espectrometria de massas e proteomica

Prévia do material em texto

Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
Espectrometria de massas e proteômica 
BCM13042 - Fundamentos de Análises de Proteínas (2011/2) 
Dr. Diogo Ribeiro Demartini | diogord@terra.com.br 
Laboratório de Proteínas Tóxicas 
Centro de Biotecnologia e Departamento de Biofísica - UFRGS 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1. Espectrometria de massas 
 
a) Histórico; 
b) Fundamentos básicos; 
c) Componentes e tipos de equipamentos; 
d) Tipos de ionização; 
e) Tipos de fragmentação; 
f) Detecção; 
 
2. Proteômica 
 
a) Preparo de amostras (2D, 1D, GeLC, HPLC, etc...); 
b) Abordagens (Botton Up & Top Down, fosfo, PTM); 
c) Fragmentação de peptídeos; 
d) Proteômica quantitativa; 
 
 
Introdução 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.a - Histórico 
 
Prof. Charley Staats 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 Medida da relação massa/carga de um íon 
 
 Diferentes de outras técnicas, MS não envolve uma região específica do 
espectro eletromagnético; 
 
 massa/carga (m/z): massa do íon / carga do íon 
 
– 1 unidade de massa atômica = 1 Da = 1/12 massa 12C. 
– 1 kDa = 1000 amu 
 
 
 
1.b - Fundamentos básicos 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 
0 
2000 
4000 
6000 
8000 
Co
un
ts
 
 2840 2845 2850 2855 
Mass (m/z) 
Resolution = 14200 
Resolution = 4500 
 
Resolution =18100 
1.b - Fundamentos básicos 
Prof. Charley Staats 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.c – Componentes e tipos de equipamentos 
IONIZAÇÃO DETECÇÃO ANÁLISE 
 Electron Ionization (EI) 
 
 Chemical Ionization (CI/APCI) 
 
 Photo-ionization (APPI) 
 
 Electrospray (ESI) 
 
 Matrix-assisted Laser Desorption 
 (MALDI) 
 Field Desorption (FD) 
 
 Plasma Desorption (PD) 
 
 Fast atom bombardment (FAB) 
 
 High-temperature Plasma (ICP 
 Sector Mass Analyzers 
 (Magnetic and Electrostatic) 
 Quadrupole Analyzers 
 
 Ion Traps 
 
 Ion Cyclotron Resonance 
 
 Time-of-Flight 
Adaptado de “Villanova University “ 
 MCP Microchannel 
Plate Detectors 
http://www.rmjordan.com/jpegs/40mmmcp.jpg 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
Aebersold R, Mann M. 2003. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422, 198-207. 
A MONTAGEM DO EQUIPAMENTO É FEITA ATRAVÉS 
DA COMBINAÇÃO DOS COMPONENTES 
1.c – Componentes e tipos de equipamentos 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.c – Componentes e tipos de equipamentos 
IONIZAÇÃO DETECÇÃO ANÁLISE 
MALDI 
ESI 
DESI 
TOF 
Q 
Qq 
QQQ 
LTQ 
SELDI 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 
MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) 
The technique which we now know as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) was developed 
simultaneously in two laboratories in 1987. The first report of high mass ions (above m/z 10,000) was a paper 
presented by Koichi Tanaka of the Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) at the Second Japan-China Joint 
Symposium on Mass Spectrometry, held September 15-18, 1987 in Takarazuka, Japan. Using a pulsed N2 laser 
(337 nm) and a time-of-flight mass spectrometer equipped with a coaxial reflectron, they recorded molecular 
ions at m/z 34,529 from carboxypeptidase-A dissolved in a slurry of glycerol and an ultra-fine metal powder. In 
addition, they reported a mass spectrum of lysozyme (MW 14,307) containing multimeric ions up to the 
pentamer recorded at m/z 71,736. At the same time, Michael Karas and Franz Hillenkamp from the University of 
Muenster (Germany) had developed a matrix-assisted technique using a frequency-quadrupled (266 nm) Q-
switched Nd:YAG laser to desorb intact molecular ions from proteins dissolved in matrix solution containing 
nicotinic acid. Their first high mass results were reported at the International Mass Spectrometry Conference 
(IMSC) in Bordeaux, France in August 1988, and included molecular ions for bovine serum albumin observed in 
their mass spectrum at m/z 66,750. Results from both of these groups were first published in 1988, followed by a 
number of other reports by Hillenkamp and Karas for proteins with molecular weights in excess of 100 kDa. 
 
