Apostila Microbiologia de Alimentos

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Apostila de Aula Prática de Microbiologia Geral. Coelho, A. F. S. 
 
 
ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Apostila de Aula Prática 
Disciplina: Microbiologia de Alimentos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Elaborado por: Profª Drª Ana Flávia Santos Coelho 
Alunos colaboradores: 
Karuane Saturnino da Silva 
Brenda Neres Targino 
Carlos Eduardo Gomes 
 
 
 
 
 
PALMAS 
2011
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
1
Índice
 
Aula prática nº1- Coleta, transporte e estocagem de amostras para análise microbiológica2 
Aula prática nº2 - Recepção e preparo de amostras para análise microbiológica ............... 6 
Aula prática nº3 - Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotrófilos 
em placas .......................................................................................................................... 11 
Aula prática nº4 - Contagem total de bolores e leveduras em placas ................................ 14 
Aula prática nº5 - Análise microbiológica de água potável ................................................ 17 
Aula prática nº6 - Análise microbiológica de frutas ............................................................ 21 
Aula prática nº7 - Análise microbiológica de hortaliças ...................................................... 27 
Aula prática nº8 - Análise microbiológica de produtos cárneos ......................................... 29 
Aula prática nº9 - Análise microbiológica de produtos lácteos ........................................... 33 
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Aula Prática nº 01 
 
 
COLETA, TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 
MICROBIOLÓGICA 
 
 
Objetivo: Fornecer ao aluno noções básicas sobre os procedimentos de coleta, 
transporte e estocagem de amostras para análise microbiológica. 
 
Plano de amostragem: A coleta de amostras para a avaliação de lotes de 
alimentos processados, deve obedecer a planos de amostragem que permitam 
tomar decisões a respeito do destino dos lotes. Para a seleção de planos de 
amostragem adequados a cada tipo de produto, consultar International Commision 
on Microbiological Specifications for Foods (1978), cujas recomendações foram 
adotadas como oficiais pela Resolução RDC n° 12, de 02/01/01 da Agência Nacional 
de Vigilância Sanitária (ANVISA) (Anexo 1). 
 
1. Definições 
 
Lote: quantidade de alimento de mesma composição e características físicas, 
químicas e sensoriais, produzidos sob mesma condição, com produção dentro de 
um intervalo de tempo em uma linha de produção. 
 
Amostra de lote: determinado número de entidades individuais escolhidas ao 
acaso. 
 
Unidade de amostra: são as entidades individuais. 
 
Unidade analítica: é a quantidade de alimento efetivamente utilizada na análise de 
uma unidade de amostra. 
 
 A unidade de amostra tem uma quantidade variável de produto devendo sempre 
tomar o cuidado de tomar quantidades suficientes para estocagem de contra-
amostras e prevenção de perdas por acidentes. 
 Uma amostra de lote é composta de “n” unidades de amostra e cada unidade de 
amostra é sempre analisada individualmente. Os resultados da análise de uma única 
amostra não podem ser tomados como representativos do lote. 
 
2. Coleta de amostras para análise 
 
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2.1 Alimentos acondicionados em embalagens individuais 
 
� Coletar e encaminhar o alimento ao laboratório para análise em sua embalagem 
comercial original, fechada e intacta; 
� A embalagem unitária deverá conter quantidade de alimento maior que duas 
vezes o peso ou volume da unidade analítica, no mínimo. Se não, recomenda-se 
coletar várias embalagens unitárias, como parte de uma mesma unidade de 
amostra. No momento da análise, juntar o conteúdo das diversas embalagens 
em um único frasco estéril, misturando bem e retirar a unidade analítica da 
mistura. Se o produto não permitir mistura, tomar de cada uma das embalagens 
unitárias, porções de peso aproximadamente igual, para compor a unidade 
analítica daquela unidade de amostra. 
 
2.2 Alimentos acondicionados em embalagens não individuais 
 
� Exemplo: alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens, impossíveis 
de serem transportadas para o laboratório. 
� Transferir porções representativas da massa total para frascos de coleta ou 
sacos estéreis (material aprovado para contato com alimentos, autoclavável, 
tampa a prova de vazamento, tamanho adequado – quantidade recomendável 
200g de alimentos sólidos ou 300-500mL de produtos líquidos), sob condições 
assépticas; 
� Utilizar no máximo ¾ da capacidade do frasco de coleta na tomada da unidade 
analítica para facilitar posterior mistura da amostra na tomada da unidade 
analítica; 
� Frascos e utensílios utilizados na coleta devem ser previamente esterilizados; 
� Procedimento para coleta: promover uma mistura de toda a massa de alimento 
antes de iniciar a coleta das unidades de amostra. Se não for possível a mistura, 
compor a unidade de amostra com porções de diferentes partes do conteúdo. 
Obs.: Para amostras em pó utilizar amostradores. Usar um amostrador estéril 
diferente para cada unidade de amostra coletada ou desinfetar o instrumento entre 
uma amostragem e outra. Para compor uma unidade de amostra com porções de 
diferentes pontos em amostras sólidas, usar facas e pinças para cortar pedaços 
menores do alimento. 
 
2.3 Alimentos envolvidos em surtos de toxinfecções alimentares 
 
� Coletar a amostra o mais cedo possível; 
� Não coletar amostras que tenham sofrido abuso de temperatura ou que já se 
encontrem em estado de parcial deterioração; 
� Se não houver sobras do alimento suspeito: 
� Coletar vasilhames onde o mesmo encontrava-se acondicionado; 
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� Coletar amostras do lote de ingredientes e matéria-prima utilizados em 
seu preparo; 
� Coletar amostras de refeições similares, preparadas posteriormente sob 
as mesmas condições. 
 
2.4 Água 
 
� As amostras de água clorada devem ter o cloro residual neutralizado 
imediatamente após a coleta, para impedir a continuação do seu efeito 
bactericida sobre a microbiota presente: 
� Procedimento de neutralização: Adicionar 0,1mL de uma solução 10% de 
tiossulfato de sódio aos frascos de coleta, antes da esterilização, para 
cada 100mL de amostra que se pretende coletar. 
� Para amostras de torneiras e tubulações limpar a área externa com etanol 70%, 
flambar se o material for resistente ao fogo e deixar a água fluir por 2 a 3 minutos 
antes da coleta; 
� Caso aconteça da amostra ser coletada e enviada ao laboratório pelo próprio 
interessado, sem prévia neutralização do cloro, adicionar a solução de tiossulfato 
de sódio estéril, imediatamente após a chegada da amostra, sob condições 
assépticas. 
 
3. Informações que devem acompanhar a amostra 
 
� Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação; 
� Fabricante, data de fabricação, código do lote; 
� Solicitante da análise; 
� Data e local de coleta da amostra; 
� Razão da análise. 
 
4. Transporte e estocagem das amostras para análise 
 
� Regra geral: transportar e estocar amostras de alimentos da mesma forma 
como o produto é normalmente transportado e estocado na sua 
comercialização: 
Tipos de alimentos Transporte e estocagem 
Estéreis em embalagens herméticas Temperatura ambiente e protegidos de temperaturas 
acima de 45ºC. Obs: Latas estufadas deverão ser 
transportadas e mantidas sob refrigeração. 
Desidratados, secos ou concentrados Temperatura ambiente e protegidos contra a umidade. 
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Perecíveis comercializados na forma 
refrigerada 
Refrigerados até o momento da análise. O tempo de 
estocagem máxima da amostra não deverá ultrapassar 36 
horas. 
Perecíveis comercializados na forma 
congelada 
Congelados até o momento da análise. A temperatura de 
estocagem não deve ser superior a –10ºC. 
 
� O transporte de amostras perecíveis resfriadas ou congeladas pode ser feito 
em caixa de isopor com gelo (mantido dentro de sacos plásticos, para evitar o 
acúmulo de líquido nas caixas, durante 24-30 horas se bem fechadas e com 
gelo suficiente, envolvendo toda amostra); 
� No transporte prolongado usar gelo seco. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula Prática nº 02 
 
 
RECEPÇÃO E PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA 
 
 
Objetivo: Fornecer ao aluno noções básicas sobre a importância dos procedimentos 
de recepção e preparo de amostras para análise microbiológica de maneira a obter 
resultados laboratoriais válidos. 
 
1. Recepção 
 
� Observar as condições da embalagem; 
� Observar as condições em que foi feito o transporte; 
� Recusar qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com 
corpos estranhos; 
� No caso de amostras encaminhadas por consumidores (embalagem aberta) 
anotar as condições em que a embalagem foi recebida. 
 
2. Preparação 
 
Etapas: 
� Retirada da unidade analítica; 
� Preparação de diluições decimais seriadas da unidade analítica, para 
inoculação nos meios de cultura. 
 
