Extração de ácidos nucléicos

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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Extração de Ácidos Nucléicos
Vírus Bactérias Fungos Protozoários Helmintos
DNA
Diagnóstico Pesquisa
RNA
Extração de DNA
Lise das células
Desproteinização
Concentração do DNA
Extração de DNA
Lisozima
EDTA
SDS
Extração de DNA
Extração de DNA
Lise celular:
- Rompimento da célula (membrana e parede)
- Liberação do conteúdo citoplasmático
detergente tampão quelante
pH ≥ 7
lise estabilidade DNases
DNA
Extração de DNA
extrato celular
resíduos celulares
Nomograma Força G / RPM
Extração de DNA
Desproteinização:
- Separação de proteínas, lipídeos e restos 
celulares
solvente orgânico
centrifugação
fase orgânica fase aquosa
Extração de DNA
ProteaseRNase
Extração de DNA
Concentração do DNA:
- Precipitação do DNA através do álcool
solução aquosa
centrifugação
DNA
etanol
Extração de DNA
Solubilização do DNA
DNA
água NaOH 8mM
(overnight a 4oC) (uso imediato)
Estocagem do DNA
DNA
água etanol
(4oC) (- 70oC)
uma semana um ano
Quantificação da concentração de DNA
Absorbância de Luz Ultravioleta
DNA A260 = 1 (50 μg/ml de DNA)
Proteína A280 = 0.5 (25 μg/ml de proteína)
A260/ A280 ≥ 1,8 (< 1,8 contaminação)
Quantificação da concentração de DNA
- Representa a quantidade de DNA dupla fita
- Não necessariamente uma única dupla fita
- Razão menor que 1,8 indica contaminação 
com proteínas ou fenol
Extração de DNA com CTAB
CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio)
Extração de DNA com Tiocianato de 
Guanidina
Extração de DNA com Tiocianato 
de Guanidina
Extração de RNA
- RNA suscetível à degradação e 
autodegradação
- Ribonucleases são estáveis, difícil inativação 
e não necessitam de co-fatores
- Equipamentos e reagentes isentos de 
ribonucleases
Β-mercaptoetanol
Extração de RNA
Lise celular
detergente tampão inibidor
pH < 7
lise RNA estável RNases
DNA
Extração de RNA
Desproteinização:
solvente orgânico
centrifugação
fase orgânica fase aquosa
Extração de RNA
Concentração do RNA:
solução aquosa
centrifugação
RNA
etanol
Solubilização do RNA
RNA
uso imediato
água + inibidor
(overnight a 4oC)
Estocagem do RNA
RNA
etanol etanol
(- 20oC) ou
um mês água + inibidor
(- 70oC)
alguns anos
	Slide Number 1
	Extração de Ácidos Nucléicos
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Nomograma Força G / RPM
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Extração de DNA
	Solubilização do DNA
	Estocagem do DNA
	Quantificação da concentração de DNA
	Quantificação da concentração de DNA
	Extração de DNA com CTAB
	Extração de DNA com Tiocianato de Guanidina
	Extração de DNA com Tiocianato de Guanidina
	Extração de RNA
	Extração de RNA
	Extração de RNA
	Extração de RNA
	Solubilização do RNA
	Estocagem do RNA