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y; Yoshida, T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 151-153. 
 
Karas, M.; Hillenkamp, F., Anal. Chem. 60 (1988) 2299-2301 Skoog. Principles of Intrumental Analysis. 1998. 5th Ed. 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 
Laser 
placa M 
A 
TRASFERÊNCIA DE ENERGIA ENTRE A 
 MATRIZ E O ANALÍTO 
AMBOS VOOAM!! 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 
http://bioms.chem.uu.nl/index.php/education/open-access-master-courses 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 
Íon [M+H]+ 
Menos sensível a contaminantes 
Sensibilidade: fentomol 
Análise high-troughput (rápido e relativamente fácil) 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 
Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas. 
O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de 
gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, 
formando gotículas altamente carregadas. 
 
Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou 
múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o 
campo eléctrico aplicado. 
 
No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos 
e no modo negativo, os íons são desprotonados 
(M + nH)n+ 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 
1- formação de microgotículas; 
2- evaporação do solvente (gás)- rompimento do limite de Rayleigh; 
3- ionização (formas multicarregadas) – (M+nH)n+; 
4- entrada no espectrômetro 
Modo positivo (protonados) 
Modo negativo (deprotonados) 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 
-Automatização; 
 
-Acoplamento a sistemas 
cromatográficos; 
 
-Geração de íons 
multicarregados; 
 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
Electron Ionization (EI) – bombardeamento; fragmentação 
excessiva; 
Chemical Ionization (CI/APCI) – tranferência de prótons através 
do uso de gás (CH4) 
Photo-ionization (APPI) – ioniza o que ESI não consegue. 
Desorption-electrospray ionization (DESI) – combinaçãod 
MALDI e ESI (incidência de laser e spray, em uma matriz sobre 
uma placa NÃO inerte) 
Fast atom bombardment (FAB)- moléculas lábeis. 
High-temperature Plasma (ICP) – fluxos na ordem de 50 
mL/min!!!! 
1.d- Tipos de ionização – demais tipos de ionização 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.d- Tipos de ionização – comparativo 
http://www.chem.agilent.com/en-US 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 Por que fragmentar? 
 Como fragmentar? 
 Como analisar? 
 Como DETECAR? 
1.e- Tipos de FRAGMENTAÇÃO 
CID: COLLISION INDUCED DISSOCIATION – COLISÃO FÍSICA ENTRE O ÍON 
PRECURSOR E UM GÁS (Ar, He, N2); 
 
EDT: ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION – REAGENTE ANIÔNICO 
TRANSFERE ENERGIA PARA O PEPTÍDEO POSITIVO;ECD: ELECTRON CAPTURE DISSOCIATION – CONVERSÃO DO PEPTÍDEO 
IONIZADO PARA UMA FORMA RADICALAR 
 
INFRARED MULTHIPHOTON DISSOCIATION – ABSORÇÃO DE FÓTONS 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1.f- Detecção 
MCP: U$ 20.000,00 
Do tamanho de uma moeda de UM REAL!!! 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 Tecido de origem 
 Tratamento necessário à resposta biológica; 
 Remoção de contaminantes; 
 Digestão das proteínas a peptídeos; 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras -digestão 
“ Reduzir” as proteínas a peptídeos; 
Expor ao máximo os sítios de 
clivagem (redução com DTT seguida 
de alquilação) 
Digestão por enzimas (geralmente 
tripsina, alta especificidae (Arg/Lis) 
 