Técnica de diluição decimal seriada (Figura 1): 
 
� O diluente utilizado deve ser o mesmo em todas as diluições (Tipos de 
solução diluente – Anexo 2); 
� O número de diluições requeridas dependerá do nível de contaminação; 
� Na transferência de volumes entre as diluições, usar sempre pipetas 
diferentes para cada diluição, e que tenham capacidade no máximo 10 vezes 
superior ao volume a ser pipetado. A pipeta deve ser completamente 
preenchida e o volume descarregado a partir da marca superior, com a ponta 
da pipeta encostada na parede interna do tubo. 
Obs.: Não flambar pipetas. 
 
 
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Figura 1. Esquema do preparo da diluição decimal seriada. 
 
2.1 Preparação de amostras de alimentos sólidos ou líquidos concentrados 
 
a) Antes de abrir a embalagem desinfetar a área externa com etanol 70% (Tipos de 
solução desinfetante – Anexo 2) para remover contaminantes presentes; 
b) Promover a homogeneização da amostra; 
c) Abrir a embalagem utilizando um utensílio (faca, tesoura etc) previamente 
esterilizado. O intervalo entre a homogeneização e a retirada da unidade 
analítica não deverá exceder 15 minutos; 
d) Retirar assepticamente a unidade analítica (25 gramas para maioria dos 
alimentos) da amostra a ser utilizada na análise e transferir para um frasco de 
homogeneização esterilizado e tarado. 
 
Casos especiais: 
Tipo de alimento Retirada da amostra 
Peças de alimentos sólidos 
(ex: carnes, salsichas, queijos duros) 
Cortar pedaços menores, de diversos pontos da peça, até 
se obter a quantidade requerida para a análise. 
Amostras heterogêneas (ex: bolos 
recheados, tortas e pratos prontos) 
Tomar porções das diferentes camadas. Obs: Surtos de 
toxinfecções. 
Alimentos congelados Não deverá haver descongelamento prévio. 
Amostras com quantidades menores do 
que a necessária 
Metade será a amostra para análise e a outra metade será 
contra-amostra. 
Moluscos e conchas Esfregar as conchas sob água corrente removendo todos 
os resíduos aderidos à casca, colocar as conchas sobre 
toalha estéril até secar. Abrir as conchas e recolher o 
organismo e o líquido em frasco estéril tarado. Higienizar 
as mãos entre a abertura de uma concha e outra. 
Ovo em casca Retirar os ovos da geladeira e transferir para uma estufa a 
20ºC - 25ºC e então para temperatura ambiente. Lavar os 
ovos com água e detergente, drenar o excesso de líquido, 
mergulhar em álcool 70% por 10 min. e flambar. Quebrar a 
casca e verter o conteúdo interno em um frasco estéril. 
Homogeneizar durante 1 a 2 min, antes da adição do 
diluente. 
25g da amostra +
225ml de H2O p
10-1
 
Homogeneização
10-310
-2
 
1ml1ml
 
9ml
H2Op
9ml
H2Op
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e) Adicionar o diluente e homogeneizar (pode-se agitar manualmente o frasco, usar 
“shaker” rotativo, triturar em liquidificador 8000 -15000rpm durante 1 a 2 min., 
usar “stomacher” por 30 a 60 segundos) a unidade analítica para permitir diluição 
e inoculação nos meios de cultura. O intervalo entre a homogeneização e o 
preparo das diluições não deverá ultrapassar 3 minutos; 
 
2.2 Preparação de amostras líquidas 
 
a) Antes de abrir a embalagem desinfetar a área externa com etanol 70% (Tipos de 
solução desinfetante – Anexo 3) para remover contaminantes presentes. Abrir a 
embalagem utilizando utensílio (faca, tesoura etc) previamente esterilizado; 
 
b) Para amostras líquidas promover a agitação quando acondicionadas em frascos 
com espaço suficiente, antes da retirada da unidade analítica. Se não houver 
espaço suficiente, utilizar um segundo frasco estéril, transferindo a amostra de 
um frasco para outro por três vezes; 
 
c) Realizar a diluição decimal seriada (primeiramente transferindo 1,0mL da 
amostra para 9,0mL de diluente ou 10mL da amostra para 90mL de diluente ou 
ainda 25 a 50mL para 225mL a 450mL de diluente, dependendo do grau de 
contaminação esperado); 
 
Obs.: Amostras de bebidas e refrigerantes gaseificadas, quando não analisadas 
pelo método de filtração em membrana, devem ser agitadas, em frasco estéril, até 
expulsão completa dos gases. 
 
d) O intervalo entre a retirada da unidade analítica não deve ultrapassar 3 minutos; 
 
2.3 Preparação de amostras pela técnica da lavagem superficial 
 
� Transferir toda a amostra ou parte dela (50g) para um frasco estéril tarado e 
pesar; 
� Adicionar o volume de diluente requerido para diluição inicial desejada (1:1 na 
maioria dos casos); 
� Lavar a amostra agitando vigorosamente o frasco por cerca de 50 vezes; 
� Realizar as diluições e proceder a análise microbiológica; 
 
Cálculo dos resultados 
 
� Os resultados podem ser expressos em unidades formadores de colônias 
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(UFC/grama) ou em número mais provável (NMP/grama); 
� Primeiramente calcular em UFC ou NMP por mL de água de lavagem, em 
função das diluições inoculadas dessa água, com concentração inicial de 100; 
� Em seguida, converter o UFC ou NMP obtido em UFC ou NMP por grama de 
amostra, em função da diluição inicial utilizada na lavagem (peso de amostra: 
volume de diluente). 
� Exemplo: Se a diluição for 1:1, cada mL de lavado corresponderá a 1,0g de 
amostra e o valor do NMP ou UFC/g será igual ao valor obtido por mL. Se a 
diluição for diferente de 1:1, deve-se primeiro calcular a quantos gramas de 
amostra corresponde 1,0mL de lavado. Por exemplo: se uma carcaça de 
frango de 1,5kg for lavada com 300mL de diluente, cada mL de lavado 
corresponderá a 5,0g de amostra. Neste caso o NMP ou UFC/g de amostra 
será igual ao NMP ou UFC/mL de lavado, dividido por cinco. 
 
2.4 Preparação de amostras pela técnica do esfregaço de superfície 
� Delimitar a área amostrada usando um molde estéril; 
� Aplicar o “swab” com pressão, numa inclinação aproximada de 45º, 
descrevendo movimentos da esquerda para direita e depois decima para 
baixo. Rodar continuamente o “swab” para que toda superfície do algodão 
entre em contato com a amostra. Se a superfície estiver seca, umedecer o 
“swab” no diluente antes da sua utilização e remover o excesso; 
 
Exemplos: 
Tipos de superfícies Procedimento 
Meias carcaças de bovinos e suínos Selecionar 5 pontos, aplicar um “swab” em cada um dos 
pontos; colocá-los em um mesmo frasco com 25mL de 
diluente; agitar por 2 min. 
Cortes comerciais de carcaças Selecionar 5 pontos de 10cm2 na superfície dos cortes e 
proceder como descrito anteriormente. 
Carcaças de aves Selecionar 5 pontos de 10cm2 na superfície da carcaça 
(dorso, asas, ante-coxas e pescoço) e proceder como 
anteriormente. 
Peixes Selecionar 5 pontos de 10cm2 na superfície de peixes 
grandes ou amostrar a peça inteira, no caso de peixes 
pequenos. Proceder como descrito anteriormente. 
 
Cálculo dos resultados 
 
� Os resultados podem ser expressos em UFC ou NMP por cm2 de amostra; 
� Primeiramente calcular em UFC ou NMP por mL de diluente onde foi 
suspendido o material coletado com os “swabs”. Considerar essa suspensão 
com concentração inicial de 100; 
� Em seguida, converter o UFC ou NMP obtido em UFC ou NMP por cm2 de 
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amostra, calculando quantos cm2 corresponde cada mL da suspensão. 
� No caso de meias carcaças de bovinos, por exemplo, cada mL de suspensão 
corresponde a 2 cm2 de amostra, porém, essa relação pode ser alterada a 
critério do analista, dependendo do tipo de amostra e objetivo da 
amostragem. É recomendável trabalhar sempre com volumes de diluente 
múltiplos das áreas amostradas, para facilitar os cálculos. No caso das meias 
carcaças de bovinos, o NMP ou UFC/ cm2 será igual ao valor obtido por mL 
de suspensão, dividido por dois. Numa outra situação, em que um esfregaço 
de 100 cm2 de área fosse suspendido em 10,0 mL de diluente, por exemplo, 
cada mL de suspensão corresponderia a 10 cm2 de área e o NMP ou UFC/ 
cm2 seria igual ao valor obtido por mL de suspensão, dividido por dez. 
 
3. Material requerido para análise 
 
- 1 Frasco para 225mL; 
- 2 Tubos de cultura para 9mL; 
- Água destilada – 1000mL; 
- Béquer, proveta, balão volumétrico, bastão de vidro, pipeta, espátula e balança. 
- Meio de cultura: Peptona – 1,0g; 
- Reagente: cloreto de sódio – 8,5g; 
- Papel kraft e barbante. 
 
