necessário o envolvimento entre componentes da partícula a 
ser interiorizada e receptores de membrana da célula fagocitária. Assim, um 
microrganismo pode ser reconhecido por células fagocitárias através de receptor 
para manose, que reconhece resíduos deste açúcar na superfície da partícula a ser 
ingerida, quando a partícula estranha estiver opsonizada por anticorpos específicos 
do isotipo IgG. O processo se torna muito mais eficiente em virtude da existência 
de receptores de membrana dos fagócitos que reconhecem a região Fc da IgG. A 
opsonização por anticorpos IgG não somente aumenta expressivamente a taxa de 
fagocitose (número de partículas ingeridas por fagócito) como também pode levar 
a um aumento da digestão da partícula ingerida (no fagossomo) por ativação do 
metabolismo da célula fagocitária. 
e. Lise 
Um dos mais importantes produtos da cascata do complemento é o complexo lítico, 
que por definição é a combinação de múltiplos fatores do complemento sendo 
designado C5b6789. Seu efeito é direto na ruptura das membranas celulares de 
bactérias e outros organismos invasores. Enzimas e outros produtos do complemento 
atacam as estruturas de alguns vírus tornando-os não virulentos.
f. Quimiotaxia 
O fragmento C5a induz a quimiotaxia pelos neutrófilos e macrófagos, promovendo a 
migração de grandes quantidades desses fagócitos para o local do agente antigênico.
g. Ativação de mastócitos e basófilos e eosinófilos 
Os fragmentos C3a, C4a e C5a ativam os mastócitos e basófilos, induzindo-os a 
liberar histamina, heparina e várias outras substâncias para os fluidos locais. Como 
consequência, há um aumento no fluxo sanguíneo local, extravasamento de líquido 
e proteína plasmática para os tecidos e, de reações teciduais locais que ajudam a 
inativar e imobilizar o agente antigênico.Os mesmos fatores desempenham papel 
importante na inflamação e na alergia.
h. Efeitos inflamatórios 
Além dos efeitos inflamatórios causados pela inflamação dos mastócitos e basófilos, 
a ação de vários outros produtos do complemento contribuem para a inflamação 
local induzindo o aumento do fluxo sanguíneo já estava aumentado, aumentando 
o extravasamento de proteínas a partir dos capilares e a favorecendo a coagulação 
de proteínas nos espaços teciduais, evitando assim a movimentação do organismo 
invasor através dos tecidos.
34
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
Anticorpos monoclonais
Por definição anticorpos monoclonais (mAbs, na sigla em inglês) são anticorpos produzidos por um 
único clone de um linfócito B parental, sendo idênticos em relação em suas propriedades físicas, 
químicas e biológicas. Foi descrito pela primeira vez em 1975, em artigo na revista Nature por 
César Milstein e Georges Köhler que dividiram o Prêmio Nobel de Medicina no ano de 1984 com o 
dinamarquês Niels Kaj Jerne.
Os mAbs são produzidos em ambiente laboratorial com linfócitos B gerados por camundongos 
com sistemas imunológicos estimulados pelos antígenos de interesse. São chamados de anticorpos 
murinos que usados de forma continuada durante uma terapia, estimulam uma reação imunológica 
ao anticorpo próprio. Dessa forma, o uso dos mAbs ficou limitado durante duas décadas à produção 
de kits para diagnósticos ou à pesquisa científica (Figura 9).
Esse problema foi resolvido com a humanização dos anticorpos murinos por modernas técnicas 
de engenharia genética. Na técnica, os genes responsáveis pela produção dessas proteínas são 
modificados de forma a eliminar essa reação imunológica do organismo humano. O processo de 
humanização não deve alterar a afinidade do anticorpo com o respectivo antígeno e possibilita 
assim a sua aplicação continuada em procedimentos terapêuticos.
