Relatório Tecnologia de Bioprocessos Experimental (1)

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Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Tecnologia de Bioprocessos Experimental 
 
 
 
 
 
 
 
Isolamento e identificação de microrganismos presentes no leite 
fermentado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Alunos: João Belorio 
 Leonardo Pardo 
 Lukas Louback 
 
Introdução 
 Lactobacillus Casei são micro-organismos anaeróbicos presentes no intestino e na boca 
dos seres humanos, possuindo 
 -tolerantes 
 
 espécie adaptável 
 
 
 - 
 
desenvolvimento do sabor em determinadas variedades de queijo. 
Uma das mais conhecidas cepas pertence a esse grupo, Lactobacillus casei shirota 
 
 
 gastrointestinais. 
 
Materiais e métodos 
 
 Produção de catalase 
Materiais: 
 Placas de vidro; 
 Alça de platina; 
 Solução de NaCl; 
 Placa de Petri contendo meio de cultivo (MRS) e micro-organismo; 
 Peróxido de hidrogênio. 
Métodos: 
Em uma placa de vidro, colocar uma pequena quantidade de solução de NaCl, apenas 
para receber o micro-organismo, utilizando uma alça de platina esterilizada. Realizar, 
novamente, a esterilização da alça e retirar uma amostra da bactéria da placa de Petri onde foi 
realizado seu crescimento anteriormente. Espalhar, cuidadosamente, a bactéria sob a placa de 
vidro e esperar alguns segundos. Pingar uma gota de H2O2 sobre a placa de vidro contendo a 
cultura a ser analisada. Verificar surgimento de bolhas. 
 
Tabela 1: Reagentes para o teste da catalase. 
 
Composto Quantidade 
Água oxigenada a 30% 10 mL g 
Água destilada 90 mL 
Cultivar o microrganismo em MRS e depois adicionar os reagentes. 
Tabela 2: Composição do meio MRS. 
 
Composto Quantidade (1L) 
Dextrose 
Extrato de levedura 
Peptona bacteriológica 
Extrato de carne 
Acetato de sódio 
Fosfato de sódio 
Extrato de amônia 
20 g 
5 g 
10 g 
10 g 
5 g 
3,775 g 
2 g 
Tween 80 1 g 
Sulfato de magnésio 0,2 g 
Sulfato de manganês 0,05 g 
 
 
 Testes de fermentação da fonte de carbono (meio isento de fonte de C em tubos com 
tampa de rosca) 
Materiais: 
 Tubos de ensaio com tampa de rosca preta; 
 Tubos de Durham; 
 Erlenmeyer 250 mL; 
 Autoclave; 
 Reagentes (seguem no quadro abaixo). 
 
 Preparar 100 mL do meio isento da fonte de C e colocar 4 mL em cada tubo (tubo com 
tampa de rosca preta). Depois colocar o tubo de Durham invertido. Fechar o tubo (sem agitar) 
e esterilizar. Verificar, após certo tempo, se há surgimento de bolha dentro do tubo de 
Durham. 
Quadro 1: Composição do meio utilizado no teste de fermentação. 
 
Composição Em 1 L Em 0,1 L 
Extrato de levedura 5 g 0,5 g 
Peptona bacteriológica 3 g 0,3 g 
Fosfato de potássio monobásico 2 g 0,2 g 
Água destilada 1 L 100 mL 
 
 
Depois de dissolver todos os componentes, adicionar o indicador púrpura de 
bromocresol (0,1 mL para 100 mL de meio). 
 
 Testes de assimilação da fonte de carbono (meio isento de fonte de carbono em placas de 
Petri) 
 
Materiais: 
 
 Placas de Petri; 
 Erlenmeyer 500 mL; 
 Rolha de algodão; 
 Tiras de jornal; 
 Barbante; 
 Autoclave; 
 Reagentes (seguem no quadro abaixo). 
 
1. Preparar 500 mL de meio isento de fonte de C. 
 
Quadro 2: Composição do meio utilizado no teste de assimilação. 
 
