Minicurso: COLORAÇÃO DE GRAM (UFPB)

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Universidade Federal da Paraíba – UFPB 
Centro de Ciências Exatas e da Natureza – CCEN 
Departamento de Biologia Molecular – DBM 
Laboratório de Genética de Microrganismos – LGM 
 
 
 
 
 
 
IX Semana de Biologia da UFPB 
 
 
Mini-curso 
 
 
 
 
 
 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
www.dbm.ufpb.br/microbio 
 
 
Coloração de Gram 
 
A coloração de Gram foi 
desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista 
dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é 
um dos procedimentos de coloração mais 
úteis, pois classifica as bactérias em dois 
grandes grupos: gram-positivas e gram-
negativas. Neste procedimento, um 
esfregaço fixado pelo calor é recoberto com 
um corante básico púrpura, usualmente a 
violeta de genciana. Uma vez que a 
coloração púrpura impregna todas as 
células, é denominada coloração primaria. 
Após um curto tempo, o corante púrpura é 
lavado e o esfregaço é recoberto com iodo, 
um mordente. Quando o iodo é lavado, 
ambas as bactérias gram-positivas e gram-
negativas aparecem em cor violeta escuro. 
A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou 
uma solução de álcool-acetona. Esta 
solução é um agente descolorante, que 
remove o púrpura das células de algumas 
espécies, mas não de outras. O álcool é 
lavado e a lâmina é então corada com 
safranina, um corante básico vermelho. O 
esfregaço pé lavado novamente, seco em 
papel e examinado microscopicamente 
(Fig. 1, 2 e Anexo). 
A parede celular bacteriana é 
composta de uma rede macromolecular 
denominada peptideoglicana, que está 
presente isoladamente ou em combinação 
com outras substancias. A peptideoglicana 
consiste de um dissacarídeo repetitivo 
unido por polipeptídeos para formar uma 
rede que circunda e protege a célula. A 
porção dissacarídica é composta por 
monossacarídeos denominados N-
acetilglicosamina (NAG) e ácido N-
acetilmurâmico (NAM) (Fig.3). 
 
 
Figura 1 – Coloração de Gram: Bacillus cereus (+) e 
Escherichia coli (-). 
 
 
 
 
Figura 3 - Moléculas que formam a peptideoglicana. 
 
Na maioria das bactérias gram-
positivas (Fig. 4), a parede celular consiste 
de muitas camadas de peptideoglicana, 
formando uma estrutura rígida. Além disso, 
contém ácidos teicóicos, que consistem 
primariamente de um álcool e fosfato. 
As paredes celulares das bactérias 
gram-negativas (Fig. 5) consistem de uma 
ou algumas camadas de peptideoglicana e 
uma membrana externa. A peptideoglicana 
está ligada a lipoproteínas na membrana 
externa e está no espaço periplasmático, 
um espaço entre a membrana externa e a 
membrana plasmática. As paredes gram-
negativas não possuem ácidos teicóicos, 
mas sim de lipopolissacarídeos (LPS) e 
fosfolipídios. 
 
 
 
Figura 4 - Parede celular gram-positiva. 
 
 
Figura 5 - Parede celular gram-negativa. 
 
Referências: 
 
- Grupo de Ciências Biológicas do IST. Coloração de 
células pelo método de Gram. Disponível em: 
http://www.e-
escola.pt/site/topico.asp?topico=306&ordem=3&ca
nal=5 
- TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. 
Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2003. 
 
 
 
 
 
Figura 2 – Coloração 
de Gram mista: 
Streptococcus sp 
(+). e E. coli (-).
Anexo - Procedimento 
 
1- Cobrir o esfregaço da cultura em estudo 
(previamente fixado à lâmina de vidro) com uma 
solução de Violeta de cristal (VC). Deixar atuar 
durante 1 minuto. 
Nota: após este passo, todas as células ficam 
coradas com o violeta de cristal (corante primário). 
 
2- Escorrer o corante e lavar com água. Secar com 
papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação 
com reagente de Lugol e deixar atuar durante 1 
minuto. 
 
3- Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e 
secar. 
 
Nota: o iodo da solução de Lugol forma um 
complexo insolúvel com o corante primário. O 
complexo violeta de cristal - iodo (VC-I) tem uma 
cor mais intensa (violeta escuro) do que o VC livre 
e é mais difícil de remover das células. 
 
 
4- Diferenciar pelo álcool a 90°, deixando cair a 
solução de álcool gota a gota sobre a preparação 
até que não saia mais corante. 
 
Nota: este é o passo de diferenciação entre 
bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As 
primeiras perdem o complexo VC-I e as últimas 
retêm-no. As células de bactérias Gram-positivas 
ficam, então, coradas de violeta-escuro e as Gram-
negativas ficam incolores. 
 
5- Lavar com água, escorrer e secar com papel de 
filtro. 
 
 
6- Tornar a corar a preparação, durante 5 minutos, 
com uma solução de safranina. 
Nota: as células incolores de bactérias Gram-
negativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do 
contra-corante safranina). 
 
7- Escorrer o corante, lavar com água e secar com 
papel de filtro.