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Apostila Bac Clinica

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CURSO TÉCNICO INTEGRADO EM BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Apostila de Bacteriologia Clínica 
Aulas Práticas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Disciplina: Microbiologia Aplicada – 6° Período (BM-161) 
 
Prof.: Eliezer Menezes Pereira 
 
 
 
 
2010 
 
1 
 
AULA 01 
Coleta de espécimes das vias aéreas superior 
 
1) Introdução: 
 
Com exceção dos membros da família Enterobacteriaceae, as bactérias Gram-positivas, 
principalmente os cocos, são os microrganismos isolados com mais freqüência a partir de 
amostras biológicas humanas em laboratórios de microbiologia. Essas bactérias estão 
amplamente distribuídas na natureza, e podem ser isoladas de ambientes ou como habitantes 
comensais da pele, mucosas e outros sítios. Os cocos Gram-positivos produzem uma 
variedade de doenças, incluindo foliculite, furúnculo, carbúnculo, erisipela e celulite 
(estreptococos), além de pneumonia e bacteremia (pneumococos). Portanto, o isolamento e 
identificação desses microrganismos, a partir de amostras clínicas, sempre deve ser 
correlacionado com o quadro clínico do paciente. 
 
2) Metodologia: 
 
 Semeadura em agar sangue. 
 
EXECUÇÃO: 
 
A. Aos alunos são fornecidos dois “swabs” para colheita de material ao nível de loja e 
superfície das amígdalas, nariz, conjuntiva ou pele. Um dos “swabs” é passado em um 
segmento da placa de agar sangue, completando-se a semeadura por esgotamento 
total, com auxílio da alça de níquel-cromo. Com o outro “swab” faz-se um esfregaço 
em lâmina para posterior coloração pelo método de Gram. 
B. Todas as placas são identificadas com o número da turma, o nome do executor, e o 
material é incubado à 37ºC. 
 
MATERIAL: 
- “swabs” estéreis 
- abaixadores de língua 
- placas de agar sangue. 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
FIGURA: Esquema exemplificando os swabs nasal e de orofaringe 
 
 
 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
AULA 02 
Isolamento de microbiota das vias aéreas superiores: Staphylococcus e 
Streptococcus. 
 
II-Características morfo-tintoriais, coloniais, hemolíticas e obtenção de cultura pura. 
 
1) Introdução: 
 
As bactérias do gênero Staphylococcus, usualmente se apresentam agrupadas em 
forma de cachos de uva (estafilococos). As espécies de maior importância médica são: 
Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus epidermidis. São 
bactérias piogênicas e causam, por exemplo: osteomielite, furunculose, hordéolo (terçol), 
impetigo, infecções urinárias, toxi-infecções alimentares. 
As bactérias do gênero Streptococcus, formam cadeias (estreptococos). As espécies 
de maior importância médica são: S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiae, S. mutans. 
Dependendo da espécie podem causar doenças como: faringite, otite média, pneumonia, 
meningite, septicemia puerperal, endocardite, erisipela. Podem causar, também, doenças não 
supurativas como glomerulonefrite e febre reumática, que são consideradas seqüelas de 
algumas infecções anteriores. 
 
2) Metodologia: 
 
A- Características culturais: 
 
 De acordo com a exposição realizada pelo instrutor, observar as características das 
colônias obtidas em agar sangue, anotando: 
 
a) tamanho aproximado: em mm ou colônias puntiformes. 
b) produção de pigmento: amarelo ou branco. 
c) transparência e brilho: opacas, translúcidas, leitosas, brilhantes ou foscas. 
d) consistência: quebradiças, membranosas, butirosas (como manteiga), viscosas. 
e) ação sobre o sangue: hemólise total, parcial (esverdeada) ou ausência de hemólise. 
 
 OBS: Procurar observar outras colônias encontradas pelos colegas. 
 
B- Repique: 
 
De acordo com a orientação do instrutor, proceder: 
 
 
4 
 
i. As colônias maiores (2mm ou mais), repicar para um tubo de ágar casoy (TSA). 
ii. As colônias menores, repicar para caldo glicosado com extrato de levedura. 
iii. Identificar todos os tubos e incubar à 37ºC, até o dia seguinte (24 horas). 
 