O PREPARO DAS AMOSTRAS É PONTO CRÍTICO DE 
QUALQUER EXPERIMENTO PROTEÔMICO 
Anal Bioanal Chem (2007) 389:991–1002 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 Remoção de contaminantes 
 Detergentes, sais, açúcares, etc... O espectrômetro NÃO sabe 
que estamos trabalhando com peptídeos 
 
 Enriquecimento de peptídeos de interesse, 
modificados ou não 
 Enriquecimento de peptídeos fosforilados, atrvés do uso de 
cromatografias de afinidade por metal imobilizao (Fe, Ti, Ga); 
 
 Pré-fracionamento das amostras para análise 
 Eletroforese uni ou bi-dimensional, cromatrografias diversas. 
Associação de cromatrografias de troca catiônica forte, com 
fase reversa: MuDPIT 
 
 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras – fosfopeptídeos 
Proteomics 2009, 9, 1451–1468 
MOMENTO BIOQUÍMICO 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras - Overview 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 Gel-1D 
 
 Gel-2D 
 
 Cromatografia multidimensional 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 1D 2D 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
m
M
 N
aC
l 
1000 
 
 
500 
 
100 
A 2
80
/m
L 
100 
 
50 
 
 
0 
%
 A
CN
 
100 
 
50 
 
 
0 
%
 A
CN
 
100 
 
50 
 
 
0 
%
 A
CN
 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
2.a- Proteômica – Preparo de amostras - MudPIT 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.b- Proteômica – Abordagens Botton upe Top down 
 
http://en.wikipedia.org/wiki/Bottom-up_proteomics 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas 
com base no tamanho dos peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina, 
comparando-se o espectro de massa real com o teórico, obtido a partir dos bancos 
de dados de proteínas. 
1529 1 478 
1529.7 0.1 164 
1529.73 0.01 25 
1529.734 0.001 4 
1529.7348 0.0001 2 
Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database 
Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança 
na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos 
trípticos. 
2.c- Proteômica – Resolução e analisadores 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
1 – MS-Setor magnético: os íons moleculares são focalizados, 
formando um feixe, são acelerados através de um campo 
magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as 
massas dos íons 
2.c- Proteômica – Analisadores 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2- Quadrupolo: quatro eletrodos longos ou não, com 
cargas opostas e paralelas 
2.c- Proteômica – Analisadores 
+ + 
- 
- 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo) 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo) 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores 
3- Ion trap: literalmente, armadilha de íons. 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores (ion trap) 
- Transmissão em feixes; 
- Armazenamento temporário dos íons; 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores 
TOF 
TOF/TOF 
TEMPO DE VÔO DEPENDE DA ENERGIA CINÉTICA 
 
D
eV
mt .
2
2
1





=
3- TOF: time of flight 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) 
Rápido 
Fácil de usar 
Resolucão moderada 
Moléculas grandes ( 70 kDa…) 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 
PEPTÍDEO 
PEPTÍDEO 
PROTONADO 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 
Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de 
fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que 
correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido. 
Sequenciamento de novo de proteínas 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 
A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela 
determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso 
do exemplo, os íons y. 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 
Espectro MS/MS do peptídeo tríptico 
GLSDGEWQQVLNVWGK. 
AA Codes Mono. AA Codes Mono. 
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694 
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858 
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496 
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259 
Val V 99.068414 Met M 131.04048 
Thr T 101.04768 His H 137.05891 
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841 
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111 
Ile I 113.08406 CMC 161.01467 
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333 
- - - Trp W 186.07931 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 
2.d- Proteômica e a análise de dados 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
 Comparação de massas reais obtidas no 
equipamento, com massas teoricas; 
 Rastreamento contra bancos de dados; 
 MASCOT: socore 
 SEQUEST: Xcorr 
 Escores diferentes para um “hit”; 
 Número de peptídeos únicos que identificam uma 
proteína 
2.d- Proteômica e a análise de dados 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
QUANTIFICATION BASED ON 
NUMBER OF ACQUIRED MS2 SPECTRA 
MS 
m/z 
in
te
ns
ity
 