Os mais significativos avanços no uso de mAbs se encontram na área de oncologia, uma vez uma nova 
geração de medicamentos em desenvolvimento está baseada na capacidade dos mAbs em reconhecer 
antígenos específicos de tumores e induzir uma resposta imune contra as células cancerosas. Mais 
ainda, os mAbs podem ser modificados e atuarem como portadores de radioisótopos ou toxinas às 
células tumorais ampliando, assim, seu espectro de aplicação terapêutica.
figura 9 – Mostra a técnica para produção de anticorpos monoclonais a partir de hibridomas.
fonte: <biologia12eportefolio.blogspot.com>
35
CAPÍtuLo 2
reação de precipitação e aglutinação
título do anticorpo
A produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada às diluições dos 
soros utilizadas para a realização do teste, já que os ensaios não são quantitativos. Nestes ensaios, as 
partículas antigênicas são misturadas com seriadas diluições do soro do paciente e como resultado 
de produção de anticorpos considera-se a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação 
ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. Esta diluição é chamada de título do anticorpo. 
Por exemplo, se estudarmos a produção de anticorpos contra espécies de Leishmania, que causam 
calazar, em uma população de área endêmica do Brasil é comum ser observada aglutinação de 
formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na maioria das pessoas. Este 
resultado é porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium, 
Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que apresentam 
reação cruzada com Leishmania donovani. De forma contrastante, o soro de pacientes infectados, 
que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6400 (título). Como 
pode ser observado, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica é de 
1:600 enquanto nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes.
imunoprecipitação
As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar precipitações resultantes 
da interação antígeno-anticorpo, ambos inicialmente solúveis. Nessa técnica é necessário que 
a molécula antigênica seja multivalente quanto ao numero de epítopos e, preferencialmente, os 
anticorpos sejam policlonais. Para anticorpos monoclonais, a especificidade única exige que o 
epítopo esteja acessível e presente em quantidade grande na molécula.
Os anticorpos policlonais derivam de diferentes linhagens de linfócitos B, isto é, são 
imunoglobulinas com estruturas diferentes, produzidas em resposta a um antígeno 
específico, cada uma com especificidade para um epítopo diferente desse antígeno. 
Dado que a maioria dos antígenos é muito complexa e possui numerosos epítopos 
que são reconhecidos por diferentes linfócitos, cada linfócito é ativado para proliferar 
e se diferenciar em plasmócitos resultando em anticorpos com resposta policlonal.
Entre os vários fatores físico-químicos e imunológicos que interferem na quantidade de precipitado 
formado, os principais são as concentrações de relativas de antígeno e de anticorpo. O máximo 
de precipitação é observado quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, 
diminuindo na presença de excesso de um ou outro componente.
36
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
A curva de precipitação clássica pode ser obtida quando ao anticorpo e concentração constante se 
adiciona o antígeno em diferentes concentrações apresentando aspecto parabólico (Figura 10). A 
precipitação será máxima na zona de equivalência ou de proporções ideais de antígeno e anticorpo, 
e à medida que se adiciona mais antígeno, o imunocomplexo se dissolve. A zona de excesso de 
anticorpo (ou falta de antígeno) é chamada de pró-zona e proporciona resultado falso-negativo para 
a pesquisa de anticorpo. Essa falha é inaceitável, pois justamente quando há mais anticorpos o 
resultado será negativo. Para solucionar esse problema, devem ser utilizadas diferentes diluições do 
anticorpo diante da concentração fixa do antígeno.
figura 10. Curva de precipitação: quantidade de precipitação formada na interação antígeno-anticorpo 
com concentração fixa de anticorpo (vermelho) e quantidade crescente de antígeno (verde). Na zona 
de equivalência se observa o imunocomplexo na sua máxima estrutura de malha, permitindo que o 
imunoprecipitado seja visível, especialmente em meio gelidificado. Nas zonas de excesso de anticorpo (pró-zona) 
ou de excesso de antígeno (pós-zona) o tamanho molecular dos imunocomplexo não permite sua visualização, 
gerando resultados falso-negativos.
fonte: Imunoensaios cap. 5.