4. Procedimento 
 
- Dissolver os componentes em água destilada; 
- Distribuir em frascos e tubos em volumes apropriados; 
- Esterilizar em autoclave a 121°C/15min. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula Prática nº 03 
 
 
CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS E 
PSICROTRÓFILOS EM PLACAS 
 
 
 
1. Material requerido para a análise 
 
1.1 Preparação da amostra e diluições seriadas 
- Diluente: 225mL de solução salina peptonada; 
- Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0mL de solução salina peptonada/tubo; 
- Pipetas: 3 pipetas com capacidade de 1,0mL. 
 
1.2 Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos em profundidade 
- Meio de cultura: 3 Placas de Petri esterilizadas; 
- Ágar Padrão para Contagem (PCA); 
- Estufa incubadora: 1 estufa regulada à 35ºC. 
 
1.3 Contagem total de microrganismos aeróbios psicrotrófilos em superfície 
- Meio de cultura: 3 Placas de Petri com Ágar Padrão para Contagem (PCA); 
- Alça de espalhamento: 1 alça de Drigalsky mergulhada em álcool; 
- Estufa incubadora: 1 estufa regulada à 7ºC. 
 
 
2. Procedimento (Figura 2): 
 
2.1 Preparação das amostras e diluições seriadas 
 
2.2 Contagem pelo método de plaqueamento em profundidade 
 
� Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 1,0mL de cada 
diluição em Placas de Petri separadas, estéreis e vazias, abrindo as placas 
apenas o suficiente para inserir a pipeta, próximo ao Bico de Bunsen; 
� Adicionar o meio de cultura: verter nas placas inoculadas, 15 a 20mL de Ágar 
Padrão para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45ºC. 
Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as 
placas, numa superfície plana. Os movimentos podem ser na forma de oito ou 
movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no 
sentido anti-horário; 
� Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura, inverter as 
placas e incubar a 35º por 48 horas; 
� Contagem das colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 25 
a 250 colônias e contá-las com auxílio de uma lupa ou contador de colônias. 
Calcular o número de unidades formadoras de colônia (UFC) por grama ou 
mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição 
inoculada. Expressar o resultado em UFC/mL ou UFC/g. 
 
 
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2.3 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície 
 
� Preparação das placas: para o plaqueamento em superfície, as placas devem 
ser previamente preparadas, com 15 a 20mL do meio adequado ao grupo de 
microrganismos que se objetiva determinar; 
� Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0,1mL 
de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando 
uma alça de Drigalsky, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até 
que todo o excesso de líquido seja absorvido; 
� Incubação: aguardar que as placas sequem (15 minutos), inverter e incubar 
7ºC/10 dias, 17ºC/16 horas seguidas de 7ºC/3 dias; 
� Contagem das colônias e cálculo dos resultados: seguir as recomendações 
anteriores, porém, multiplicar o resultado por 10, para levar em conta o 
volume dez vezes menor inoculado. Expressar o resultado em UFC/mL ou 
UFC/g. 
 
 
 
 
Obs.: Caso tenha sido utilizada mais de uma placa diluição, considerar como 
número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma da placas. 
 
10-1 10-310
-2
25g da amostra +
225ml de H2O sp
Homogeneização 1ml1ml
1ml ou 0,1ml
PCAÁgar Padrão para Contagem (PCA) 
plaqueamento em profundidade ou superfície
CONTAGEM TOTAL DE
AERÓBIOS MESÓFILOS
 UFC/g
35 1°C/ 48 2h
1ml ou 0,1ml1ml ou 0,1ml
9ml
H2Op
9ml
H2Op
PCA
 
 
Figura 2. Esquema geral da análise para contagem total de microrganismos 
aeróbios mesófilos em placas. 
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3. Informações relativas à amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação: _______________________ 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote:___________________________ 
- Solicitante da análise:_______________________________________________ 
- Data e local de coleta da amostra:_____________________________________ 
- Razão da análise:__________________________________________________ 
 
4. Resultados 
 
Obs: Utilizar as regras para cálculo dos resultados na contagem de microrganismo 
por plaqueamento – Anexo 4). 
 
4.1 Contagem pelo método de plaqueamento em profundidade: 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
4.2 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície: 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
5. Conclusão___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 Aula Prática nº 04 
 
 
CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS EM PLACAS 
 
 
 
1. Material requerido para análise 
 
 
1.1 Preparação da amostra e diluições seriadas 
- Diluente: 225mL de solução salina peptonada; 
- Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0mL de solução salina peptonada/tubo; 
- Pipetas: 3 pipetas com capacidade de 1,0mL. 
 
 
1.2 Contagem de bolores e leveduras em superfície 
- Meio de cultura: 3 Placas de Petri com Ágar Padrão para Contagem suplementado 
com 100mg de cloranfenicol para 1000mL de meio de cultura (PCA-cloranfenicol). 
Outros meios que podem ser usados: Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18) – 
alimentos com atividade de água baixa; Ágar Dicloran Rosa de Bengala 
Cloranfenicol (DRBC) – demais alimentos; Ágar Batata Dextrose Acidificado (PDA 
– acidificado) ou Ágar Batata Dextrose com antibióticos (PDA – antibióticos); 
- Alça de espalhamento: 1 alça de Drigalsky mergulhada em álcool; 
- Estufa incubadora: 1 estufa regulada a 25ºC. 
 
 
2. Procedimento (Figura 3): 
 
2.1 Preparação da amostra e diluições seriadas 
 
2.2 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície 
 
� Preparação das placas: para o plaqueamento em superfície, as placas devem 
ser previamente preparadas, com 15 a 20mL do meio adequado ao grupo de 
microrganismos que se objetiva contar; 
� Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0,1mL 
de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando 
uma alça de Drigalsky, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até 
que todo o excesso de líquido seja absorvido; 
� Incubação: aguardar que as placas sequem (15 minutos), inverter e incubar a 
25ºC/5 dias, placas não invertidas (observar as placas aos 3 dias de 
incubação e, caso haja crescimento de bolores com colônias espalhadas, 
efetuar a contagem, para prevenir a perda das placas por espalhamento total 
dessas colônias. Caso não seja observado risco de espalhamento, reincubar 
as placas e contar com 5 dias de incubação). 
� Contagem das colônias e cálculo dos resultados: contar placas com 10 a 150 
colônias. Multiplicar o resultado por 10, para levar em conta o volume dez 
vezes menor inoculado. UFC/g ou mL = nº colônias X 10/diluição. 
 
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Obs.: Caso tenha sido utilizada mais de uma placa diluição, considerar como 
número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das 
placas. 
10-1 10-310
-2
25g da amostra +
225ml de H2O sp
Homogeneização 1ml1ml
 0,1ml
Ágar Dicloran Rosa de Bengala 
 Cloranfenicol (DRBC)
ou Ágar Diclorab Glicerol 18 
 (DG 18)
plaqueamento em superfície
0,1ml0,1ml
9ml
H2Op
9ml
H2Op
DRBC ou DG 18 DRBC ou DG 18
22-25°C/5 dias
Colônias presuntivas
 de leveduras
5 colônias
Observação microscópia
 da morfologia das
 células
% de colônias 
 confirmadas
CONTAGEM DE LEVEDURAS
 (UFC/g)
CONTAGEM DE BOLORES
 (UFC/g)
Colônias típicas de bolores
Somatório
CONTAGEM TOTAL
 DE BOLORES E 
 LEVEDURAS
 (UFC/g)
Figura 3. Esquema geral da análise para contagem de bolores e leveduras em 
placas. DRBC = Agar Dicloran Rosa de Bebgala Cloranfenicol, DG18 = Agar 
Dicloran Glicerol 18. 
 
 
 
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16
3. Informações relativas a amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação:_______________________ 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote:___________________________ 
- Solicitante da análise_______________________________________________ 
- Data e local de coleta da amostra:_____________________________________ 
- Razão da análise:__________________________________________________ 
 
4. Resultados 
 
Obs: Utilizar as regras para cálculo dos resultados na contagem de microrganismo 
por plaqueamento – Anexo 4). 
 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
5. Conclusão 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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17
Aula Prática nº 05 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA POTÁVEL 
 
 
1. Definições 
 
Água potável é a água para consumo humano cujos parâmetros 
microbiológicos (Tabela 1 – Anexo 5), físicos, químicos e radioativos atendam ao 
padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde. 
 