MATERIAL 
- tubos de TSA, inclinado, com extrato de levedura. 
- tubos de caldo TSB 
- placas de agar sangue semeadas no dia anterior. 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
AULA 03: 
Isolamento de microbiota de vias aéreas superiores. 
 
 III - Identificação de Streptococcus e Staphylococcus. 
 
1) Introdução: 
 
Para a diferenciação básica e confirmatória entre os gêneros Staphylococcus e 
Streptococcus, utiliza-se a prova da catalase. A catalase é uma enzima produzida pelos 
Staphylococcus e não produzida pelos Streptococcus. Esta enzima desdobra o peróxido de 
hidrogênio (água oxigenada) em água e oxigênio livre e sua prova positiva pode ser facilmente 
verificada pela simples visualização de bolhas que são formadas quando se adiciona água 
oxigenada à cultura. 
Uma vez diante de bactérias do gênero Staphylococus, utiliza-se a prova da 
coagulase para caracterizar Staphylococus aureus, espécie de grande importância médica. 
Esta espécie coagula o plasma pela ação da coagulase. Uma vez diante de bactérias do 
gênero Streptococus, a capacidade de colônias isoladas de hemolizar hemácias de carneiro 
presentes em meio sólido Agar sangue é considerada para iniciar a identificação das espécies, 
independentemente da atividade biológica destas hemolisinas. 
As hemolisinas são enzimas ou toxinas que destroem os glóbulos vermelhos e outras 
células. Existem hemolisinas, com diferentes propriedades, que são produzidas não somente 
pelas bactérias patogênicas como também pelas não patogênicas. Estas bactérias podem 
produzir halos claros em volta da colônia (halo de hemólise). No que diz respeito às bactérias 
do gênero Streptococcus, quando o halo é totalmente claro, diz-se que a hemólise é do tipo 
beta (β-destruição total das hemácias); quando esverdeado, diz-se hemólise é do tipo alfa (α - 
destruição parcial das hemácias); e, quando não há hemólise, esta é chamada do tipo gama (- 
ausência de hemólise). 
Em se tratando de uma bactéria beta-hemolítica, utiliza-se a prova da bacitracina 
que caracteriza Streptocococus pyogenes, (Streptococcus beta-hemolíticos do grupo A 
(sorogrupo A). Um disco de papel filtro contendo 0,05 unidades de bacitracina é depositado na 
superfície de uma placa com Ágar sangue semeado previamente com a bactéria em estudo. 
Os estreptococos beta-hemolíticos do grupo A são sensíveis a bacitacina e, portanto, 
apresentam zona de inibição de 12 a 17 mm; enquanto que, os demais grupos de 
estreptococos geralmente não são inibidos. 
Em se tratando de estreptococos alfa-hemolíticos, utiliza-se de maneira semelhante a 
prova da optoquina (cloreto de etil-hidrocupreina). Se o estreptococo em estudo for o 
Streptococus pneumoniae (pneumococo) haverá, uma zona de inibição de crescimento de 15 
a 30 mm. 
 
 
6 
 
2) Metodologia: 
 
 Microscopia de cultura pura: 
 
- Fazer um esfregaço da cultura obtida em meio líquido e em meio sólido a partir dos repiques 
realizados na aula anterior. 
- Corar pelo método de Gram. 
- Observar e descrever o aspecto morfo-tintorial dos microrganismos. 
 
 Caracterização do gênero Staphylococcus 
 
A - Produção da Enzima Catalase 
 A produção da enzima catalase é verificada em lâmina de microscopia, tocando-se em 
uma colônia bacteriana, com auxílio de uma agulha bacteriológica e, posteriormente em uma 
gota de soluçãode peróxido de hidrogênio a 3%. A formação de bolhas é indicativa de reação 
positiva. 
 