A visualização de precipitados em meio líquido é difícil, pois tanto as amostras de soros com 
anticorpos quanto às soluções antigênicas apresentam turvação e coloração próprias e variáveis.
As técnicas manuais de precipitação atualmente e uso são realizadas em meio gelidificado, o que 
facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação. No entanto, requerem períodos de 
horas a dias para a migração molecular e a formação do imunocomplexo.
imunoaglutinação 
Fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas de precipitação, 
diferindo na adsorção do antígeno ou do anticorpo a micropartículas insolúveis ou células e permitindo 
leitura visual e rápida. A técnica não permite discriminar frações dos componentes antigênicos 
como a imunoprecipitação, mas permite a utilização de antígenos purificados e complexos fixados a 
micropartículas ou células. Além disso, pode ser mais sensível que a imunoprecipitação e permite a 
detecção de pequenas quantidades de anticorpos, especialmente nas técnicas de microaglutinação.
37
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
A característica mais marcante da imunoaglutinação é que seja o anticorpo ou antígeno é apresentadona forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células, ou adsorvido artificialmente a 
micropartículas ou células. Pode ser direta ou indireta (Figuras 11 e 12).
Teste de aglutinação ocorre quando há a formação de agregados suficientemente grandes de 
micropartículas ou células com múltiplos determinantes antigênicos (ou anticorpos), interligados 
por pontes moleculares de anticorpos (ou antígenos). Ocorrem várias interações entre os sítios 
combinatórios idênticos (dos anticorpos) simultaneamente com determinantes antigênicos iguais. 
Estes agregados facilitam a visualização do imunocomplexo, que pode ocorrer em questão de 
minutos ou algumas horas, e a leitura pode ser a olho nu ou lupa.
A execução da técnica pode ser determinada em tubo, lamina ou placa de micro cavidades, sempre 
com o envolvimento de diferentes fatores na formação dos agregados, tais como:
 » classe do anticorpo envolvido;
 » concentração iônica e pH do meio;
 » presença de macromoléculas, íons, enzimas e conservantes;
 » tempo e temperatura;
 » padronização adequada da suspensão de micropartículas ou células;
 » concentração ótima do antígeno ou anticorpo a ser fixado nas micropartículas ou 
células;
 » estabilidade da ligação do antígeno/anticorpo e acessibilidade dessa molécula nas 
micropartículas ou células.
Como vantagens da reação de imunoaglutinação temos:
 » elevada sensibilidade;
 » baixo custo;
 » leitura visual;
 » facilidade de execução;
Podemos ainda listar algumas desvantagens: 
 » reprodutibilidade dos lotes de reagentes;
 » acessibilidade molecular para interação antígeno-anticorpo;
 » estabilidade da ligação do antígeno-anticorpo no suporte;
38
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
figura 11 – Imunoaglutinação direta.
Modificado de: <http://www.abah.com.br/content/ABAAABM8oAE/imunoprecipitacao#>
figura 12 – Imunoaglutinação indireta (passiva).
Modificado a partir de: <http://www.abah.com.br/content/ABAAABM8oAE/imunoprecipitacao#>. 
39
CAPÍtuLo 3
quantificação da concentração 
antigênica ou de anticorpos
Historicamente, os ensaios imunológicos foram e têm sido os principais responsáveis pelo 
conhecimento que se tem do sistema imune. Além deste aspecto relacionado ao conhecimento 
científico básico, estes ensaios são importantes na clínica para a detecção de infecções, de doenças 
autoimunes e de estados de imunodeficiência. Podem ainda ser utilizados para detectar a presença 
de antígenos (além de anticorpos), na diferenciação do estágio de uma doença de acordo com a classe 
de Ig produzida, na seleção de doadores e receptores de órgãos para transplantes, na avaliação do 
prognóstico da doença, no sucesso de um tipo de terapia etc.