- Coliformes totais (bactérias do grupo coliforme): bacilos gram-negativos, 
aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, capazes de 
desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos, fermentam a 
lactose com produção de ácido e gás a 35,0 ± 0,5ºC em 24-48 horas, e que 
podem apresentar atividade da enzima ß-galactosidase. A maioria das bactérias 
do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e 
Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo; 
- Coliformes termotolerantes: subgrupo das bactérias do grupo coliforme que 
fermentam a lactose a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas, tendo como principal 
representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal; 
- Escherichia coli: bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, 
com produção de ácido e gás a 44,5 ± 0,2ºC em 24 horas, produz indol a partir do 
triptofano, apresenta atividade das enzimas ß-galactosidase e ß-glucoronidase, 
sendo considerada o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de 
eventual presença de organismos patogênicos. 
 
2. Amostragem 
 
Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto 
representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a ser examinado. 
Quantidade > 100mL. 
 
3. Determinação 
 
2.1 Teste de presença e ausência 
2.2 Técnica da membrana filtrante 
2.3 Técnica dos tubos múltiplos 
 
 
 
 
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18
a. Material requerido para análise 
 
- 1 Frasco esterilizado para coleta de água; 
- 1 Pipeta com capacidade de no máximo 10 mL; 
- 10 tubos com 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
- 1 Alça de níquel-cromo; 
- 10 Tubos com 10 mL de Caldo E coli (EC); 
- 10 Tubos com 10 mL de Caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
- 1 Alça de Drigalsky; 
- Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB). 
 
b. Procedimento (Figura 4): 
 
b.1 Preparação da amostra: Homogeneizar a amostra por agitação. 
 
b.2 Teste presuntivo: Com uma pipeta de 10mL ou 25mL, adicionar 10 porções de10mL em tubos contendo 10mL do meio Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com 
tubos de Durhan. Incubar os tubos a 35ºC/24 horas e observar se há crescimento 
com produção de gás. Em caso positivo passar aos ítens subseqüentes. Em caso 
negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. Se continuar negativo 
indica ausência de coliformes (totais, termotolerantes e E. coli) nos 100mL da 
amostra. 
 
b.3 Teste confirmativo - Coliformes totais: A partir de cada tubo positivo da etapa 
anterior, transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos com Caldo 
Verde Brilhante Bile (VB). Incubar os tubos a 35ºC por 24-48 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás, confirmativo para coliformes totais. Anotar o 
número de tubos VB com gás e determinar o Número Mais Provável de coliformes 
totais/100mL (Tabela 2 – Anexo 5). A não ocorrência de gás após 48 horas de 
incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. 
 
b.4 Teste confirmativo - Coliformes termotolerantes: A partir de cada tubo 
positivo da letra b.2, transferir uma alçada carregada da cultura para tubos de Caldo 
E. coli (EC). Incubar os tubos a 44,5ºC por 24 horas e observar se há crescimento 
com produção de gás, confirmativo de coliformes termotolerantes. Anotar o número 
de tubos de EC com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes 
termotolerantes/100mL (Tabela 2– Anexo 3). A não ocorrência de gás após 24 horas 
de incubação indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. 
 
b.5 Confirmação de E. coli: Tomar uma alçada de cada cultura obtida em cada 
tubo de EC com produção de gás e estriar em placas de Ágar Eosina Azul de 
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19
Metileno (EMB). Incubar as placas a 35ºC/24 horas e observar se há 
desenvolvimento de colônias típicas de E. coli (nucledas com centro preto, com ou 
sem brilho metálico). Havendo colônias típicas, transferir duas delas bem isoladas 
para tubos com Ágar Nutriente (NA) inclinado e incubar os tubos a 35ºC/24 horas. A 
partir das culturas puras em NA, fazer coloração Gram e inocular os meios testes 
para realização das provas bioquímicas. 
 
b.6 Provas bioquímicas 
 
- Produção de Indol (+ ou -) 
- Prova vermelho de Metila (VM) (+) 
- Prova de Voges-Proskauer (VP) (-) 
- Utilização de citrato (-) 
 
c. Informações relativas à amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação:_______________________ 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote:___________________________ 
- Solicitante da análise:_______________________________________________ 
- Data e local de coleta da amostra_____________________________________ 
- Razão da análise:__________________________________________________ 
 
 
d. Resultados 
 
d.1 Coliformes totais:________________________________________________ 
d.2 Coliformes termotolerantes:________________________________________ 
d.3 Confirmação de E. coli: ___________________________________________ 
 
e. Conclusão 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
20
 
 
 
Figura 4. Esquema de análise de coliformes totais, termotolerantes e E. coli em 
água pelo método do NMP (Hunt e Rice, 2005 apud Silva et al., 2007). 
 
 
 
 
 
Água (100ml)
Caldo Lauril Sulfato
Triptose (LST)
Concentração dupla (10ml)
Tubos de LST
Crescimento e produção de gás
1 alçada
E. col i
E. a ero gene s
1 alçada
Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB)
3 porções:
Banho-maria
Caldo EC
Crescimeto a gás Caldo EC-MUG
Caldo Triptona 1%
Teste de Indol +
 CONTAGEM DE
 COLIFORMES
TERMOTOLERANTES
 NMP/ml
CONTAGEM DE
 NMP/ml
 E . coli
Crescimento com gás Fluorescência sob luz UV
 CONTAGEM DE
 COLIFORMES
TERMOTOLERANTES
 NMP/ml
CONTAGEM DE
 NMP/ml
 E . coli
10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
21
Aula Prática nº 06 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE FRUTAS 
 
 
 
1. Padrão microbiológico para frutas, produtos de frutas e similares 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
 
2. Material requerido para análise 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). 
 
 
3. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
 
- Técnica dos tubos múltiplos (Figura 5): 
 
a. Preparação da amostra: Observar os cuidados na abertura de embalagens, 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
22
se houver, e na retirada da unidade analítica (quantidade e cuidados assépticos). 
 
b. Homogeneização e preparo da diluição seriada: a homogeneização é 
precedida de uma diluição inicial de 1:10 (10-1), adicionando-se às 25g da 
amostra, 225mL de um diluente adequado (água peptonada 0,1% ou solução 
salina peptonada, são os mais comuns). Para a preparação da segunda diluição 
(10-2), transferir assepticamente 1,0 mL da diluição 10-1 para 9,0 mL de diluente, 
sendo as diluições subseqüentes obtidas da mesma maneira. 
 
c. Teste presuntivo: Selecionar três diluições adequadas da amostra e, com 
uma pipeta de, no máximo 10 mL, inocular uma série de três tubos de Caldo 
Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição, adicionando-se 1,0 mL da diluição por 
tubo com 10 mL de Caldo. 
 
d. Incubação: Incubar os tubos de LST a 35ºC por 24 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás. Em caso positivo, passar para os itens 
subsequentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a 
leitura. 
 
e. Teste confirmativo 
 
e.1 Coliformes totais: A partir de cada tubo positivo da letra d) transferir uma 
alçada bem carregada da cultura para tubos com Caldo Verde Brilhante Bile (VB). 
Incubar os tubos a 35ºC por 24-48 horas e observar se há crescimento com 
produção de gás. Anotar o número de tubos VB com gás e determinar o Número 
Mais Provável de coliformes totais NMP/g ou mL na em tabela apropriada às 
diluições inoculadas (Tabela 1 – Anexo 7). 
 
e.2 Coliformes termotolerantes: A partir de cada tubo positivo da letra d) 
transferir uma alçada carregada da cultura para tubos de Caldo E. coli (EC). 
Incubar os tubos a 44,5ºC (maioria dos alimentos) por 24 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes termotolerantes. 
Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o Número Mais Provável 
NMP/g ou mL na em tabela apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1 – Anexo 
7). 
 
f. Contagem de E. coli: Tomaruma alçada de cada cultura obtida em cada tubo 
de EC com produção de gás e estriar em placas de Ágar Eosina Azul de Metileno 
(EMB). Incubar as placas a 35ºC/24 horas e observar se há desenvolvimento de 
colônias típicas de E. coli (nucledas com centro preto, com ou sem brilho 
metálico). Havendo colônias típicas, transferir duas delas bem isoladas para 
tubos com Ágar Nutriente (NA), inclinados e incubar os tubos a 35ºC/24 horas. A 
partir das culturas puras em NA, fazer coloração Gram e inocular os meios para 
realização de provas bioquímicas de indol (+ ou -), VM (+), VP (-) e citrato (-) 
(IMVC). 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
23
 
3.2 Pesquisa de Salmonela (Figura 6): 
 
a. Pré-enriquecimento: Objetiva a recuperação de células injuriadas, conseguida 
incubando-se a amostra em condições não seletivas, por pelo menos 18 horas. 
Os meios disponíveis são variados, porém existe o mais utilizado é a água 
peptonada tamponada, recomendado pela International Commission on 
Microbiological Specifications for Food (ICMSF), International Organization for 
Standardization (ISO) e Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Esta 
etapa consiste em retirar 25g ou 25mL de unidade analítica e transferir para um 
frasco de homogeneização, previamente esterilizado e tarado. Adicionar 225mL 
de caldo de pré-enriquecimento e homogeneizar a amostra. Incubar os frascos a 
35º/18-24 horas, com as tampas ligeiramente afrouxadas. 
 
