Lista de exercícios 3 - Mutação e reparo; PCR; Sequenciamento; ômicas.pdf

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O que são agentes mutagênico? Dê exemplos.
Resposta= São agentes químicos ou físicos que reagem com as moléculas de DNA causando mutações.
Agentes químicos mudam a estrutura de um ou mais nucleotídeos dentro da dupla hélice.
Ex: O ácido nitroso causa desaminação e a aflotoxina causa a depurinação.
Agentes físicos fazem com que a mudança na estrutura de um nucleotídeo possa afetar suas propriedades de pareamento de bases, resultando em uma mutação quando o DNA se replica.
Ex: Calor, radiação ultravioleta e radiações ionizantes (ionizam os compostos químicos celulares): alfa, beta, gama, raios X, feixes de nêutron.
Qual a relação existente entre a mutação gênica e a seleção natural na evolução dos organismos?
Resposta= As mutações gênicas também possuem um lado positivo que proporcionou a evolução das espécies através da seleção natural. Individuos que sofrem uma mutações ótimas para determinados ambientes supera os demais fazendo com que esses se reproduzam mais e melhor e aumente sua população, em quanto os demais que não sofreram a mutação tem maior dificuldade para sobreviver no ambiente e vão aos poucos se extinguindo.
Por que razão as radiografias de feto podem ser realizadas nos últimos meses de gravidez sem tanto perigo como nos primeiros meses?
Resposta= Porque no início da gestação as células da criança estão se dividindo com grande intensidade e o processo de diferenciação celular está em pleno andamento. Assim as radiações afetam com grande intensidade a divisão celular e os processos envolvidos na diferenciação. 
E no final da gestação os órgãos já estão formados, e o risco, embora presente, é bem menor.
4. Assinale a alternativa incorreta, sobre mutações:
a) Mutações são alterações de genes ou cromossomos, podendo ocasionar variações hereditárias.
b) Todas as mutações se transmite à descendência.
c) As mutações ocorrem espontaneamente.
d) Cada gene tem a sua taxa própria de mutação.
e) Nem todos os tipos de radiações induzem mutações.
5. É possível ocorrer uma mutação em um gene sem que se altere a enzima correspondente? Justifique.
Resposta= Sim. Se for uma mutação silenciosa, ou seja, se a mutação de ponto alterar o códon mas não altera o aminoácido devido a redundância do código genético.
6. Explique porque existem na natureza várias formas diferentes para um mesmo gene.
Resposta= Devido ao splicing alternativo que aumenta a variedade de aminoácidos produzidos por um único gene, ou seja, é o que torna o gene degenerado.
7. Explique todas as etapas da PCR
Resposta= As etapas ocorrem em num termociclador, que controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos) e segue 3 passos: 
A desnaturação ocorre em uma temperatura de 94° C causa a separação das fitas complementares de DNA.
O anelamento ocorre em uma temperatura de 57°C dependendo do primer. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência complementar. 
A extensão ocorre à uma temperatura de 72°C, onde a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. 
No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de ADN idênticas à original. 
8. Diferencie os seguintes tipos de mutações de ponto:
a) Mutação missense ou “com sentido”;
Resposta= Produz diferentes proteínas pela alteração de um aminoácido.
b) Mutação nonsense ou “sem sentido”;
Resposta= Modifica um códon que codifica aminoácido para um stop códon, gerando a finalização do alongamento da proteína deixando-a mais curta.
c) Mutação silenciosa.
Resposta= Ocorre a mutação de um nucleotídeo, porém não altera o aminoácido, portanto continua codificando a mesma.
9. Descreva o mecanismo de reparo por fotorreativação (reparo direto por reversão).
Resposta= A enzima de reparo fotoliase reconhece a alteração na conformação do DNA e se liga a essa alteração formando um complexo DNA-enzima de reparo, quando fotoativada por radiação de comprimento de onda no visível ela retira a alteração.