A amplitude da realização de ensaios imunológicos permite a utilização de técnicas não quantitativas 
que são visualizadas por meio de reações de precipitação e aglutinação; podem, ainda, utilizar 
técnicas quantitativas, com a utilização de marcadores enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase, 
citometria de fluxo) ou radioisótopos (Radioimunoensaio).
Os testes de precipitação e aglutinação são menos sensíveis que os ensaios imunoenzimáticos, 
porque os complexos Antígeno-Anticorpo para serem visualizados precisam apresentar um tamanho 
adequado. Na prática, os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis 
(proteínas, glicoproteínas) enquanto os de aglutinação para a detecção de antígenos particulados 
(hemácias, bactérias, células diversas).
radioimunoensaio (riA)
O radioimunoensaio é considerado um método de alta sensibilidade na análise quantitativa das 
reações antígeno-anticorpo. Ele permite medidas rápidas e precisas mesmo em preparações não 
purificadas. Também apresenta limiar de detecção na ordem de nanogramas ou picogramas. Entre 
as limitações do ensaio destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional. 
Na rotina pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos 
e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Encontramos inúmeras variações deste ensaio, 
contudo o princípio utilizado é o mesmo, ou seja, a quantidade de reagente marcado (antígeno ou 
anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra (Figura 13).
radioimunoensaio direto 
No radioimunoensaio direto, coloca-se uma quantidade fixa e limitada de anticorpo que é ligada 
a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada 
com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do 
antígeno não-marcado. O antígeno não ligado é removido após um período de incubação e faz-se a 
40
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em 
teste é estimada por interpolação na curva. 
radioimunoensaio de competição
No radioimunoensaio de competição, coloca-se uma quantidade fixa do antígeno em um suporte 
sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra 
em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. O 
anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem, 
após um período de incubação, e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a 
resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva. 
radioimunoensaio de captura
No radioimunoensaio de captura, coloca-se uma quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um 
suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com 
concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após um período de incubação remove-se 
o antígeno não ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de 
ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não ligado é removido 
por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a resposta obtida, a 
concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.
No radioimunoensaio clássico os reagentes são:
 » o anticorpo;
 » o antígeno marcado;
 » o antígeno frio contido nas amostras e padrões.
figura 13: Radioimunoensaio 
fonte: Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica, capítulo 6.
41
IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Aplicações
 » Testes que necessitem de alta sensibilidade;
 » triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue;
 » pesquisa;
 » pesquisa de drogas na urina ou soro de atletas
ELiSA (Enzyme-Linked immunoassay)
O ensaio de ELISA é um dos tipos de testes mais empregados nos laboratórios hoje em dia, visto que 
oferece simplicidade, sensibilidade e dependendo do kit a especificidade superior a de vários testes. A 
metodologia deste ensaio se mostrou tão eficaz, a ponto de substituir os testes de Radioimunoensaio 
(RIA), justamente por ser um teste mais estável e permitir o armazenamento do kit por um período 
bem maior sem que seus reagentes sofram degradação.
Os testes de ELISA podem ser classificados em testes Homogêneos e Heterogêneos. Nos testes 
homogêneos, a atividade enzimática é alterada como parte de uma reação imunológica. Neste tipo 
de ensaio não há necessidade de separar o imunocomplexo formado dos imunoreagentes livres. As 
técnicas homogêneas são especialmente elaboradas para a dosagem de drogas e haptenos, mas não 
tiveram seu uso difundido nos laboratórios de análises clínicas, já que este apresenta problemas 
na dosagem de proteínas. Por outro lado, os ensaios heterogêneos são amplamente empregados 
na imunologia. Neste tipo de ensaio, a atividade enzimática do imunoreagente marcado não está 
diretamente envolvidana reação propriamente dita; no entanto, os reagentes ligados e os reagentes 
livres devem ser separados uns dos outros.