b. Enriquecimento seletivo: Objetiva inibir a multiplicação da microbiota 
acompanhante e promover a elevação preferencial do número de células de 
Salmonella sp., incubando a amostra pré-enriquecida em caldo seletivo, por 18 a 
24 horas. É recomendado o uso de dois diferentes meios de enriquecimento, 
porque a resistência de Salmonela aos agentes seletivos varia de cepa para 
cepa. Nesta etapa agitar delicadamente o frasco com caldo de pré-
enriquecimento e transferir 1,0 mL para 10 mL de Caldo Tetrationato (TT) e 1,0 
mL para 10 mL de Caldo Selenito Cistina (SC) ou Caldo Rappaport Vassilidis 
(RV). Incubar ambos os caldos a 35ºC por 24 horas. 
 
c. Plaqueamento diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial 
de colônias de Salmonela, com características típicas que as diferencie dos 
competidores, para posterior confirmação sorológica e bioquímica. Nesta etapa, 
agitar os tubos de enriquecimento seletivo em agitador tipo “vortex” e estriar uma 
alçada do caldo TT em placa de Ágar Entérico de Hectoen (HE), Ágar Bismuto 
Sulfito (BS) e Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). Repetir este procedimento 
com caldo SC ou RV. Incubar as placas invertidas a 35ºC por 24 horas e verificar 
se há desenvolvimento de colônias típicas de Salmonela. 
 
d. Confirmação: Objetiva verificar se as colônias típicas obtidas nas placas são 
realmente colônias de Salmonela através de provas bioquímicas. As colônias 
podem ser submetidas a seguinte seqüência de testes: crescimento em Ágar 
Tríplice Açúcar Ferro (TSI), crescimento em Ágar Lisina Ferro (LIA), teste da 
urease (-), teste de lisina descarboxilase (+), teste de Voges-Proskauer (-), teste 
de indol (-) e teste de β-galactosidase (-). É importante ressaltar que existem 
outras seqüências de provas bioquímicas além da citada. Além das provas 
bioquímicas, também é utilizado o teste sorológico. 
 
 
4. Informações relativas a amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação:_______________________ 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote:___________________________ 
- Solicitante da análise:_______________________________________________ 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
24
- Data e local de coleta da amostra:_____________________________________ 
- Razão da análise:__________________________________________________ 
 
 
 
5. Resultados 
 
5.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais:___________________________________________________ 
b. Coliformes termotolerantes:___________________________________________ 
c. Confirmação de E. coli:_______________________________________________ 
 
5.2 Detecção de Salmonela:____________________________________________ 
 
 
6. Conclusão 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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25
25g da amostra +
225ml de H2O sp
10-1
10-1
Homogeneização
10 -2 10-3
10-310-2
Teste presuntivo
Incubar a 35°C por 24-48 horas
1ml1ml1ml
Caldo LST ou
 LST-MUG
Teste confirmativo
Contagem de
 coliformes
 totais
Contagem de 
 coliformes 
termotolerantes
Contagem
 de E. coli
Tubo de
 LST + Caldo Verde 
Brilhante-VB
Incubar a 35°C por 24-48 horas
1 Alçada
Tubo de
 LST +
1 Alçada
Caldo E. coli
 EC
Tubo de 
 EC +
1 Alçada
Ágar Eosina Azul 
de Metileno-EMB
Incubar a 45,5°C por 24horas
Incubar a 35°C por 24horas
 
 
 
Figura 5. Esquema de análise para determinação de coliformes totais/termotolerantes 
e E.coli pelo método do número mais provável (NMP). 
 
 
 
 
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26
25g da amostra +
225ml de H2O sp
Homogeneização
1ml
Incubar a 35°C por 24horas
Incubar 35°C por 18-20 horas
1ml
Caldo 
tetrationato
TT (10ml)
Caldo
Selenito-Cistina
 SC (10ml)
Ágar Bismuto
 Sulfito - BS
 Ágar Xilose
 Lisina Deso-
xicolato - XLD
Ágar Entérico
de Hectoen-HE
Ágar Bismuto
 Sulfito - BS
 Ágar Xilose
 Lisina Deso-
xicolato - XLD
Ágar Entérico
de Hectoen-HE
Pré-enriquencimento
Enriquecimento
Isolamento
 
 
 
Figura 6. Esquema geral de análise para pesquisa de Salmonela em alimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
27
Aula Prática nº 07 
 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE HORTALIÇAS 
 
 
 
1. Padrão microbiológico para hortaliças, produtos de hortaliças e similares. 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
2. Material requerido para análise 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). 
 
3. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
 
- Técnica dos tubos múltiplos 
 
3.2 Detecção de Salmonela 
 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
28
4. Informações relativas a amostra 
 
- Tipo de amostrae processo utilizado na fabricação:_______________________ 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote:____________________________ 
- Solicitante da análise:_______________________________________________ 
- Data e local de coleta da amostra:_____________________________________ 
- Razão da análise:__________________________________________________ 
 
5. Resultados 
 
5.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais:__________________________________________________ 
b. Coliformes termotolerantes:__________________________________________ 
c. Confirmação de E. coli:______________________________________________ 
 
5.2 Detecção de Salmonela:____________________________________________ 
 
 
6. Conclusão 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
29
Aula Prática nº 08 
 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE PRODUTOS CÁRNEOS 
 
 
 
1. Padrão microbiológico para carnes e produtos cárneos. 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
1. Material requerido para análise 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD); 
� 3 Placas com Àgar Sal Manitol ou Ágar Baird Parker (BP); 
� 3 Placas de Petri esterilizadas; 
� 1 Erlenmeyer com 60mL de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) fundido; 
� 1 Jarra de anaerobiose; 
� 1 Gerador/indicador de anaerobiose. 
 
2. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
30
- Técnica dos tubos múltiplos. 
 
3.2 Detecção de Salmonela 
 
3.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo (Figura 7) 
 
a. Preparação da amostra 
 
b. Homogeneização e preparo das diluições seriadas 
 
c. Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra. Inocular 0,1mL 
de cada diluição na superfície de placas de Ágar Baird-Parker (BP) ou Ágar Sal 
Manitol, previamente preparadas e secadas. Espalhar o inóculo com uma alça de 
Drigalsky, até que todo excesso de líquido seja absorvido; 
 
d. Incubação: Aguardar que as placas sequem completamente e incubar 
invertidas, a 35ºC por 48 horas; 
 
e. Contagem de colônias presuntivas: selecionar placas com 20 a 200 colônias 
e contar as colônias típicas de S. aureus. No meio de cultura Ágar Baird-Parker 
(BP): colônias circulares, pretas, pequenas (máximo 1,5mm em diâmetro), lisas, 
convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçada nas bordas, 
rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para 
além da zona opaca. No meio de cultura Sal Manitol: amarela, com o halo 
amarelo, lisas e pequenas. 
 
f. Confirmação das colônias típicas: Teste de coagulase (+), teste de 
termonuclease (+) e teste de catalase (+). 
 
g. Cálculo dos resultados: UFC/g ou mL em função do número de colônias 
típicas, diluição inoculada e percentagem de colônias confirmadas. Exemplo: 
diluição 10-1, com 30 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 2 
confirmadas (20%). UFC/g ou mL = 30x101x0,2x10 = 6,0 x 102 UFC/g ou mL. 
 
 
3.4 Contagem de Clostrídios Sulfito Redutores 
 
a. Preparação da amostra. 
 
b. Homogeneização e preparo das diluições seriadas. 
 
c. Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular em 
placas de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC), plaqueamento em superfície ou 
em profundidade. Quando em superfície fazer uma sobrecamada após o 
espalhamento do inoculo. 
 
d. Incubação: Aguardar completa solidificação da sobrecamada e incubar as 
placas sem inverter, a 46ºC por 18 a 24 horas, em atmosfera anaeróbia (sistema 
gerador e indicador de anaerobiose); 
 
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31
e. Contagem de colônias presuntivas de clostrídios sulfito-redutores: 
selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar apenas as colônias pretas, 
típicas de clostrídios sulfito-redutores em Ágar TSC. 
 
f. Confirmação de colônias típicas de clostrídios sulfito-redutores: 
Selecionar várias colônias típicas e transferir para tubos de Caldo Infusão 
Cérebro Coração (BHI), previamente desaerado. Incubar os tubos inoculados a 
35ºC/24 horas, preparar um esfregaço da cultura para coloração de Gram e 
utilizar o caldo remanescente para teste de catalase (adição de peróxido de 
hidrogênio 3% observando a formação de bolhas). Os clostrídios sulfito-redutores 
são bastonetes Gram positivos catalase negativos. 
 
g. Cálculo dos resultados: UFC/g ou mL em função do número de colônias 
típicas, diluição inoculada e percentagem de colônias confirmadas. Exemplo: 
diluição 10-2, com 25 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 8 
confirmadas (80%). UFC/g ou mL = 25x102x0,8 = 2 x 103 UFC/g ou mL. Obs: 
Multiplicar o resultado por 10 caso seja realizado plaqueamento em superfície. 
 