10. Descreva um ciclo de PCR, citando todos os componentes utilizados para realização desta síntese de DNA in vitro.
Resposta= Primeira etapa é a adição de reagentes: DNA alvo, Taq Polimerase, Primer, Tampão, água, Mg2+e nucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Segunda etapa tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos) e segue 3 passos: 
A desnaturação em uma temperatura de 94° C. A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a cadeia dupla de ADN em dois filamentos. Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas;
No anelamento os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. 
Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência complementar. 
Temperatura de annealing ou hibridização é de 57°C mas normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade.
A extensão ocorre à uma temperatura de 72°C, onde a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs em solução. 
A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direcção 5’ para 3’.
No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de ADN idênticas à original. 
11. A presença do reparo de DNA nos organismos é importante para:
a) Gerar mutações na molécula de DNA para aumentar a variabilidade genética;
b) Facilitar a morte celular programada (apoptose);
c) Manter a integridade do material genético;
d) Gerar mutações nas gônadas para variar o material genético na fecundação.
12. É possível que uma mutação genética não altere o resultado da tradução?
I) sim, no caso de a mutação transformar um códon em outro relacionado ao mesmo aminoácido (código degenerado).
II) Sim pois o código genético é degenerado.
III) Nunca, pois a sequência de aminoácidos é determinada pelos códons.
IV Sempre que há alteração no DNA , os genes determinam a produção de novas sequências de anticódons.
Estão corretas apenas:
a)I e II
b)II e III
c) III e IV
d) IV
e) II3.
13. O ciclo térmico básico da PCR inicia-se a uma certa temperatura, prossegue para outra e finalmente vai para uma terceira, quando então recomeça, por pelo menos 25 vezes. Quais estas temperaturas (na ordem descrita acima) e o que ocorre nelas?
a) 56°C – pareamento dos primers; 96°C – extensão de fita pela Taq; 72°C – desnaturação da fita dupla.
b) 96°C - desnaturação da fita dupla; 56°C – pareamento dos primers; 72°C – extensão de fita pela Taq
c) 96°C - desnaturação da fita dupla; 72°C – pareamento dos primers; 56°C – extensão de fita pela Taq
d) 72°C – pareamento dos primers; 56°C – extensão de fita pela Taq; 96°C - desnaturação da fita dupla.
e) 96°C - desnaturação da fita dupla; 72°C – extensão de fita pela Taq;56°C – pareamento dos primers.
14. Se a menor temperatura de um ciclo de PCR for reduzida de 56oC para 45oC, o que provavelmente ocorrerá? Por que?
a) A reação não se processará devido ao esgotamento dos primers através de hibridizações múltiplas não específicas
b) A banda observada no gel terá menor peso molecular porque a Taq polimerase trabalhará mais lentamente.
c) Outras bandas poderão aparecer no gel como resultado de hibridizações dos primers com novos sítios, com baixa estringência.
d) A banda formada terá maior peso molecular devido à reação anômala da Taq polimerase, que incorpora resíduos de adenina a baixa temperatura.
e) Não serão formadas bandas porque com a queda da temperatura abaixo de 50 °C o DNA se renatura por inteiro e impede a nova hibridização de primers.
15. Descreva resumidamente os seguintes métodos de sequenciamento:
a) Método de Sanger
Resposta= É a realização de uma PCR com nucleotídeo marcado e é dividido em três etapas sendo:
1º) Reação de sequenciamento onde ocorre a amplificação linear com a adição de um DNA fita simples+ 1 primer+ DNA Polimerase + dNTPs+ ddNTPs (dideoxinucelotídeo).
2º) Eletroforese em placa ou em capilar, que separa os fragmentos de DNA por diferença de tamanho e peso. 
3º) Leitura da sequência que pode ser manual ou automática.
b) Pirosequenciamento
Resposta= 
1º) Realiza um shotgun do genoma inteiro, ou seja, quebra o genoma em pedaços aleatórios de aproximadamente 2000 pb.
2º) Ocorre a ligação do adaptador de separação de fita simples, que permite que o DNA se ligue em grânulos minúsculos que são chamados de bead.. Apenas um DNA é ligado a cada bead. O bead entra em contado com uma gota de óleo que contém todos os reagentes para amplificação do DNA e cada bead consegue produzir 10 milhões de cópias da mesma reação.