Composição Em 1 L Em 0,5 L 
Sulfato de amônio 5 g 2,5 g 
Fosfato de potássio monobásico 1 g 0,5 g 
Sulfato de magnésio 0,5 g 0, 25 g 
Cloreto de cálcio 0,1 g 0,05 g 
Cloreto de sódio 0,1 g 0,05 g 
Ágar* 20 g 10 g 
Água destilada 1 L 500 mL 
 
 
Dissolver todos os componentes em 500 mL de água destilada, com exceção do ágar*. 
Pesar, em dois bécheres separados, 5g de ágar em cada. Colocar 250 mL de meio dissolvido em 
erlenmeyer de 500 mL e adicionar os 5 g de ágar. Agitar cuidadosamente. Colocar a rolha de 
algodão e o jornal por cima, amarrando-o com barbante de forma bem firme. Fazer o mesmo 
para os outros 250 mL de meio. Autoclavar a 0,5 atm por 20 minutos. Em uma placa de Petri, 
adicionar o meio isento de fonte de carbono. Após a sua solidificação, adicionar fonte de 
carbono (uma para cada placa de Petri) e espalhar com cuidado. Então, adicionar suspensão, 
em solução salina, do micro-organismo a ser avaliado sobre a placa de Petri preparada. 
 
2. Preparar cada fonte de carbono separadamente. 
 
 Em erlenmeyer de 250 mL, colocar 50 mL da fonte de carbono (3 g da fonte de C em 50 
mL de água destilada) 
 
 Glicose 
 Xilose 
 Lactose 
 
 Para cada micro-organismo, fazer uma suspensão em MRS (sem ágar). 
 
3. Não foi preparado meio isento da fonte de N. 
 
 Testes de esporulação 
Materiais: 
 Placas de vidro; 
 Alça de platina; 
 Solução de NaCl; 
 Placa de Petri contendo meio de cultivo (MRS) e micro-organismo; 
 Solução de verde de malaquita; 
 Microscópio. 
 Em uma placa de vidro, colocar uma pequena quantidade de solução de NaCl, apenas 
para receber o micro-organismo, utilizando uma alça de platina esterilizada. Realizar, 
novamente, a esterilização da alça e retirar uma amostra da bactéria da placa de Petri onde foi 
realizado seu crescimento anteriormente. Espalhar, cuidadosamente, a bactéria sob a placa de 
vidro e esperar alguns segundos. Após isso, espalhar sobre a placa de vidro solução de verde 
 q ’ 15 uida, lavar com 
água destilada, esperar secar e aplicar algumas gotas de safranina. Após 15 segundos, lavar 
com água destilada, esperar secar e observar no microscópio se há coloração verde indicando 
a presença de esporos. 
 
 
Resultados e Discussão 
Após a retirada das amostras plaqueadas, nos diferentes meios, da estufa foi possível 
observar suas características macroscópicas. Foram selecionadas placas que apresentavam 
colônias com características distintas para o esgotamento, sendo estas: 
 
Tabela 3: Colônias a serem esgotadas. 
Quantidade Meio Diluição Colônia 
2 MRS 10-5 "E" e "P" 
2 MRS Modificado 10-5 "L" e "B" 
3 Sabouraud 10-4 
"D", "N" e 
"S" 
 
 O aspecto macroscópico das colônias esgotadas pode ser visto nas fotos abaixo: 
Figura 1: Colônia E. 
 
 
Figura 2: Colônia P. 
 
Figura 3: Colônia B. 
 
 
Figura 4: Colônia L 
 
Figura 5: Colônia D. 
 
 
Figura 6: Colônia N 
 
Figura 7: Colônia S. 
 
 
 O aspecto macroscópico esperado para as colônias seria semelhante ao do 
Lactobacillus casei, que pode ser visto na figura abaixo: 
Figura 8: Aspecto macroscópico do Lactobacillus casei. 
 
 Prosseguiu-se com o teste de coloração de Gram para ô “P” “ ” “B” “D” 
agora nomeadas como Pezão, Lula, Bolsonaro e Dilma, respectivamente. O aspecto 
microscópico das colônias pode ser observado nas fotos abaixo: 
Figura 9: Aspecto microscópico do Pezão.Figura 10: Aspecto microscópico do Lula. 
 
Figura 11: Aspecto microscópico do Bolsonaro. 
 
 
Figura 12: Aspecto microscópico da Dilma. 
 
 
 Apesar de todos os microrganismos serem Gram positivos (o que era esperado, dado 
que o Lactobacillus casei é Gram positivo), pode-se notar uma grande distinção em seu 
aspecto microscópico. Lula e Pezão apresentam aspecto de bacilo, já Dilma se assemelha mais 
a um coco, enquanto Bolsonaro é mais próximo de um fungo filamentoso. 
 AHMED, L.I. et al avaliou a higiene de produtos à base de leite fermentado e encontrou 
que a Sporosarcina ureae era um dos principais contaminantes desse tipo de produto, tendo 
este um aspecto macroscópico muito semelhante ao de Dilma, que pode ser observado na 
figura abaixo: 
Figura 13: Aspecto macroscópico da Sporosarcina ureae. 
 