3. Informações relativas a amostra 
 
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação:____________________ 
- Fabricante, data de fabricação, código do lote:________________________ 
- Solicitante da análise:____________________________________________ 
- Data e local de coleta da amostra:__________________________________ 
- Razão da análise:_______________________________________________ 
 
5. Resultados 
 
5.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais:___________________________________________________ 
b. Coliformes termotolerantes:___________________________________________ 
c. Confirmação de E. coli:_______________________________________________ 
 
 
5.2 Detecção de Salmonela:_____________________________________________ 
 
 
5.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo___________________________ 
 
5.4 Contagem de Clostrídios Sulfito Redutores______________________________ 
 
 
6. Conclusão 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
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32
Homogeneização
25g da Amostra +
225mL de H O p2
10-1 1mL -3-2
0,3mL
0,1mL
 Ágar
Baird-Paker (BP)
10 10
35º/48h
1 Alçada Caldo BHITSA
Gram 
Catalase 
Manutenção
Teste de 
DNAase
Termoestável
Teste de
Coagulase Controle (-)BHI 0,3mL
Plasma 0,5mL
Fervura
15 mim.
ÁgarAzul
de Toluidina
37ºC/4h ou
50ºC/2h
Halo Róseo
 Teste (+)
Coagulação
 Teste (+)
37ºC/4h
Cultura 0,2mL
Plasma 0,5mL
1mL
0,1mL
0,3mL0,3mL 0,1mL
35ºC/24h 35ºC/24h
 
Figura 7. Esquema geral de análise para enumeração de Estafilococos coagulase 
positivo em alimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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33
Aula Prática nº 09 
 
 
 
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE PRODUTOS LÁCTEOS 
 
 
1. Padrão microbiológico para leite e derivados. 
 
Obs: Consultar o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos 
(Anexo 6). 
 
2. Material requerido para análise 
 
� 1 Frasco/recipiente estéril; 
� Diluente: 225 mL de solução salina peptonada; 
� 3 Pipetas com capacidade de 1 mL; 
� Tubos de diluição: 2 tubos com 9,0 mL de solução salina peptonada/tubo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
� 1 Alça de níquel-cromo; 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo Verde Brilhante Bile (VB); 
� 9 Tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC); 
� 1 Alça de Drigalsky; 
� Placas com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB); 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Rappaport Vassilidis (RV); 
� 1 Pipeta com capacidade de 2 mL; 
� 1 Tubo com 10 mL de caldo Tetrationato (TT); 
� 2 Placas com Entérico de Hectoen (HE); 
� 2 Placas com Ágar Bismuto Sulfito (BS); 
� 2 Placas com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD); 
� 3 Placas com Àgar Sal Manitol ou Ágar Baird Parker (BP); 
 
3. Procedimento 
 
3.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes e E. coli 
 
- Técnica dos tubos múltiplos; 
 
3.2 Detecção de Salmonela 
 
3.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo 
 
- Contagem direta em placas 
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34
4. Informações relativas a amostra: 
 
4. Tipo de amostra e processo utilizado na fabricação________________________ 
5. Fabricante, data de fabricação, código do lote:____________________________ 
6. Solicitante da análise:_______________________________________________ 
7. Data e local de coleta da amostra:_____________________________________ 
8. Razão da análise:__________________________________________________ 
 
5. Resultados: 
 
5.1 Determinação de Coliformes totais, Coliformes termotolerantes, E. coli: 
 
a. Coliformes totais:___________________________________________________ 
b. Coliformes termotolerantes:___________________________________________ 
c. Confirmação de E. coli:_______________________________________________ 
 
5.2 Detecção de Salmonela:_____________________________________________ 
 
5.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo___________________________ 
 
6. Conclusão: 
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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35
 
Anexo 1 
 
Planos de amostragem 
 
- Planos variáveis: fornecedor e matéria-prima conhecidos e dentro de padrões; 
- Planos por atributo: planos de 2 classes e de 3 classes. 
 
 
Condições presumíveis de manipulação e consumo após a 
amostragem 
Tipo de risco à saúde Condições reduzem o 
risco 
Condições mantém o 
risco inalterado 
Condições aumentam 
o risco 
Sem risco direto à 
saúde 
 
categoria 1 
3 classes 
n = 5 c = 3 
 
categoria 2 
3 classes 
n = 5 c = 2 
 
categoria 3 
3 classes 
n = 5 c = 1 
 
Risco baixo e indireto 
 
categoria 4 
3 classes 
n = 5 c = 3 
 
categoria 5 
3 classes 
n = 5 c = 2 
 
categoria 6 
3 classes 
n = 5 c = 1 
 
Risco moderado, 
direto e difusão 
restrita 
 
categoria 7 
3 classes 
n = 5 c = 2 
 
categoria 8 
3 classes 
n = 5 c = 1 
 
categoria 9 
3 classes 
n = 10 c = 1 
 
Risco moderado, 
direto e difusão 
extensa 
 
categoria 10 
2 classes 
n = 5 c = 0 
 
categoria 11 
2 classes 
n = 10 c = 0 
 
categoria 12 
2 classes 
n = 20 c = 0 
 
Risco direto, grave 
 
categoria 13 
2 classes 
n = 15 c = 0 
 
categoria 14 
2 classes 
n = 20 c = 0 
 
categoria 15 
2 classes 
n = 60 c = 0 
 
n = número de unidades submetidas à análise; c = número de unidade fora do padrão tolerado 
Fonte: ICMSF (1978) 
 
� Plano de duas classes: 
n = número de unidades submetidas à análise; 
c = número máximo aceitável de unidades que podem exceder o valor de m; 
m = número máximo de microrganismos/g tolerado. 
 
Exemplo: 
n = 5; c = 0; m = 0 (ausência). 
 
� Plano de três classes: 
n = número de unidades submetidas à análise; 
c = número máximo aceitável de unidades que podem exceder o valor de m; 
m = limite inferior do número de microrganismos/g tolerado; 
M = limite superior do número de microrganismos/g tolerado. 
 
Obs: uma unidade é considerada aceitável se o resultado for inferior a m e inaceitável se for superior 
a M. resultados entre m e M conferem ao produto uma qualidade chamada marginal 
 
Exemplo: 
n = 5; c = 2; m = 10; M = 102 
 
Interpretação: 
- Se X > M = Inaceitável; 
- 2 unidades entre 5 podem conter entre 10 e 102 UFC/g; 
- Se 3 unidades entre 5 tem contagem entre 10 e 102 UFC/g, o lote é rejeitado. 
 
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36
���� Definição dos microrganismos que devem ser estudados: 
 
a) Microrganismos sem risco direto à saúde: importância limitada quanto a capacidade de causar 
alterações nos alimentos, sem serem patogênicos. Ex: Fungos e bactérias aeróbias mesófilas; 
 
b) Microrganismos que oferecem um risco indireto à saúde do consumidor: indicadores de 
condições higiênico-sanitárias do produto, sem serem patogênicos, mas que podem indicar a 
possível presença de patógenos. A maioria é causadora de alterações nas características originais 
dos alimentos; 
 
c) Microrganismos que oferecem risco direto à saúde do consumidor: patógenos de interesse 
em alimentos. Dependendo da gravidade da patologia que provocam e do tamanho dos surtos que 
são capazes de causar. São classificados em três grupos: 
 
- Risco direto, moderado e difusão limitada: mic. potencialmente patogênicos que 
causam doenças relativamente brandas. Ex: S. aureus, C. perfringens tipo A, Coxiella 
burnetti, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni e o nematóide Trichinella spiralis; 
 
- Risco direto, moderado e difusão extensa: mic. potencialmente patogênicos que 
causam doenças mais graves que as do grupo anterior, e em doses infectantes mais 
baixas. Ex: Salmonella Typhimurium, E. coli patogênica, Shigella, Vibrio parahaemolyticus 
e estreptococos beta-hemolíticos;holeras 
 
- Risco direto e grave: mic. altamente patogênicos, que não devem estar presentes em 
nenhum alimento. Ex: C. botulinum, Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A e B, 
Salmonella Cholerasuis, Shigella dysenteriae tipo I, Vibrio cholerae, Brucella melitensis, 
Clostridium perfringens tipo C e vírus da hepatite infecciosa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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37
Anexo 2 
Soluções diluentes 
 
Solução salina-peptonada: 
Cloreto de sódio 8,5g 
Peptona 1,0g 
Água destilada 1000mL 
Dissolver os componentesem água destilada; 
Distribuir em frascos em volumes apropriados; 
Esterilizar em autoclave a 121ºC/15min. 
 