Ensaios de ELiSA heterogêneos
O princípio básico do ELISA heterogêneo se baseia no uso de um antígeno ou anticorpo conjugado com 
uma enzima que, ao reagir com seu substrato, dá origem a um produto colorido, quimioluminescente 
ou fluorescente. Se for usado o método colorimétrico, a mudança de cor é monitorada a olho nu 
ou com o uso de um espectrofotômetro para determinar a proporção entre a quantidade de cor 
produzida e a quantidade de analito presente. Existe uma quantidade enorme de materiais que 
podem ser usados como suporte para a colocação do antígeno ou do anticorpo. O mais comum é se 
fazer uso de microplacas de poliestireno, pois estas, além de serem pequenas, evitando desperdício 
de material, permitem que se faça a análise de uma grande quantidade de amostras (Figura 14).
A técnica de ELISA heterogênea é feita com algumas etapas de lavagem, como forma de separar os 
imunoreagentes ligados dos que não estão ligados.
Esta técnica permite ainda se fazer uso de ensaios competitivos e não competitivos, podendo ainda 
dosar antígenos ou anticorpos, neste último caso, todos os isotipos de anticorpos podem ser dosados, 
tudo depende da especificidade do anticorpo usado.
42
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
figura 14: Ensaio de ELISA heterogêneo 
fonte: <www.liaccentralsorologica.com.br>.
Ensaios competitivos
Rotineiramente este tipo de ensaio é usado para se dosar antígenos, neste caso eles possuem fixados 
ao suporte sólido anticorpos ou antígenos específicos. Estes métodos são também chamados de 
métodos de reagente limitados, pois o antígeno e o anticorpo são usados em quantidades limitadas.
Quando o ensaio usa um anticorpo específico fixado na fase sólida, adiciona-se a amostra do paciente 
contendo o antígeno mais o antígeno marcado, com isso eles irão competir pelo anticorpo fixado na 
fase sólida. Com a dosagem da amostra do paciente procede-se a um controle do reagente, onde se 
adiciona apenas o antígeno marcado com um tampão na fase sólida, com isso tem-se o parâmetro 
negativo para, assim, poder comparar com o resultado obtido com a amostra do paciente. Isto é 
necessário, pois o sinal detectado na amostra do paciente é inversamente proporcional à quantidade 
de analito presente na amostra, ou seja, quanto mais analito na amostra, menor o sinal. Existem 
variações do ensaio competitivo em que o antígeno é fixado na fase sólida e o ensaio pode ser realizado 
em duas etapas. Nesse caso, numa primeira fase adiciona-se o soro do paciente no suporte, incuba-
se, posteriormente procede-se à lavagem para a remoção de tudo que não ficou ligado ao suporte 
sólido, e então adiciona-se o conjugado e procede-se à nova incubação. Nesta etapa, o conjugado 
irá se ligar ao antígeno livre do suporte sólido, posteriormente, procede-se a uma nova lavagem e 
executa-se a fase de revelação e leitura (Figura 15).
Os ensaios competitivos são ideais para dosagem de moléculas relativamente pequenas que podem 
ser obtidas com relativa pureza em grandes quantidades, a fim de serem marcadas com uma enzima. 
Como os ensaios competitivos requerem pequenas quantidades de anticorpo, eles são ideais para o 
uso em sistemas que há pequenas quantidades de anticorpo.
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
figura 15: ELISA competitivo
fontes: <http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html> e 
<http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html>.
Ensaios não competitivos indiretos
Temos neste tipo de ensaio um dos mais empregados nas rotinas laboratoriais de análises clínicas. 
Assim como os ensaios competitivos, eles podem usar antígenos ou anticorpos fixados a fase sólida. 
