Relatório de Determinação de proteinas

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

INTRODUÇÃO
	
	 Proteínas são compostos poliméricos complexos com alto peso molecular (PM). Podem ser formadas apenas por cadeias de aminoácidos ou constituídas por aminoácidos (parte proteica) conjugados com outras classes de compostos como lipídios, ácidos nucleicos, carboidratos, grupo inorgânico, entre outros (SANTANA, 2012).
Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 270 nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos) (IB/UFF, 2013). As ligações peptídicas das proteínas (-CONH-) reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das Proteínas no meio (BIOCLIN, 2013).
O nome do método provém do fato de que a ureia aquecida a 180°C dará reação positiva com desprendimento de amônia (SOUSA, et al 2013):
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro-espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de biureto tem sido, também, utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva e leite, quando comparado com outros métodos
2. OBJETIVO
Determinação de proteínas totais pelo método de Biureto do leite integral, gema de ovo, cara de ovo e bebida à base de soja.
3. EQUIPAMENTO E MATERIAIS
Balança analítica
Espectrofotômetro
Tubos de ensaio
Pipetas Graduadas
Balão volumétrico de 500 mL
Sulfato Cúprico
Tartarato de sódio e potássio
Água destilada
Hidróxido de sódio de 10%
Leite integral
Clara de ovo
Gema de ovo
Bebida à base de soja
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Inicialmente o biureto foi preparado, pesou-se 0,75 g de sulfato de cobre e 3,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio em seguida foi dissolvido em 150 mL de solução de NaOH 10%, e o volume foi completado para 500 mL de água destilada.
Para preparar a curva padrão tubos foram enumerados e adicionou-se volumes de 0,1 a 1,0 mL de solução de 1% (mV) em proteína. O volume foi completado para 1,0 mL de água destilada, em seguida foi adicionado 4,0 mL do reagente de biureto e doi encubado a 37°C por 20 min. Em seguida as absorbâncias foram lidas a 540 nm. Por regressão linear, foi correlacionado A540 e quantidade de proteínas. Sendo foram usadas curva padrão com o mesmo tipo de proteína que está sendo usado na análise.
Para preparo da clara de ovo e da gema, uma alíquota de 5 mL da clara e gema foi batido no liquidificador com 100 mL de água. O leite foi diluído, 5 mL de amostra em 100 mL de água. Para preparo da bebida à base de soja, também foi diluído 5 mL da amostra em 100 mL de água. 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As proteínas, por apresentarem muitas ligações peptídicas, quando tratadas com o Reagente de Biureto, produzem uma coloração cuja intensidade obedece a Lei de Lambert-Bier. Esta Lei estabelece que a absorbância de uma solução aumente à medida que aumenta a concentração de partículas absorventes. Isto pode ser comprovado pela visualização da coloração obtida em cada amostra durante o experimento e com as medidas de absorbâncias, como pode-se observar na seguinte tabela.
	AMOSTRA
	ABSORBÂNCIA
	Tubo 1 (Branco)
	0,00
	Tubo 2 (leite integral a 5%)
	0,212
	Tubo 3 (Gema do ovo)
	0,417
	Tubo 4 (Clara do ovo)
	0,340
	Tubo 5 (Bebida à base de soja)
	0,070
É possível observar que a clara de ovo a concentração de proteína foi alta, devido a uma maior concentração de proteína na amostra, a gema de ovo tem uma absorbância maior o que leva a pensar que existe mais proteína na gema do que na clara, o que não poderia ser possível, sendo assim uma razão possível para isso ter ocorrido poderia ser erro de pipetagem dos alunos ou até mesmo uma contaminação. Na bebida à base de soja é possível observar uma absorbância bem menor e consequentemente uma concentração de proteínas totais bem menor, quando comparados as outras amostras.
Para saber as concentrações de proteínas totais de cada amostra utilizada foram usadas duas curvas padrão uma de caseína e uma de albumina. Considerando a equação da reta de ambas:
