7 preparo de meios

Prévia do material em texto

Universidade Tecnológica Federal do Paraná 
 Campus Campo Mourão 
 Coordenação de Alimentos 
 Disciplina de Microbiologia 
 Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini 
 
 
AULA PRÁTICA n° 
 
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 
 
Introdução 
 Os meios de cultura destinam-se ao 
cultivo artificial dos microrganismos e fornecem 
os princípios indispensáveis ao seu crescimento. 
As exigências nutritivas estão relacionadas a 
uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia 
e de sais minerais. Alguns microrganismos 
também necessitam de fatores de crescimento, 
substâncias que eles não podem sintetizar, tais 
como vitaminas, aminoácidos, entre outras. Além 
disso, alguns meios podem ser formados por 
preparados de sangue, de carne, de leite e de 
vários outros produtos. 
 O ágar, agente solidificante largamente 
usado, formado por extrato de algas marinhas, 
funde-se em torno do ponto de ebulição da água, 
formando uma solução transparente que 
permanece no estado líquido até em torno de 
40°C. Uma vez eu a maioria dos microrganismos 
não é morta a 45°C, eles podem ser adicionados 
a um meio com Agar ainda liquefeito em tubos de 
ensaio ou placas de Petri. Depois que o meio 
com Agar se resfria e se solidifica, ele 
permanecerá solidificado a temperaturas de 
incubação e pode ser inoculado com 
microrganismos. O Agar não serve como 
nutriente para a maioria dos microrganismos e 
não é metabolizado durante o crescimento. 
 Existem algumas observações 
importantes no preparo de meios de cultura: 
• Não se pode manter o meio de cultura à 
temperatura ambiente em uma solução 
não-esterilizada por mais de uma hora, 
devido à possibilidade de evaporação da 
água e de crescimento microbiano. 
• Frascos de meios de cultura desidratados 
são altamente higroscópicos, portanto 
mantê-los em ambientes secos e o menor 
tempo possível abertos. 
• Seguir sempre as orientações do 
fabricante; 
• Utilizar sempre o frasco mais antigo do 
estoque; 
• Proteger os frascos da luz; 
• Desprezar meios que apresentem sinais 
de hidratação; 
• Observar data de validade; 
• Pesar precisamente os componentes do 
meio e em equipamento adequado; 
• Utilizar somente água destilada, ou 
deionizada, ou tratada por osmose 
reversa; 
• Afrouxar as tampas dos frascos e tubos 
para autoclavação; 
• Respeitar o máximo de material a ser 
esterilizado; 
• Verificar após esterilização (quando 
necessário) o valor de pH da preparação, 
cor, estabilidade e consistência. 
• Incubar amostra representativa do lote; 
• Incubação de controle branco a cada 
inoculação; 
• Armazenamento após preparo longe da 
luz, em local limpo e evitar perda de 
umidade; 
• Descartar se apresentar perda de 
umidade, mudança de cor ou crescimento 
microbiano; 
• Registrar SEMPRE a data de preparação. 
 
Validades: 
• Distribuídos em placas, armazenar de 4 a 
12°C por uma semana; 
• Suplementos/reagentes estéreis- 3 meses 
de validade sob refrigeração; 
• Meios completos e basais ainda não 
suplementados- 3 meses sob 
refrigeração; 1 mês a temperatura 
ambiente. 
 
 
Fusão do ágar 
• Banho-maria ou processo que seja 
efetivo; 
• Aquecimento o tempo mínimo necessário; 
• Armazenamento de 45-49°C por no 
máximo 4 horas; 
• Não fundir novamente se solidificado. 
 
Adição de suplementos 
• Meio resfriado a 45-49°C; 
• Se retirados do refrigerador aguardar 
atingir temperatura ambiente; 
• Não reaquecer. 
 
Distribuição em placas 
• Camadas de aproximadamente 2mm; 
• Superfície fria e plana para solidificação. 
 
MATERIAIS 
• Agar (tubos inclinados) e caldo nutriente; 
• Caldo EC; 
• Agar batata dextrose (PDA); 
• Ácido tartárico 10%; 
• Água destilada. 
 
 
PROCEDIMENTO 
Prática 
Preparo de meio líquido: caldo EC e caldo AN 
• Pesar o meio de cultura em papel 
alumínio e, a seguir, transferi-lo para um 
balão de fundo chato; 
• Verter sobre o papel de filtro uma 
pequena quantidade de água para 
arrastar todo o meio; 
• Adicionar água deionizada ou destilada ao 
meio de cultura; 
• Colocar a boneca nos balões e a coifa de 
papel com o nome do meio e a data; 
• Autoclavar a 121°C por 15 minutos; 
• Distribuir em tubos esterilizados a 
quantidade necessária para análise. 
OBS.: ACOMPANHAR O PROCESSO DE 
ESTERILIZAÇÃO!!!! 
 
Prática 
Preparo de meio sólido (Agar nutriente e PDA) 
• Pesar o meio de cultura em papel 
alumínio e, a seguir, transferi-lo para 
um balão de fundo chato; 
• Verter sobre o papel de filtro uma 
pequena quantidade de água para 
arrastar todo o meio; 
• Adicionar água deionizada ou água 
destilada ao meio de cultura; 
• Levar o balão com o meio para um 
banho-maria a 60°C durante 
20minutos. A cada 3 minutos, 
homogeneizar para a dissolução do 
meio de cultura; 
1. Para o PDA 
• Colocar a boneca nos balões e a coifa 
de papel com o nome do meio e a 
data; 
• Autoclavar a 121°C por 15 minutos; 
• Após a autoclavagem, levar o meio 
para um banho-maria a 50°C até o 
momento do uso. 
2. Para o Agar nutriente: 
• Distribuir em tubos e autoclavar a 
121°C por 15 minutos; 
• Após a autoclavagem, inclinar tubos. 
 
OBS.:Plaqueamento: Agar PDA 
• Destampar o balão na zona estéril de 
um bico de Bunsen, flambando a 
boca para impedir a entrada de 
eventuais microrganismos; 
• Resfriar até a 46-48°C. Adicionar 
cerca de 1,5 mL de solucão aquosa 
de ácido tartárico 10% para cada 100 
mL, de forma a baixar o pH até 3,5. 
• Verter entre 18mL e 20mL do meio de 
cultura em placas de Petri estéreis 
com técnica asséptica; 
• Deixar a placa em posição horizontal 
até que o meio de cultura se 
solidifique completamente; 
• Armazenar as placas em posição 
invertida na geladeira. 
 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
1. Por que os microbiologistas utilizam meios 
quimicamente definidos? 
2. Por que o Agar é o agente solidificante 
ideal para uso em microbiologia? 
3. Qual é a constituição do Agar? Qual a 
finalidade da sua incorporação nos meios 
de cultura? 
4. Quando um microbiologista utiliza um 
meio de enriquecimento para o cultivo de 
microrganismos? 
5. Qual a composição dos meios EC, PDA e 
Agar nutriente? Quais as suas 
finalidades? 
6. Por que tem que abaixar o pH do meio 
PDA após a esterilização para sua 
posterior utilização? 
 
 
REFERÊNCIAS 
 
OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia- 
roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd, 
2008.