Solução citrato de sódio: 
Citrato de sódio 1,25g 
Água destilada 100mL 
Dissolver o citrato de sódio em água destilada; 
Distribuir em frascos em volumes apropriados; 
Esterilizar em autoclave a 121ºC/15min. 
 
Solução salina a 0,85%: 
Cloreto de sódio 0,85g 
Água destilada 100mL 
Dissolver o cloreto de sódio em água destilada; 
Distribuir em frascos em volumes apropriados; 
Esterilizar em autoclave a 121ºC/15min. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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38
Anexo 3 
Soluções desinfetantes 
 
Solução hipoclorito de sódio: 
Hipoclorito de sódio 100mg 
Água 1000mL 
Dissolver o hipoclorito em água. Concentração 100ppm. 
 
Solução de álcool iodado: 
Iodo 2,0g 
Álcool etílico a 70% 100mL 
Dissolver o iodo em álcool etílico 70%. 
 
Preparo do álcool 70%: 
- Álcool comercial 96ºGL = 92,8 INPM (Instituto Nacional de Pesos e Medidas – peso/volume) 
 
 1000mL de álcool ---- 92,8% 
 X -------------------------- 70% 
 X = 745,31mL de álcool 
 
1000mL – 745,31mL = 245, 69mL 
 
- Para simplificar esta preparação sem perda significativa do poder bactericida do álcool 70%, 
adicionar 250mL de água a 750mL de álcool 92,8 INPM. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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39
 Anexo 4 
 
Regras para cálculo dos resultados na contagem de microrganismos por plaqueamento 
 
 
Obs: As regras abaixo estão exemplificadas considerando o cálculo dos resultados na contagem de 
microrganismos por plaqueamento em profundidade. 
 
Regra 1 – Se a contagem for feita numa placa inoculada com a amostra sem diluição, sem 
duplicata, o número de unidades formadoras de colônias (UFC) é igual ao número de colônias 
(Exemplos 1 e 2 – Quadro 1). Se foi feita em duplicata, o número de UFC é igual à média aritimédica 
da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata (Exemplos 3 e 4 do Quadro 1). 
 
Quadro 1. 
Exemplo N° de colônias na(s) placa(s) da diluição C ontagem UFC/ml 
Sem diluição 
(100) 
10 -1 10-2 
Sem duplicata 
1 199* 8 0 199 = 2,0 x 102 
2 245* 22 2 245 = 2,5 x 102 
Com duplicata 
3 62* - 57* 6 - 5 (62+57)/2 = 59,2 = 6,0 x 101 
4 123* - 136* 12 - 10 0 - 0 (123+136)/2 = 129,5 = 1,3 x 102 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. 
 
Regra 2 – Se a contagem foi feita numa placa inoculada com a diluição 10 -1 ou maior, sem 
duplicata, calcular o número de UFC/g ou ml multiplicando o número de colônias pelo inverso da 
diluição inoculada. O inverso da diluição 10 -1 é 10 1 , o inverso da 10 -2 é 10 2 e assim por diante 
(Exemplos 5 e 6 do Quadro 2). Se foi feita duplicata, considerar como número de colônias a média 
aritimédica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata e multiplicar pelo inverso da 
diluição (Exemplos 7 e 8 do Quadro 2). 
 
Quadro 2. 
Exemplo N° de colônias na(s) placa(s) da diluição C ontagem UFC/ml 
10 -1 10-2 10-3 
Sem duplicata 
5 199* 8 2 199 x 101 = 2,0 x 103 
6 Inc 245* 22 245 x 102 = 2,5 x 104 
Com duplicata 
7 Inc – Inc 62* - 57* 6 - 5 [(62+57)/2] x 102 = 59,2 x 102 = 6,0 
x 103 
8 Inc – Inc Inc - Inc 239*-242* [(239+242)/2] x 103 = 240,5 x 103 = 
2,4 x 105 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável 
 
Regra 3 – Se o volume inoculado da primeira diluição (ou da amostra sem diluição) foi 
diferente de 1 ml e a contagem foi feita na placa inoculada com esse volume, valem as regras 
anteriores mas o número de colônias deve ser dividido pelo volume inoculado, para calcular o 
resultado (exemplos 9, 10, 11 e 12 do Quadro 3). 
 
Quadro 3. 
Exemplo N° de colônias na(s) placa(s) da diluição 
(volume inoculado) 
Contagem UFC/ml 
10 -1 (2ml) 10-2 (1ml) 10-3 (1ml) 
Sem duplicata 
9 199* 18 2 (199/2) x 101 = 1,0 x 103 
10 123* 2 0 (123/2) x 101 = 6,2 x 102 
Com duplicata 
11 62* - 57* 6 - 5 0 - 0 [(62+57)/2]/2 x 101 = 29,75 x 101 = 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
40
3,0 x 102 
12 27* - 35* 3 - 3 0 - 0 [(27+35)/2]/2 x 101 = 15,5 x 101 = 
1,6 x 102 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. 
 
Regra 4 – Se a diluição não for decimal (1:20, 1:50, 1:200, etc.), valem as regras 2 e 3 mas é 
necessário inserir nos cálculos a diluição inicial aplicada. Considerando uma unidade analítica de m 
gramas ou mililitros, diluída em v mililitros de diluente, a diluição inicial é igual a m/(m+v), ou seja, 
unidade analítica dividida pelo volume total (diluente + unidade analítica). As diluições decimais 
subsequentes são a inicial multiplicada por 10 -1 (1° decimal), a inicial multiplicada por 10 -2 (2° 
decimal) e assim por diante. Por exemplo, para uma unidade analítica de 50g preparada com 950ml 
de diluente, a diluição inicial é de 50/(50+950) = 50/1000 = 1:20. A 1° decimal é 10 -1 /20, a 2° decimal 
é de 10 -2 /20 e assim por diante. O cálculo dos resultados ainda é feito multiplicando-se o número de 
colônias pelo inverso da diluição mas, nesse caso, o inverso da diluição é a fração invertida: inverso 
da diluição 1/20 = 20/1, inverso da 10 -1 /20 = 20 x 10 1, inverso da 10 -2 /20 = 20 x 10 2 e assim por 
diante (exemplos 13, 14, 15, 16, 17 e 18 do Quadro 4). 
 
Quadro 4. 
Exemplo Unidade 
analítica 
Volume 
diluente 
Diluição 
inicial 
N° de colônias na(s) 
placa(s) da diluição 
UFC/g ou ml amostra 
Inicial 1° 
decimal 
2° 
decimal 
Sem duplicata 
13 10g 490ml 10/500=1/50 199* 18 2 199x50=1,0x104 
14 25g 350ml 25/375=1/15 280 30* 2 30x15x101 = 
4,5 x103 
15 25g 975ml 25/1000=1/40 Inc Inc 133* 133x40x102= 5,3 x 105 
Com duplicata 
16 25g 475ml 25/500=1/20 273*-
229* 
21 – 20 2 – 1 [(237+229)/2]x20=4,7x103 
17 10g 490ml 10/500=1/50 Inc - 
Inc 
62* - 
57* 
6 – 5 [(62+57)/2]x50x101=3,0x104 
18 10g 290ml 10/300=1/30 Inc - 
Inc 
Inc - 
Inc 
239*-
242* 
[(239+242)/2]/2x30x102= 
7,2x105 
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável 
 
Os exemplos acima são os de cálculos em condições ideais, com número de colônias na faixa de 25 
a 250, em placas da mesma diluição, sem espalhamento. Mas são bastante frequentes as situações 
em que as placas não se apresentam em condições tão ideais, sendo aplicadas algumas regras 
básicas para o cálculo dos resultados. Essas regras são apresentadas a seguir, com exemplos no 
Quadro 4. 
 
Regra 5 – Uma placa da duplicata com contagem acima ou abaixo da faixa de 25-250 colônias. 
Se a outra placa apresenta contagem na faixa de 25 a 250, considerar o número de colônias de 
ambas as placas no cálculo do resultado (Exemplo 30 do Quadro 5). 
 
Regra 6 – Duas diluições consecutivas com 25-250 colônias. Calcular o número de UFC de cada 
diluição e comparar os resultados. 
 6.a. Se um dos resultados for maior do que o dobro do outro, considerar apenas o maior 
(Exemplos 19 e 31 do Quadro 5) 
 6.b. Se um dos resultados não ultrapassar o dobro do outro, então considerar ambos os 
resultados, apresentando a média como resultado final (Exemplos 20 e 32 do Quadro 5). 
 
Regra 7 – Nenhuma placa atingiu 25 colônias. Contar as colônias nas placas com número mais 
próximo de 25, calcular o número de UFC (Exemplos 21 e 33 do Quadro 5) e apresentar o resultado 
como contagem estimada (est). 
 