3º) Adição das bases, que serão adicionadas uma de cada vez, quando uma base é adicionada e é a base correta ela se encaixa e libera luz.
c) Chip sequenciador (Ion Torrent)
Resposta= Todos os reagentes necessários para reação já se encontram no chip e esse método se baseia na leitura das alterações de pH. Quando se adiciona a base e ocorre a incorporação, ocorre-se também a liberação de H+. Portanto a medida que vai adicionando as bases vai medindo o pH.
16. Explique os seguintes termos:
a) Genômica
Resposta= É a ciência que estuda a sequência de bases nitrogenadas ou nucleotídeos
b) Proteômica
Resposta= É a ciência que estuda as proteínas e esse estudo pode ser feito por nível celular, de tecido, de órgãos e de organismo
c) Metabolômica
Resposta= É a ciência que estuda o funcionamento do metabolismo celular
d) Interatômica
Resposta= É a ciência que estuda a interação das proteínas para desempenho de determinadas funções, ou seja, estuda todas as vias de sinalização utilizadas pelas proteínas.
17. Quais são as perspectivas para o futuro da medicina genômica?
Resposta= 
Definir a lista completa de genes e proteínas para desenvolver novos marcadores e novos alvos terapêuticos.
Definir os fatores hereditários nas doenças comuns para que haja uma medicina preventiva personalizada com base no risco genético individual.
Na medicina personalizada aprimorar a farmacogenômica para melhorar a eficácia e diminuir a toxidade dos medicamentos.
Definir os sinais regulatórios que afetam a expressão dos genes para que as terapias para os defeitos do desenvolvimento embrionário possa melhor atuar.
Definir os fatore que mudam a expressão gênica de normal para anormal com a oncogenômica que realiza tratamento do câncer baseado na tipagem genômica dos tumores.
Definir a estrutura de todas as proteínas humanas para que medicamentos sejam desenhados quimicamente com base na estrutura dos alvos.
Definir vetores seguros para que a transferência dos genes exógenos para se criar terapias seguras para virtualmente qualquer doença.
Definir as implicações éticas, legais e sociais da pesquisa genômica para impedir a discriminação genética e proteger a privacidade da informação genômica.
Estabelecer a medicina genômica como esteio da moderna medicina e realizar a “Alfabetização Genética” dos médico e dos pacientes.
18. Quais são os 2 tipos de agentes mutagênicos encontrados no ambiente? Cite exemplos
Resposta= Físicos e Químicos. 
Físicas:
Radiações ionizantes como rádio, plutônio, raio x e etc são responsáveis por cerca de 10% de todos os danos no DNA causados por agentes ambientais.
Radiações não ionizantes como a radiação ultravioleta pode causar a dimerização de bases (EX: dímeros de timinas).
Calor resulta na perda de bases clivando as ligações entre as bases purínicas e seus açucares, resultando em sítios apurínicos nos polinucleotídeos.
Químicas:
Ácido nitroso que causa desaminação das base e aflotoxina que causa depurinação das bases.
19. Diferencie mutação por transversão de mutação por transição (mutações de substituição de bases).
Resposta= As duas são mutações de ponto que é a substituição de um nucleotídeo por outro:
A Transição ocorre quando uma purina é troca por outra purina (A G) ou uma pirimidina for trocada por outra pirimidina (T C).
A Transversão ocorre quando uma uma purina for trocada por uma pirimidina (A ou G T ou C).
20. Cite pelo menos 3 aplicações práticas da técnica de PCR.
Resposta=
1.Detecção de deleções / inserções determinadas pela geração de produtos amplificados que apresentam alterações em seu tamanho.
2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.
3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas).
4. Na tipagem para transplantes de órgãos e susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas (detecção de polimorfismo).
5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem genética, como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas doenças.
6. Na medicina forense (DNA fingerprint).
7. No diagnóstico de doenças infecciosas e agentes patogênicos diversos em amostras de alimentos.