B - Óxido-Fermentação da Glicose (OF) 
 A utilização da glicose de modo fermentativo ou oxidativo é verificada pela inoculação 
por picada vertical de uma colônia da amostra, com auxílio de uma agulha bacteriológica, até 
2/3 do meio de Hugh Leifson com 1% de glicose. Para cada amostra devem ser inoculados 2 
tubos e um dos tubos deve ser coberto com óleo mineral. A leitura deve ser realizada 
diariamente até 72 h de incubação a 35
o
C. A mudança da cor do meio de verde para amarelo é 
indicativo da presença de microrganismo sacarolítico. Quando ocorre nos dois tubos é 
indicativa de metabolismo fermentativo (MF), enquanto que a modificação da cor do meio 
somente no tubo sem óleo é indicativo de metabolismo oxidativo (MO). A ausência de alteração 
na cor do meio indica presença de microrganismo assacarolítico. 
 
B – Resistência à Bacitracina 
 A resistência à bacitracina é verificada utilizando-se discos contendo 0,04U do 
antibiótico em ágar Müeller-Hinton. A amostra deve ser inoculada de forma a se obter 
crescimento confluente e o disco deve ser colocado sobre este inóculo. O resultado é obtido 
em 24h de incubação, a 35
o
C. Amostras resistentes à bacitracina não apresentam halo de 
inibição. 
 
 
 
 
 
 
7 
 
 Identificação de espécies de Staphylococcus 
 
A- Crescimento das culturas crescidas em meio sólido Ágar-manitol: 
- Colônias de cor amarela = fermentação positiva de manitol (Staphylococcus aureus) 
-Conônias de cor rosa = fermentação negativa de manitol (SCN) 
 
B- Produção de Hemólise 
 A verificação da produção de hemólise é realizada por inspeção visual da cultura 
realizada em meio de ágar contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, após 24, 48 e 72 
h de incubação a 35
o
C. O aparecimento de zona de hemólise intensa ao redor das colônias até 
72 h de incubação é indicativo de hemólise positiva, enquanto zona de hemólise fraca ou 
ausente é indicativo de hemólises fraca ou negativa, respectivamente. 
 
C- Produção de Coagulase 
 Este teste é realizado a partir de 3 colônias isoladas repicadas para tubo contendo 
plasma de coelho diluído (v/v) em solução salina a 0,85% (0,2 mL de plasma em 0,2 mL de 
salina). Após incubação por 4 h a 37
o
C, em banho-maria, é verificada a produção ou não de 
coágulo. Resultados negativos devem ser confirmados com 24 h de incubação. 
 
D- Resistência à Novobiocina 
 A resistência à novobiocina é verificada utilizando-se discos contendo 5g do 
antibiótico em ágar Müeller-Hinton. A amostra deve ser inoculada de forma a se obter 
crescimento confluente e o disco deve ser colocado sobre este inóculo. O resultado é obtido 
em 24h de incubação, a 35
o
C. Amostras resistentes à novobiocina apresentam halo de inibição 
menor ou igual a 16mm. 
 
 Identificação de espécies de Streoptococcus 
 
A- Hemólise em Agar sangue 
 
B- Teste da bacitracina 
Identificação presuntiva de Streptococcus pyogenes (estreptococos beta hemolítico do 
grupo A de Lancefield), uma vez que 95% destas amostras são sensíveis à bacitracina. É um 
teste de mais fácil execução para os laboratórios de análises clínicas do que a identificação 
definitiva feita através da grupagem sorológica. 
Teste da resistência a optoquina: colônias alfa-hemolíticas de cocos catalase-negativos 
(caracterização de S. pneumoniae) 
 
 
 
8 
 
C- Teste da optoquina (para alfa-hemolíticos) 
 
Proceder da mesma forma que o anterior. Caso haja resistência ao antimicrobiano, 
caracteriza-se amostra de Streptococcus pneumoniae. 
 
D – Prova do CAMP 
 
Utilizado para caracterização de Streptococcus agalactiae. Em placa de agar sangue, fazer 
uma estria central com bacterias da especie S. aureus hemolítica usando a alça de platina 
flambada e, em seguida, fazer estrias perpendiculares a estria central com bactérias do gênero 
Streptococcus a ser identificada. A prova e considerada positiva quando são formadas regiões 
de hemólise em formato de seta próximo ao crescimento das duas espécies. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
AULA 4 
Urinocultura quantitativa I 
 
