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Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Espectrometria de massas e proteômica BCM13042 - Fundamentos de Análises de Proteínas (2011/2) Dr. Diogo Ribeiro Demartini | diogord@terra.com.br Laboratório de Proteínas Tóxicas Centro de Biotecnologia e Departamento de Biofísica - UFRGS Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1. Espectrometria de massas a) Histórico; b) Fundamentos básicos; c) Componentes e tipos de equipamentos; d) Tipos de ionização; e) Tipos de fragmentação; f) Detecção; 2. Proteômica a) Preparo de amostras (2D, 1D, GeLC, HPLC, etc...); b) Abordagens (Botton Up & Top Down, fosfo, PTM); c) Fragmentação de peptídeos; d) Proteômica quantitativa; Introdução Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.a - Histórico Prof. Charley Staats Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Medida da relação massa/carga de um íon Diferentes de outras técnicas, MS não envolve uma região específica do espectro eletromagnético; massa/carga (m/z): massa do íon / carga do íon – 1 unidade de massa atômica = 1 Da = 1/12 massa 12C. – 1 kDa = 1000 amu 1.b - Fundamentos básicos Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 0 2000 4000 6000 8000 Co un ts 2840 2845 2850 2855 Mass (m/z) Resolution = 14200 Resolution = 4500 Resolution =18100 1.b - Fundamentos básicos Prof. Charley Staats Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.c – Componentes e tipos de equipamentos IONIZAÇÃO DETECÇÃO ANÁLISE Electron Ionization (EI) Chemical Ionization (CI/APCI) Photo-ionization (APPI) Electrospray (ESI) Matrix-assisted Laser Desorption (MALDI) Field Desorption (FD) Plasma Desorption (PD) Fast atom bombardment (FAB) High-temperature Plasma (ICP Sector Mass Analyzers (Magnetic and Electrostatic) Quadrupole Analyzers Ion Traps Ion Cyclotron Resonance Time-of-Flight Adaptado de “Villanova University “ MCP Microchannel Plate Detectors http://www.rmjordan.com/jpegs/40mmmcp.jpg Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Aebersold R, Mann M. 2003. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422, 198-207. A MONTAGEM DO EQUIPAMENTO É FEITA ATRAVÉS DA COMBINAÇÃO DOS COMPONENTES 1.c – Componentes e tipos de equipamentos Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.c – Componentes e tipos de equipamentos IONIZAÇÃO DETECÇÃO ANÁLISE MALDI ESI DESI TOF Q Qq QQQ LTQ SELDI Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) The technique which we now know as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) was developed simultaneously in two laboratories in 1987. The first report of high mass ions (above m/z 10,000) was a paper presented by Koichi Tanaka of the Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) at the Second Japan-China Joint Symposium on Mass Spectrometry, held September 15-18, 1987 in Takarazuka, Japan. Using a pulsed N2 laser (337 nm) and a time-of-flight mass spectrometer equipped with a coaxial reflectron, they recorded molecular ions at m/z 34,529 from carboxypeptidase-A dissolved in a slurry of glycerol and an ultra-fine metal powder. In addition, they reported a mass spectrum of lysozyme (MW 14,307) containing multimeric ions up to the pentamer recorded at m/z 71,736. At the same time, Michael Karas and Franz Hillenkamp from the University of Muenster (Germany) had developed a matrix-assisted technique using a frequency-quadrupled (266 nm) Q- switched Nd:YAG laser to desorb intact molecular ions from proteins dissolved in matrix solution containing nicotinic acid. Their first high mass results were reported at the International Mass Spectrometry Conference (IMSC) in Bordeaux, France in August 1988, and included molecular ions for bovine serum albumin observed in their mass spectrum at m/z 66,750. Results from both of these groups were first published in 1988, followed by a number of other reports by Hillenkamp and Karas for proteins with molecular weights in excess of 100 kDa. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y; Yoshida, T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 151-153. Karas, M.; Hillenkamp, F., Anal. Chem. 60 (1988) 2299-2301 Skoog. Principles of Intrumental Analysis. 1998. 5th Ed. Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) Laser placa M A TRASFERÊNCIA DE ENERGIA ENTRE A MATRIZ E O ANALÍTO AMBOS VOOAM!! Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) http://bioms.chem.uu.nl/index.php/education/open-access-master-courses Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) Íon [M+H]+ Menos sensível a contaminantes Sensibilidade: fentomol Análise high-troughput (rápido e relativamente fácil) Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas. O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o campo eléctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos e no modo negativo, os íons são desprotonados (M + nH)n+ Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 1- formação de microgotículas; 2- evaporação do solvente (gás)- rompimento do limite de Rayleigh; 3- ionização (formas multicarregadas) – (M+nH)n+; 4- entrada no espectrômetro Modo positivo (protonados) Modo negativo (deprotonados) Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) -Automatização; -Acoplamento a sistemas cromatográficos; -Geração de íons multicarregados; Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Electron Ionization (EI) – bombardeamento; fragmentação excessiva; Chemical Ionization (CI/APCI) – tranferência de prótons através do uso de gás (CH4) Photo-ionization (APPI) – ioniza o que ESI não consegue. Desorption-electrospray ionization (DESI) – combinaçãod MALDI e ESI (incidência de laser e spray, em uma matriz sobre uma placa NÃO inerte) Fast atom bombardment (FAB)- moléculas lábeis. High-temperature Plasma (ICP) – fluxos na ordem de 50 mL/min!!!! 1.d- Tipos de ionização – demais tipos de ionização Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.d- Tipos de ionização – comparativo http://www.chem.agilent.com/en-US Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Por que fragmentar? Como fragmentar? Como analisar? Como DETECAR? 1.e- Tipos de FRAGMENTAÇÃO CID: COLLISION INDUCED DISSOCIATION – COLISÃO FÍSICA ENTRE O ÍON PRECURSOR E UM GÁS (Ar, He, N2); EDT: ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION – REAGENTE ANIÔNICO TRANSFERE ENERGIA PARA O PEPTÍDEO POSITIVO;ECD: ELECTRON CAPTURE DISSOCIATION – CONVERSÃO DO PEPTÍDEO IONIZADO PARA UMA FORMA RADICALAR INFRARED MULTHIPHOTON DISSOCIATION – ABSORÇÃO DE FÓTONS Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1.f- Detecção MCP: U$ 20.000,00 Do tamanho de uma moeda de UM REAL!!! Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Tecido de origem Tratamento necessário à resposta biológica; Remoção de contaminantes; Digestão das proteínas a peptídeos; 2.a- Proteômica – Preparo de amostras Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.a- Proteômica – Preparo de amostras -digestão “ Reduzir” as proteínas a peptídeos; Expor ao máximo os sítios de clivagem (redução com DTT seguida de alquilação) Digestão por enzimas (geralmente tripsina, alta especificidae (Arg/Lis) O PREPARO DAS AMOSTRAS É PONTO CRÍTICO DE QUALQUER EXPERIMENTO PROTEÔMICO Anal Bioanal Chem (2007) 389:991–1002 Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Remoção de contaminantes Detergentes, sais, açúcares, etc... O espectrômetro NÃO sabe que estamos trabalhando com peptídeos Enriquecimento de peptídeos de interesse, modificados ou não Enriquecimento de peptídeos fosforilados, atrvés do uso de cromatografias de afinidade por metal imobilizao (Fe, Ti, Ga); Pré-fracionamento das amostras para análise Eletroforese uni ou bi-dimensional, cromatrografias diversas. Associação de cromatrografias de troca catiônica forte, com fase reversa: MuDPIT 2.a- Proteômica – Preparo de amostras Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.a- Proteômica – Preparo de amostras – fosfopeptídeos Proteomics 2009, 9, 1451–1468 MOMENTO BIOQUÍMICO Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.a- Proteômica – Preparo de amostras - Overview Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Gel-1D Gel-2D Cromatografia multidimensional 2.a- Proteômica – Preparo de amostras Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1D 2D 2.a- Proteômica – Preparo de amostras Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini m M N aC l 1000 500 100 A 2 80 /m L 100 50 0 % A CN 100 50 0 % A CN 100 50 0 % A CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2.a- Proteômica – Preparo de amostras - MudPIT Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.b- Proteômica – Abordagens Botton upe Top down http://en.wikipedia.org/wiki/Bottom-up_proteomics Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas com base no tamanho dos peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina, comparando-se o espectro de massa real com o teórico, obtido a partir dos bancos de dados de proteínas. 1529 1 478 1529.7 0.1 164 1529.73 0.01 25 1529.734 0.001 4 1529.7348 0.0001 2 Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos trípticos. 2.c- Proteômica – Resolução e analisadores Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 1 – MS-Setor magnético: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos íons 2.c- Proteômica – Analisadores Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2- Quadrupolo: quatro eletrodos longos ou não, com cargas opostas e paralelas 2.c- Proteômica – Analisadores + + - - Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo) Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo) Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores 3- Ion trap: literalmente, armadilha de íons. Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores (ion trap) - Transmissão em feixes; - Armazenamento temporário dos íons; Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores TOF TOF/TOF TEMPO DE VÔO DEPENDE DA ENERGIA CINÉTICA D eV mt . 2 2 1 = 3- TOF: time of flight Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) Rápido Fácil de usar Resolucão moderada Moléculas grandes ( 70 kDa…) Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos PEPTÍDEO PEPTÍDEO PROTONADO Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido. Sequenciamento de novo de proteínas Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y. Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Espectro MS/MS do peptídeo tríptico GLSDGEWQQVLNVWGK. AA Codes Mono. AA Codes Mono. Gly G 57.021464 Asp D 115.02694 Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858 Ser S 87.032029 Lys K 128.09496 Pro P 97.052764 Glu E 129.04259 Val V 99.068414 Met M 131.04048 Thr T 101.04768 His H 137.05891 Cys C 103.00919 Phe F 147.06841 Leu L 113.08406 Arg R 156.10111 Ile I 113.08406 CMC 161.01467 Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333 - - - Trp W 186.07931 Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.d- Proteômica e a análise de dados Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Comparação de massas reais obtidas no equipamento, com massas teoricas; Rastreamento contra bancos de dados; MASCOT: socore SEQUEST: Xcorr Escores diferentes para um “hit”; Número de peptídeos únicos que identificam uma proteína 2.d- Proteômica e a análise de dados Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini QUANTIFICATION BASED ON NUMBER OF ACQUIRED MS2 SPECTRA MS m/z in te ns ity Nano-LC Time (min) in te ns ity m/z MS2 Spectra 1 Peptide 1 Spectra 2 Peptide 2 Spectra 3 Peptide 3 Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Nano-LC Time (min) in te ns ity 5-10 scans/second 60 min acquisition time 36,000 acquiredspectra/hour MS MS2 Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini Spectrum 1 Peptide 1 Spectrum 2 Peptide 2 Spectrum 3 Peptide 3 MELSPRAAEL TNLFESRIRN FYANFQVDEI GRVVSVGDGI AQVYGLNEIQ AGEMVLFANG VKGMALNLEN ENVGIVVFGG DTAIKEGDLV KRTGSIVDVP AGKAMLGRVV DAMGVPIDGR GALSDHEQRR VEVKAPGILE RKSVHEPMQT GLKAVDSLVP IGRGQRELLI GDRQTGKTTI AIDTILNQKQ INSRATSESE TMYCVYVAIG QKRSTVGQLI QTLEEANALE YSILVAATAS DPAPLQFLAP YSGCAMGEYF RDNGMHALII YDDLSKQAVA YRQMSLLLRR PPGREAFPGD VFYLHSRLLE RAAKRSDQTG AGSLTALPVI ETQAGDVSAY IPTNVISITD GQICLETELF YRGIRPAINV GLSVSRVGSA AQLKAMKQVC GSSKLELAQY REVAAFAQFG SDLDAATQAL LNRGARLTEV PKQPQYAPLP IEKQILVIYA AVNGFCDRMP LDRISQYEKA IPNSVKPELL QALKGGLTNE RKMEPDAFLK ERALALI ATPase alpha subunit : gi 140325074 AAELTNLFES HIGH CONFIDENCE MATHING CRITERIA ATPase alpha subunit : gi 140325074 - PROTEIN PROBABILITY: >95% - Minimun of 2 unique non-overlapping peptides - Xcorr: +1; 1.5 +2: 2.0 +3: 2.5 DNGMHALIIYDDLSKQAVAY TGSIVDVPAGKAMLG SEQUEST algorithms ScaffoldTM algorithms MS2 Espectrometria de massas e proteômica Diogo Ribeiro Demartini 2.e- Proteômica quantitativa Label-free: livre de marcação Labelled: iTRAQ marcação isotópica (18O) Slide Number 1 Introdução 1.a - Histórico 1.b - Fundamentos básicos 1.b - Fundamentos básicos 1.c – Componentes e tipos de equipamentos 1.c – Componentes e tipos de equipamentos 1.c – Componentes e tipos de equipamentos 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção) 1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa) 1.d- Tipos de ionização – demais tipos de ionização 1.d- Tipos de ionização – comparativo 1.e- Tipos de FRAGMENTAÇÃO 1.f- Detecção 2.a- Proteômica – Preparo de amostras 2.a- Proteômica – Preparo de amostras -digestão 2.a- Proteômica – Preparo de amostras 2.a- Proteômica – Preparo de amostras – fosfopeptídeos 2.a- Proteômica – Preparo de amostras - Overview 2.a- Proteômica – Preparo de amostras 2.a- Proteômica – Preparo de amostras 2.a- Proteômica – Preparo de amostras - MudPIT 2.b- Proteômica – Abordagens Botton upe Top down 2.c- Proteômica – Resolução e analisadores 2.c- Proteômica – Analisadores 2.c- Proteômica – Analisadores 2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo) 2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo) 2.c- Proteômica – Analisadores 2.c- Proteômica – Analisadores (ion trap) 2.c- Proteômica – Analisadores 2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) 2.c- Proteômica – Analisadores (TOF) 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos 2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos Slide Number 44 2.d- Proteômica e a análise de dados 2.d- Proteômica e a análise de dados Slide Number 47 Slide Number 48 Slide Number 49 2.e- Proteômica quantitativa
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