Nano-LC 
Time (min) 
in
te
ns
ity
 
m/z 
MS2 
Spectra 1 
Peptide 1 
Spectra 2 
Peptide 2 
Spectra 3 
Peptide 3 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
Nano-LC 
Time (min) 
in
te
ns
ity
 
5-10 scans/second 
60 min acquisition time 
36,000 acquiredspectra/hour 
MS MS2 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
Spectrum 1 
Peptide 1 
Spectrum 2 
Peptide 2 
Spectrum 3 
Peptide 3 
MELSPRAAEL TNLFESRIRN FYANFQVDEI GRVVSVGDGI AQVYGLNEIQ AGEMVLFANG 
VKGMALNLEN ENVGIVVFGG DTAIKEGDLV KRTGSIVDVP AGKAMLGRVV DAMGVPIDGR 
GALSDHEQRR VEVKAPGILE RKSVHEPMQT GLKAVDSLVP IGRGQRELLI GDRQTGKTTI 
AIDTILNQKQ INSRATSESE TMYCVYVAIG QKRSTVGQLI QTLEEANALE YSILVAATAS 
DPAPLQFLAP YSGCAMGEYF RDNGMHALII YDDLSKQAVA YRQMSLLLRR PPGREAFPGD 
VFYLHSRLLE RAAKRSDQTG AGSLTALPVI ETQAGDVSAY IPTNVISITD GQICLETELF 
YRGIRPAINV GLSVSRVGSA AQLKAMKQVC GSSKLELAQY REVAAFAQFG SDLDAATQAL 
LNRGARLTEV PKQPQYAPLP IEKQILVIYA AVNGFCDRMP LDRISQYEKA IPNSVKPELL 
QALKGGLTNE RKMEPDAFLK ERALALI 
ATPase alpha subunit : gi 140325074 
AAELTNLFES 
HIGH CONFIDENCE MATHING CRITERIA 
ATPase alpha subunit : gi 140325074 
 
- PROTEIN PROBABILITY: >95% 
- Minimun of 2 unique non-overlapping peptides 
- Xcorr: 
 +1; 1.5 
 +2: 2.0 
 +3: 2.5 
DNGMHALIIYDDLSKQAVAY TGSIVDVPAGKAMLG 
SEQUEST algorithms 
ScaffoldTM algorithms 
MS2 
Espectrometria de massas e proteômica 
Diogo Ribeiro Demartini 
2.e- Proteômica quantitativa 
 Label-free: livre de marcação 
 Labelled: 
 iTRAQ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 marcação isotópica (18O) 
 
	Slide Number 1
	Introdução
	1.a - Histórico
	1.b - Fundamentos básicos
	1.b - Fundamentos básicos
	1.c – Componentes e tipos de equipamentos
	1.c – Componentes e tipos de equipamentos
	1.c – Componentes e tipos de equipamentos
	1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
	1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
	1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
	1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
	1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa)
	1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa)
	1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa)
	1.d- Tipos de ionização – demais tipos de ionização
	1.d- Tipos de ionização – comparativo
	1.e- Tipos de FRAGMENTAÇÃO
	1.f- Detecção
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras -digestão
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras – fosfopeptídeos
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras - Overview 
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras 
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras 
	2.a- Proteômica – Preparo de amostras - MudPIT 
	2.b- Proteômica – Abordagens Botton upe Top down
	2.c- Proteômica – Resolução e analisadores
	2.c- Proteômica – Analisadores
	2.c- Proteômica – Analisadores
	2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo)
	2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo)
	2.c- Proteômica – Analisadores
	2.c- Proteômica – Analisadores (ion trap)
	2.c- Proteômica – Analisadores 
	2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) 
	2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) 
	2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
	2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
	2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
	2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
	2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
	Slide Number 44
	2.d- Proteômica e a análise de dados
	2.d- Proteômica e a análise de dados
	Slide Number 47
	Slide Number 48
	Slide Number 49
	2.e- Proteômica quantitativa