y = 0,0373x – 0,002
em que, 
y = valor da absorbância 
x = valor da concentração (mg de proteína)
Encontramos que,
Para o Leite Integral a 5%:
Absorbância: 0,212
0,212 = 0,0373x – 0,002
0,214 = 0,0373x
x = 5,7 mg de proteína 
Como foi transportado uma amostra de 5 mL para um balão de 100 mL:
5,7 mg ------ 5 mL
 x mg ------ 100mL
x = 154 mg em 100 mL
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:
154 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 30,8 mg/g da amostra
Para a gema de ovo:
Absorbância: 0,417
0,417 = 0,0602x + 0,002
0,415 = 0,0602x
x = 6,89 mg de proteína na alíquota de 1 mL
Como foi transportado para a amostra 1 mL para um balão de 100 mL:
6,8 mg ------ 1 mL
x mg ------ 100mL
x = 686 mg
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:
686 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 137,2 mg/g da amostra
Para a Clara do ovo:
Absorbância: 0,340
0,340 = 0,0602x + 0,002
0,338 = 0,0602x
x = 5,6 mg de proteína na alíquota de 1 mL
Como foi transportado para a amostra 1 mL para um balão de 100 mL:
5,6 mg ------ 1 mL
x mg ------ 100mL
x = 561 mg
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:
561 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 112 mg/g da amostra
Para a bebida à base de soja
Absorbância: 0,070
0,070 = 0,0373x – 0,002
0,068 = 0,0373x
x = 1,82 mg de proteína na alíquota de 1 mL
Como foi transportado para a amostra 1 mL para um balão de 100 mL:
1,82 mg ------ 1 mL
x mg ------ 100mL
x = 182 mg
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:
182 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 36,4 mg/g da amostra
Podemos observar de acordo com os cálculos realizados que a gema de ovo teve maior concentração de proteínas totais em relação a clara, o que não era o esperado umas vez que a clara tem maior concentração de proteínas que a gema.
Para as concentrações de leite integral e bebida à base de soja de acordo com os rótulos, os valores foram muito baixos em relação ao valor real, como pode ser observado na seguinte tabela.
	Amostra
	Valor teórico (de acordo com o rótulo)
	Valor experimental
	Leite integral
	190 mg/g
	30,8 mg/g
	Bebida à base de soja
	420 mg/g
	36,4 mg/g
Tanto no leite integral como na bebida à base de soja houve uma distorção dos valores, apresentando um quantitativo de proteína muito maior que os valores obtidos experimentalmente. Isso pode ser explicado pela proporção feita, pois a quantidade de proteína contida no rótulo para 200 mL é de 1,2 g e para 100 mL é de 0,6 g. Para 1 g, o valor é significativamente maior, por isso ocorreu uma discrepância entre os valores. Considerando os erros de pipetagem e contaminação de amostra, as diluições talvez não tenham sido
feitas corretamente, uma vez que foram muitas pessoas realizando o procedimento.
6. CONCLUSÃO 
Os valores experimentais estão de acordo com a literatura, pois a clara e gema do ovo apresentaram as maiores absorbâncias, consequentemente maiores concentrações de proteína. No entanto a gema apresentou concentração maior o que não era o esperado, então pode-se considerar nesse caso um erro de pipetagem, contaminação entre outros fatores. O leite integral deveria ser mais próximo e o da bebida de soja apresentou a menor concentração de proteína, como o esperado. Pode-se concluir que o uso do método de biureto para determinação de proteínas é um método simples, rápido e barato, apresentando resultados experimentais relativamente satisfatórios, apesar da distorção dos valores entre o teórico e o experimental.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ZAIA, Dimas A. M.; ZAIA, Cássia Thaïs B. V.; LICHTIG, Jaim. Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Quím. Nova [online]. 1998, vol.21, n.6, p. 787-793. ISSN 0100-4042.
PARK, K. J.; ANTONIO, G. C. Análises de materiais biológicos. Campinhas: Unicamp, 2006. 21p
ZAIA, D. A. M.; ZAIA C. T. B. V.; LICHTIG J.; Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, 21(6) (1998).