I. Semeadura das diluições da urina 
 
1) Introdução 
As infecções urinárias estão entre as enfermidades mais freqüentes na pratica medica, 
sendo que o sexo feminino e o mais afetado devido a proximidade do anus com a abertura 
urinaria e ao fato da uretra feminina ser mais curta do que a masculina entre outros fatores, 
o que proporciona a predominância de enterobactérias neste sitio anatômico, sobretudo 
Escherichia coli uropatogênica (UPEC). Outro agente causador de infecção urinária 
comunitária é o Staphylococcus saprophyticus, um SCN. Dentre os germes isolados de 
infecções urinárias hospitalares, temos diversas enterobactéricas, como Proteus, 
Enterobacter e Citrobacter e também os não-fermentadores Pseudomonas aeruginosa e 
Acinetobacter spp. 
Para esta prática utiliza-se isolamento e contagem em Agar CLED (cystine lactose 
eletrolyte deficient), que é um meio de cultura que inibe crescimento em “swarming” de 
cepas de Proteus, além de isolar e quantificar os microorganismos da urina. É um meio de 
coloração azul clara onde apresenta coloração amarelada para colônias de 
microorganismo lactose positivos e coloração azul para lactose negativos. 
 
2) Metodologia 
 
 Partindo-se de uma amostra de urina colhida em frasco estéril e mantida em geladeira 
até a hora do uso, fazer diluições de 1:10, 1:100 e 1:10.000, conforme abaixo 
especificado. 
 Anotar nas placas de Agar CLED as diluições 1:100 e 1:10.000. 
 Com nova pipeta estéril, aspirar 0,1ml da diluição mais alta, isto é, 1:10.000 e semear, 
espalhando bem com a própria ponta da pipeta na superfície da placa indicada. 
Esgotar bem a pipeta e, com a mesma aspirar igualmente 0,1ml da diluição seguinte 
(1:100) semeando, do mesmo modo, na placa correspondente. 
 Incubar todas as placas na estufa. Manter por alguns minutos com a parte que contém 
o agar para baixo 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
11 
 
AULA 5 
Urinocultura quantitativa II e Coprocultura I 
 
1) Introdução 
 
Os bacilos Gram-negativos pertencentes às Enterobacteriaceae são as bactérias 
isoladas com mais freqüência de amostras biológicas, principalmente fezes. Distribuídos 
amplamente na natureza, esses microrganismos sao encontrados no solo, água, plantas e 
no trato intestinal de seres humanos e animais. Portanto, os membros dessa família podem 
ser suspeitos em virtualmente qualquer tipo de doença infecciosa e isolados de qualquer 
amostra recebida no laboratório. As Enterobacterias sao bacilos anaeróbios facultativos e 
nao produtores de esporos, são fermentadores de glicose e produtores de endotoxinas e 
exotoxinas, além de serem oxidase negativa. Devido ao grande numero de espécies, uma 
bateria de provas bioquímicas deve ser feita, a fim de caracterizar definitivamente um 
membro. 
 
2) Metodologia 
 
A- Semeadura de fezes 
 
 - A partir de fezes líquidas (diarréicas) ou de suspensão de fezes sólidas semear, 
sobretudo os fragmentos de muco e/ou sangue, na superfície de uma placa de agar-eosina-
azul de metileno (EMB ou Teague), procurando fazer semeadura por esgotamento. Incubara 37ºC. 
 
MATERIAL 
- Placas com EMB agar (Teague) 
- Tubos com suspensão de fezes 
 
B - Urinocultura quantitativa II. 
 
 II- Contagem das colônias. 
 
 Fazer a contagem de colônias nas placas semeadas com as diversas diluições de 
urina, considerando sobretudo os resultados obtidos em placas que oferecem entre 30 
a 300 colônias. 
 Fazer o cálculo do número de colônias por mL, multiplicando o número de colônias 
contadas por 10 (relação de inóculo para 1,0 mL) e pela diluição. Assim, sendo “n” o 
número de colônias, temos: 
 
12 
 
Urina diluida a 1:100: nx10x100 = nº de colônias/ml. 
Urina diluida a 1:10.000: nx10x10.000 = nº de colônias/ml. 
 