Quando se faz uso de um antígeno fixado a fase sólida, o anticorpo específico presente na amostra 
se ligará a este. Posteriormente o anticorpo será detectado com a adição de uma imunoglobulina 
marcada específica para o anticorpo em questão. Se compararmos os testes competitivos com 
os não competitivos, veremos que estes oferecem maior especificidade e menor sensibilidade; 
no entanto, isto é, dependente da afinidade e pureza dos reagentes imunológicos. Para detectar 
diferentes isotipos de imunoglobulina, são utilizadas imunoglobulinas marcadas específicas para um 
determinado isotipo. Este tipo de ensaio é muito empregado quando se deseja detectar anticorpos 
para um determinado agente infeccioso ou autoanticorpos (Figura 16).
Para este tipo de teste, pode-se usar suporte de microplacas de poliestireno, nitrocelulose, esferas 
e microesferas.
Quando um anticorpo é ligado à fase sólida, estes ensaios são classificados de ensaios de captura ou 
sanduíche, pois o antígeno presente na amostra, que pode ser um anticorpo também, será capturado 
pelo anticorpo fixado ao suporte sólido. Posteriormente adiciona-se um anticorpo marcado para um 
epítopo diferente do antígeno em questão, que completará o sanduíche. Existem inúmeras variações 
deste tipo de ensaio. O antígeno capturado pode ser uma imunoglobulina qualquer, uma proteína 
viral ou um antígeno qualquer que tenha, no mínimo, dois epítopos diferentes. Este tipo de ensaio 
requer que uma grande quantidade de anticorpo esteja fixada na fase sólida, no entanto, oferece 
uma grande sensibilidade.
Os ensaios de ELISA não competitivos podem ser modificados para incorporar camadas adicionais 
de reagentes imunes, com isso se obtém o aumento na sensibilidade do ensaio, no entanto, isto acaba 
influenciando no custo e no tempo de execução do teste. A aplicação mais comum é o complexo 
avidina-biotina, que proporciona um aumento significativo na sensibilidade do teste. O anticorpo 
44
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA 
biotinilado é normalmente usado como o segundo anticorpo do sanduíche. Ele então é posto para 
reagir com uma mistura previamente preparada de avidina e peroxidase biotinilada. Esta peroxidase 
pode ser desenvolvida com agentes quimioluminescentes como forma de aumentar a sensibilidade.
figura 16: ELISA não competitivo
fonte: http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html 
http://www.liaccentralsorologica.com.br/noticias_chagas.html.
outras variações do ELiSA
Uma das variantes do ELISA é a que usa a membrana de nitrocelulose como suporte sólido, 
chamada de ensaio Dot Blot. Neste tipo de ensaio, o antígeno ou anticorpo é fixado à membrana. 
Normalmente esta reação é observada pela produção de um produto colorido na membrana, este é 
apenas um ensaio qualitativo. Os ensaios de Dot Blot podem ser modificados de forma a apresentar 
uma maior sensibilidade e podem-se tornar semi-quantitativos desde que se use um densitômetro 
para ler a cor da reação.
 Problema: solução possível
Densidade ótica do controle do PBS elevado. Aumentar o número de lavagens. 
Densidade ótica do controle negativo elevado. Bloquear os sítios da fase sólida que 
não
reagiram; aumentar a diluição do conjugado.
Substituir o conjugado por um de maior pureza.
Adicionar de 1 a 5% de soro normal da mesma espécie usada no conjugado ao 
tampão de diluição; trocar o tipo de suporte usado.
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IMUNOLOGIA CLÍNICA │ UNIDADE II
Controle positivo com valores baixos. Tenha certeza de que o suporte usado é o 
correto.
Aumente a pureza do anticorpo ou do antígeno de captura; aumente o tempo de ou 
a temperatura de incubação, verificando antes se ambas estão corretas.
Quando a amostra está pouco diluída, apresenta um resultado moderado, no 
entanto, quando está muito diluída, apresenta um valor fora da escala de leitura do 
aparelho.
Dilua mais a amostra.
O ensaio apresenta valores baixos para tudo (amostra e controles).
Verifique a integridade do substrato e do tampão, certifique-se se o pH do

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