 
 REIS, J.A. et al avaliou a microbiota contaminante em bebidas lácteas fermentadas e 
observou que das 30 amostras comerciais analisadas, todas continham alguma quantidade de 
fungos filamentosos, além da inexistência de um padrão microbiológico para fungos 
filamentosos e leveduriformes neste tipo de bebida. O que embasa a ideia de que Bolsonaro 
pode ser um fungo filamentoso. 
 
 Prosseguiu-se com uma sequência de testes bioquímicos a fim de confirmar e os 
microrganismos Lula e Pezão são, de fato, Lactobacillus casei. 
 
O primeiro destes foi o teste da produção de catalase, que pode ser facilmente 
demonstrada pela adição de peróxido de hidrogênio à cultura fixada em uma placa. Caso 
ocorra o desprendimento de bolhas (O2) pode-se afirmar que houve decomposição do 
peróxido devido a produção de catalase (e o inverso, caso não haja desprendimento de 
bolhas). Ambos os microrganismos testaram negativo para a produção de catalase, como pode 
ser observado na figura abaixo: 
Figura 14: Teste da produção de catalase. Lula a direita, Pezão a esquerda. 
 
 
Em seguida realizou-se o teste de coloração de esporos utilizando verde de malaquita 
e safranina. Caso ocorra a formação de esporos, estes estariam corados de verde quando 
vistos ao microscópio. O resultado pode ser observado nas figuras abaixo: 
 
Figura 15: Aspecto microscópico do Lula após o teste de coloração de esporos. 
 
 
Figura 16: Aspecto microscópico do Pezão após o teste de coloração de esporos. 
 
 
Foi então realizado o teste de assimilação de fontes de carbono. Nesse teste não foi 
possível observar o crescimento do micro-organismo. Esse problema pode ter ocorrido 
durante o preparo do meio, visto que o micro-organismo é exigente nutricionalmente. Desta 
forma, um erro durante o preparo do meio pode ser suficiente para que o micro-organismo 
não cresça. 
Foi também realizado o teste de fermentação. No teste de fermentação, houve a 
formação de ácido, visto que houve mudança de coloração no tubo, o que era esperado, visto 
que na fermentação deve-se formar ácido lático. Porém, foi observada também a presença de 
uma bolha no tubo, algo que não deveria acontecer, já que na fermentação lática não há 
formação de CO2. Isto pode ter ocorrido durante o preparo do tubo, a imersão do tubo coletor 
de gás pode não ter sido feita corretamente fazendo com que uma bolha de ar tenha ficado 
presa ali. 
 
Figura 17: Teste de fermentação 
 
 
Conclusão 
 
Após a realização dos testes, pode-se dizer que o micro-organismo em questão é o 
Lactobacillus Casei. Apesar de alguns testes terem apresentado resultados diferentes do 
esperado, pode-se facilmente detectar os erros cometidos nos procedimentos experimentais. 
Assim como foi possível observar a presença de Lactobacillus Casei em outras situações como 
a observação macroscópica(onde Pezão e Lula demostraram maior semelhança com o 
Lactobacillus Casei), assim como na observação microscópica. 
Referências 
 
Hygienic Quality of Some Fermented Milk Products. Ahmed, L.I.; Morgan, S.D.; Hafez, R.S. and 
Abdel-All, A.A.A. 
Microbiota contaminante em bebidas lácteas fermentadas comerciais. REIS, J.A.; PENNA, 
A.L.B.; HOFFMANN, F.L. 
Apostila de Microbiologia Aplicada Experimental. FRANÇA, F. P.; AMARAL, P. F. F. 
http://www.pharmakondf.com.br/Pharmakon/arquivos/INSUMOS_FARMACEUTICOS/L/Lac._C
asei.pdf 
http://www.bibliotecadigital.ufmg.br/dspace/bitstream/handle/1843/BUOS-
9QTHDZ/dissertacao_mestrado_ligia_isoni_auad.pdf?sequence=1 
https://is.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/ps06/mikroorg/web/images/bakterie/mikro/