- Inocular as colônias suspeitas em Ágar McConkey, Agar manitol-salgado e TSA 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
AULA 6 
Coprocultura II e Urinocultura III – Identificação bioquímica de Enterobacterias 
 
1) Introdução 
 
A diferenciação das bactérias desta família é realizada com provas bioquímicas 
(biotipagem). Para a identificação das espécies ou dos tipos bacterianos, podem ser utilizadas 
provas complementares, que consistem em: testes sorológicos (sorotipagem: antígenos 
somáticos-O, antígenos capsulares-K, antígenos flagelares-H); e/ou, análise da reação 
frente a bacteriófagos específicos (fagotipagem). Este conjunto de testes é muito utilizado na 
prática, principalmente no que diz respeito à identificação das categorias de E. coli 
enteropatogênicas para o homem: EPEC, EIEC, ETEC, EHEC, EAEC, etc 
 
2) Metodologia: 
 
- PARA GRAM - : Os alunos examinarão as placas do meio de EMB-agar (coprocultura) 
anotando a diferença entre colônias lactose positivas (escuras ou somente com centro escuro) 
e lactose negativas (claras). Da mesma forma, analisar as amostras no ágar McConkey 
correspondente a urinocultura (transparentes – não fermentadoras; rosas – fermentadoras). 
- PARA GRAM + : Verificar no ágar manitol salgado a fermentação do carboidrato, como já 
visto. Proceder a testes de coagulase e resistência a novobiocina (prováveis: S. aureus, S. 
saprophyticus, Enterococcus faecalis 
- Repicar uma colônia Lac+ e uma Lac- para os meios de TSI, LIA e Citrato. 
- Identificar os tubos e incubar na estufa a 37ºC. 
 
A - TSI (“ Triple Sugar Iron”) 
 A utilização do ágar TSI inclinado permite a verificação da produção de gás, de H2S 
(ácido sulfídrico) e fermentação dos açúcares: lactose, glicose e sacarose. Inóculo: a partir de 
uma colônia isolada, com auxílio de uma agulha bacteriológica fazer picada central até o fundo 
do tubo e estriar a superfície inclinada do ágar. A leitura do teste deve ser realizada após 
incubação por 24 h a 37
o
C, com observação da fermentação dos açúcares pela modificação 
parcial ou total da cor do meio para amarelo, produção de gás pela formação de bolhas e 
produção de H2S pelo surgimento de precipitado negro. Os resultados de cada teste devem ser 
considerados de acordo com o esquema apresentado na tabela a seguir. 
 
B - LIA (“Lisine Iron Ágar”) 
 A utilização do meio LIA inclinado permite a verificação da descarboxilação da lisina, 
deaminação da fenilalanina e a produção de H2S. Inóculo: a partir de uma colônia isolada, com 
auxílio de uma agulha bacteriológica fazer picada central até o fundo do tubo e estriar a 
superfície do ágar. A leitura do teste deve ser realizada após incubação por 24 h a 37
o
C. A 
modificação da cor do meio para púrpura é indicativo de reação positiva de descarboxilação da 
14 
 
lisina, enquanto que para amarelo é indicativo de reação ácida pela utilização da glicose. A 
produção de H2S é verificada pela formação de precipitado negro. Uma reação avermelhada na 
superfície do meio é indicativa de reação positiva para deaminação da fenilalanina. 
 
C – Citrato 
 A utilização do citrato como única fonte de carbono é verificada em ágar citrato 
inclinado. Inóculo: a partir de uma colônia, com auxílio de uma agulha bacteriológica fazer um 
risco central na superfície da porção inclinada do ágar. Após incubação por 24 h, a 37
o
C, o 
desenvolvimento de uma coloração azul é indicativo de reação positiva. 
 
OBS.: Os três testes (TSI, LIA e Citrato) devem ser inoculados nesta ordem a partir de uma 
colônia isolada. 
 
D - Produção da Enzima Urease 
 A produção de urease é verificada pela inoculação de 5 colônias da amostra em 3 mL 
de caldo uréia de Rustigian & Stuart (pH 6,8) acrescido de 2% de uréia, por 48 h de incubação 
a 35
o
C. A mudança de coloração do meio de amarelo para vermelho ou rosa é indicativa de 
resultado positivo. 
 