Regra 8 – Nenhuma placa com crescimento. Considerar o número de colônias na 1ª diluição 
inoculada como sendo 1 e calcular o resultado de acordo com as regras 1, 2, 3 ou 4 (Exemplos 22 e 
34 do Quadro 5). relatar o resultado final como menor do que o valor obtido no cálculo,valor 
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41
estimado. Se nenhuma placa houvesse apresentado crescimento nos exemplos 1 a 4 da Regra 1, o 
resultado final seria <1/ml (est). Nos exemplos 5 a 8 da Regra 2 seria<10/g ou ml (est). Nos exemplos 
9 a 12 da Regra 3 seria <5/g ou ml (est). Nos exemplos 13 a 18da Regra 4 seria: <50, <15, 
<40,<20,<50 e <30 UFC/g ou ml, respectivamente. 
 
Regra 9 – Todas as placas com mais de 250 colônias. Nestes casos há quatro alternativas para 
estimar o número de UFC/g ou ml. Em todos os casos, o resultado deve ser apresentado como 
contagem estimada (est). 
9.a. Se for possível contar todas as colônias da placa, contar e calcular o número de UFC a 
partir da contagem obtida (Exemplos 23 e 35 do Quadro 5). 
 
9.b. Se não for possível contar todas as colônias da placa, mas o número de colônias/cm2 
estiver abaixo de 10, contar as colônias em 12 quadrados de 1cm2, 6 quadrados 
consecutivos na horizontal e 6 quadrados consecutivos na vertical, utilizando os quadrados 
demarcados no contador de colônias como guia. Clacular o númro médio de colônias/cm2 e, 
a partir da média, determinar o número total de colônias na placa, multiplicando a média pela 
área total da placa. Lembrar que a área total da placa é igual a πd2/4, onde d é o diâmetro 
interno. Por exemplo, placas de 100mm tem diâmetro interno por volta de 9 cm e área total 
de aproximadamente 65cm2. Utilizar este número total de colônias para calcular o número de 
UFC (Exemplo 24 do Quadro 5). 
 
9.c. Se o número de colônias/ cm2 for maior do que 10, contar as colônias em quatro 
quadrados representativos da distribuição das colônias nas placas e calcular o número de 
UFC da mesma forma utilizada no caso de 12 quadrados (Exemplo 25 do Quadro 5). 
 
9.d. Se o número de colônias/cm2for mairo doq eu 100, apresentar o resultado como maior 
do que a área total da placa x inverso da diluição (Exemplo 26 do Quadro 5). 
 
 
Quadro 5 Exemplos do cálculo dos resultados do plaqueamento em profundidade em condições não 
ideais. 
Exemplo Regras 
usadas 
N° de colônias na(s) placa(s) da 
diluição 
Contagem UFC/g ou ml *** 
10 -1 10-2 10-3 
Sem duplicata 
19 6.a Inc 140* 32 140x102 =1,4x104 
20 6.b Inc 243* 34* [(243x102)+(34x103)]2=2,9x104 
21 7 18* 2 0 18x101=1,8x102 est 
22 8 0 0 0 <1x101=<10 est 
23 9.a Inc Inc 370* 370x103=3,7x105 est 
24 9.b Inc Inc 8/cm2* 8x65x103=520x103=5,2x105 est 
25 9.c Inc Inc 21/cm2* 21x65x103=1.365x103=1,4x106 est 
26 9.d Inc Inc >100/cm2* >100x35x103=>6,5x106 est 
27 10 Inc 325* 20 325x102=3,3x104 est 
28 11 Inc 243*Esp Esp 243x102=2,4x104 
29 12 27 215 20 Acidente de laboratório 
Com duplicata 
30 5 Inc - Inc Inc – Inc 239* - 328* [(239+328)/2]x103=283,5x103=2,8x105 
31 6.a 138* - 
162* 
42 – 30 1 – 2 [(138+162)/2]x101=150x101=1,5x103 
32 6.b 228* - 
240* 
28* - 26* 2 – 2 {[(228+240)/2]x101+[(28+26)/2]x102}/2= 
2.520=2,5x103 
33 7 18* - 16* 2 – 0 0 – 0 [(18+16)/2]x101=17x101=1,7x102 
34 8 0 – 0 0 – 0 0 – 0 <10 est 
35 9.a Inc - Inc Inc – Inc 320* - 295* [(320+295)/2]x103=307,5x103=3,1x105 
36 10 287* - 
263* 
23- 19 2 – 2 [(287+263)/2]x101=275x101=2,8x103 
37 11 Inc - Inc 224* - 180* 28* - Esp [(224+180)/2]x102+28x103= 
24.100=2,4x104 
Apostila de Aula Prática de Microbiologia de Alimentos. Coelho, A. F. S. 
 
42
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc=Incontável, Esp=Espalhamento, 
Est=Estimada. 
 
Regra 10 – Número de colônias acima de 250 numa diluição e abaixo de 25 na seguinte. Se 
numa diluição o número de colônis ficou acima de 250 e a seguinte ficou abaixo, selecionar as placas 
com contagem mais próxima de 250 e calcular o número de UFC a partir da contagem obtida 
(Exemplos 27 e 36 do Quadro 5). 
 
Regra 11 – Placas com espalhamento. Há dois tipos distintos de espalhamento. O primeiro é 
resultante da desintegração de agrupamento de células, durante a mistura do inóculo com o meio de 
cultura. O segundo é resultante da inadequada mistura do inóculo com o meio, levando à formação 
de filmes de umidade na superfície do meio ou entre o o meio e o fundo da placa. A distinção entre 
os tipos é facilmente visualizada, porque no espalhamento do primeiro tipo sempre se pode observar 
crescimento e colônias individuais. As placas com espalhamento poderão ser contadas nas seguintes 
condições: se nenhuma das zonas de espalhamento individual tiver tamanho superior a 25% na área 
da placa e, ainda, se a área total coberta por zonas de espalhamento não ultrapassar 50% da placa. 
Em caso contrário, reportar o resultado com ''acidente de laboratório'' e repetir o ensaio. Se o 
laboratório observar ocorrência de espalhamento do segundo tipo, com tamanho superior a 25%, em 
mais de 5% das placas preparadas num período de trabalho, devem ser tomadas medidas 
preventivas para minimizar esse problema. Para contar placas com zonas de espalhamento do 
primeiro tipo, cada zona deve ser contada como uma única UFC, não contando as colônias 
individualmente dentro dessas zonas. Para contar placas com zonas de espalhamento do segundo 
tipo, selecionar uma região da placa, livre de espalhamento e contar as colônias em diversos 
quadrados de 1cm2 . Calcular a média de colônias/ cm2 , multiplicar pela área total da placa (65 cm2 
no caso de placas com diâmetro estreno de 100mm) e utilizar este valor estimado para calcular o 
número de UFC. Apresentar o resultado como contagem estimada (est) (Exemplos 28 e 37 do 
Quadro 5). 
 
Regra 12 – Placas em que o crescimento é proporcionalmente maior nas maiores diluições. 
Esta situação pode ser decorrente da contaminação acidental da amostra durante o plaqueamento, 
de erro na identificação da diluição nas placas ou da presença de substâncias inibidoras na amostra. 
Considerar o resultado como ''acidente de laboratório'' e repetir o ensaio. Se a suspeita de presença 
de substâncias inibidoras da amostra for alta, utilizar na repatição um procedimento adequado para 
suprimir ou reduzir a influência desses componentes do resultado (Exemplo 29 do Quadro 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Anexo 5 
 
Tabela 1. Características microbiológicas para água mineral natural e água natural. 
Microrganismos Amostra indicativa (limites) 
Escherichia coli ou coliformes termotolerantes em 100mL Ausência 
Coliformes totais em 100mL <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 
Enterococos em 100mL <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 
Pseudomonas aeruginosa em 100mL <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 
Clostrídios sulfito redutores ou Clostridium perfringens em 
100mL 
<1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 
Fonte: Brasil (2005). 
 
Tabela 2. Número Mais Provável (NMP – água). 
Número de positivos Limite NMP 
Tubos Inferior Superior 
Número de tubos 
positivos 
NMP/100mL 
 
 
 
0 <1,1 0 3 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23 8,1 59,5 
10 >23,0 13,5 Infinito 
Fonte: APHA (1985). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Anexo 6 
 
Legislação 
 
Anexo 7 
 
 
Tabela 1. Tabela do número mais provável. 
Número de positivos NMP/g Limite NMP 
Tubos Inferior Superior 
0,1 0,01 0,001 
0 0 0 <3 <0,5 <9 
0 0 1 3 <0,5 9 
0 1 0 3 <0,5 13 
1 0 0 4 <0,5 20 
1 0 1 7 1 21 
1 1 0 7 1 23 
1 1 1 11 3 36 
1 2 0 11 3 36 
2 0 0 9 1 36 
2 0 1 14 3 37 
2 1 0 15 3 44 
2 1 1