E – Características bioquímicas nos meios TSI, LIA, Citrato e Uréia das principais 
espécies de Enterobactérias envolvidas em Infecções Humanas. 
Gêneros ou TSI LIA Citrato Uréia 
Espécies Superfície Base Gás H2S Superfície Base H2S 
Escherichia A A + - K K ou N - - - 
Shigella K A - - K A - - - 
Salmonella K A + + K K ou N + + - 
Citrobacter K (A) A + + K A + + +/- 
Klebsiella A A ++ - K ou N K ou N - + +/- 
Enterobacter A A ++ - K ou N A ou K - + -/+ 
Serratia marcescens K A + - K ou N K ou N - + - 
Proteus vulgaris K A +/- + V A + -/+ + 
Proteus mirabilis K A + + V A + +/- + 
Morganella morganii K A + - K ou V A - - + 
Yersinia K A - - K A - - +/- 
Adaptado de Diagnostic Microbiology, 5
o
Ed, 1997. K – reação alcalina, A – reação ácida, N – 
reação neutra, V – vermelho (deaminação oxidativa da fenilalanina); ++, reação fortemente 
positiva; +, 90% ou mais de amostras positivas,-, 90% ou mais de amostras negativas; +/-, 50-90% 
de amostras positivas; -/+, 50-90% de amostras negativas. Interpretação: TSI: K/K – não-
fermentador, K/A – fermentação positiva para glicose e negativa para lactose e/ou sacarose, A/A – 
fermentação positiva para glicose, lactose e/ou sacarose; LIA – K/K ou K/N ou N/N– 
descarboxilação da lisina positiva, K/A – descarboxilação da lisina negativa e V/A – 
descarboxilação da lisina negativa e deaminação da fenilalanina positiva. 
15 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
AULA 7 
Bacilos Gram-negativos não-fermentadores (BGNNF) 
 
1) Introdução 
 
Os bacilos Gram negativos classificados como não fermentadores (BNFs) são 
microrganismos aeróbios, não esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem 
incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia através de fermentação, 
degradando-os pela via oxidativa. 
A identificação dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratórios de rotina em 
microbiologia, considerando que a maioria deles não realiza este tipo de identificação, ou o 
faz de maneira elementar em virtude da pouca incidência em amostras ambulatoriais, 
assim como pela complexidade e elevado custo dos esquemas completos de identificação. 
A caracterização deste grupo de bactérias é de grande importância nos casos de infecção 
hospitalar. 
Embora a sua incidência, mesmo em hospitais, seja pequena quando comparada a 
outros agentes etiológicos, geralmente eles apresentam resistência elevada a vários 
antibióticos e são capazes de causar infecções graves. Estas bactérias colonizam e 
causam infecções, em especial, em pacientes graves oriundos de CTI e submetidos à 
procedimentos invasivos, sendo importante classificá-los até o nível de gênero e espécie. 
Os principais representantes do grupo são: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacterspp, Stenotrphomonas maltophilia, Burkolderia cepacia. 
 
2) Metodologia 
 
A – Caracterização de BGNNF 
 
A.1 – Ausência de alteração no meio de TSI. 
A.2 - Crescimento discreto ou ausente em ágar MacConkey 
 
B – Identificação presuntiva das espécies de BGNNF mais freqüentes 
 
B.1 – Teste da produção de oxidase 
 
 A produção da enzima citocromo oxidase é verificada pela inoculação de uma colônia 
bacteriana sobre papel de filtro (Whatman n
o
1), utilizando-se uma espátula de plástico. 
Posteriormente, adiciona-se 1 gota do reagente dimetil--fenilenodiamino a 1% (p/v) em água 
destilada esterilizada sobre a colônia. O surgimento de uma coloração púrpura até 10 
segundos indicará teste positivo. 
 
17 
 
 
B.2 – Óxido-fermentação da glicose (OF) 
Verificar metabolismo oxidativo, conforme o item 2.1.1.B. 
 
B.3 – Crescimento a 42
o
C 
 O crescimento visível do microrganismo é verificado em 3 mL de meio TSB após um 
período de incubação de 24 h a 42
o
C em banho-maria. Inóculo leve: tocar em uma colônia 
bacteriana e o inóculo não deve deixar o meio turvo. 
 
B.4 – Meio motilidade 
Inoculação em Agar semi-sólido na forma de espícula. 
 
B.5 – Descarboxilação da lisina. 
 Idem ao item 2.1.2.H utilizando caldo base Moeller (pH 6,0) com 1% de L(+)-lisina. 
 
B.6 – Susceptibilidade a Polimixina B 
 Idem ao item 2.1.1.E utilizando disco de polimixina B (300UI). 
 
C - Características bioquímicas gerais das principais espécies de BGNNF 
encontradas em Infecções Hospitalares. 
 
Espécie 
OX MOT PIG LIS PB C42
o
C PROD 
HEM 
Pseudomonas aeruginosa + + + - S + ND 
Acinetobacter baumannii - - - ND S ND - 
Acinetobacter haemolyticus - - - ND S ND + 
Stenotrophomonas maltophilia - + - + S ND ND 
Burkolderia cepacia w + - + R ND ND 
Adaptado de Diagnostic Microbiology, 5
o
Ed, 1997. OX – teste da produção de oxidase, MOB 
– mobilidade, PIG – produção de pigmento, LIS – descarboxilação da lisina, PB – 
susceptibilidade a Polimixina B, C42
O
C – crescimento a 42
o
C / +, 90% ou mais de amostras 
positivas,-, 90% ou mais de amostras negativas, w, reação fraca, ND – não determinado 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
AULA 8 
 Antibiograma 
 
1) Introdução 
O antibiograma e um teste que oferece como resultado padrões de resistência ou 
susceptibilidade de uma bactéria especifica a vários antimicrobianos (antibióticos ou 
quimioterápicos). Seu objetivo e tanto a analise do espectro de sensibilidade/resistência a 
drogas de uma bactéria quanto a determinação da concentração mínima inibitória, esta e 
definida como a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que impede 
crescimento visível de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluição em Agar 
ou caldo. 
A técnica de disco-difusao (Kirby-Bauer) e de diluição em caldo são exemplos de 
Testes de sensibilidade e resistência a antimicrobianos. Para esses testes deve ter 
padronização do meio de cultura, inoculo (escala 0,5 Mc Farland – 10
8
 bactérias/mL) e 
antimicrobianos. Estes últimos são de acordo com a bactéria isolada e fornecido pelo 
Manual do Clinical and Laboratory Sandards Institute (CLSI). Nele podem-se identificar os 
grupos de drogas sugeridas para os antibiogramas. 
A técnica de disco-difusao e a mais utilizada, padronizada pelo CLSI, e realizada no 
agar Mueller-Hinton ou sangue. Esta técnica ainda possibilita a flexibilidade na escolha dos 
discos, e de baixo custo, fácil execução e interpretação e tem ainda boa reprodutibilidade. 
E um teste qualitativo, dando como resultado se o microorganismo e sensível, intermediário 
ou resistente. E necessário ainda para realizar a técnica: o inoculo, os discos impregnados 
com antimicrobiano e a difusão da droga. A ausência do halo de inibição indica que o 
microorganismo e resiste a tal antimicrobiano. A presença do halo de inibição indica que o 
microorganismo pode ser sensível, intermediário ou resistente, dependendo do tamanho 
deste halo. 
A técnica de diluição em caldo e a considerada “padrão ouro”, no Brasil e pouco 
utilizado, e de baixo custo, difícil execução e também e padronizada pelo CLSI. Para 
realizá-la deve-se determinar a CIM (Concentração inibitória mínima), dada em μg/mL. Este 
método e quantitativo (breakpoints), dando como resultado que o microorganismo pode ser 
sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano. 
 
2) Metodologia 
 
- Técnica de difusão a partir dos discos 
 
- Repicar os bastonetes Gram negativos e/ou Cocos Gram positivos para a solução salina 
fazendo uma suspensão próxima ao tubo 0,5 da escala de MacFarland. 
19 
 
- Umedecer um ”swab”, em condições assépticas, a partir da suspensão microbiana em salina 
obtida acima e com este “swab” semear toda a superfície do meio de cultura na placa de Petri, 
visando a obtenção de crescimento confluente. 
- Após a semeadura, pegar os discos de antibióticos com pinça estéril e colocá-los em 
espaços eqüidistantes. Incubar à 37ºC até o dia seguinte. 
 
 
 
3) RESULTADOS E ANOTAÇÕES DO GRUPO

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