RELATÓRIO AULA V

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UNIVERSIDADE DA REGIÃO DA CAMPANHA – URCAMP
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CAMPUS BAGÉ
CURSO FARMÁCIA GENERALISTA
IMONOLOGIA GERAL
		
								
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
QUANTIFICAÇÃO DE IGA-IGM-IGG
	
MAUREN DE LIMA VAZ
LUCIANA SOUZA
	
BAGÉ, 2017
Sumário
21 – Introdução	�
42 – Objetivos: Quantificação de IGG-IGM-IGA	�
53 – Materiais	�
54 – Metodologia	�
85 – Resultados e Discussões:	�
86 – Referências:	�
�
1 – Introdução
		
O sistema imunológico é dividido didaticamente em inespecífico, representado pelos sistemas de fagócitos e Complemento (C), e o específico, representado pela imunidade mediada por linfócitos B (humoral) e linfócitos T (celular). Entretanto, o que ocorre é uma ampla interação entre os diversos componentes da resposta imunológica, que permite prevenir e debelar as infecções, de forma mais eficiente. Aqui serão enfatizadas as provas laboratoriais mais utilizadas na avaliação imunológica de pacientes com infecções de repetição.
As deficiências predominantemente humorais representam cerca de 60% das imunodeficiências primárias, em seguida temos as deficiências celulares e de fagócitos responsáveis por cerca de 20 e 18%, respectivamente. As mais raras são as do Sistema Complemento (C).
A avaliação da competência imunológica geralmente requer laboratório especializado e o custo financeiro é elevado. Em se tratando de pacientes pediátricos, outro aspecto a ser considerado é a escolha de métodos passíveis de serem executados com a menor quantidade possível de sangue. Por estes motivos, na suspeita de uma imunodeficiência, deve-se solicitar os exames que vão dar mais informações de acordo com a história clínica do paciente. Por exemplo, infecções de repeticão por bactérias extra-celulares sugerem deficiência predominantemente de anticorpos ou deficiência de proteínas do sistema Complemento. Por outro lado, infecções por bactérias intra-celulares e germes oportunistas sugerem deficiência da imunidade celular. Nas deficiências de fagócitos é comum história de abscessos de repetição tendo, principalmente, o Staphilococcus aureus como agente etiológico.
Dosagem das imunoglobulinas séricas (IgA, IgM, IgG) é o primeiro exame a ser solicitado na suspeita de Deficiência de Anticorpo. Atualmente, este exame é realizado por um grande número de laboratórios em nosso meio. Por serem proteínas que existem em grande quantidade no nosso organismo, podem ser utilizados os métodos de imunodifusão radial ou nefelometria. Entretanto, alguns serviços, utilizam um método mais sensível como o imunoenzimático (ELISA). A sensibilidade e a especificidade dos três métodos são adequadas. Deve-se sempre comparar os resultados encontrados com valores de normalidade para mesma faixa etária.
A IgG é a imunoglobulina de maior concentração plasmática, correspondendo a cerca de 80% das imunoglobulinas séricas sendo a classe principal das defesas sorológicas do nosso organismo. A meia-vida plasmática da IgG é de 23 dias.
A IgM é a que alcança valores de adulto mais precocemente, e a IgA mais tardiamente. Níveis de IgM acima de 20 mg/dl em sangue de cordão são sugestivos de infecção intra-uterina. É a classe de anticorpo que predomina na resposta imune primária. A IgM tem potente ação ativadora do C, contudo por causa do seu tamanho (pentâmero) fica restrita ao compartimento intravascular.
Nos dois primeiros anos de vida, os níveis de IgA são, geralmente, bem reduzidos. Valores de adultos são somente alcançados por volta dos 8 anos de idade. Na deficiência de IgA, a concentração sérica desta imunoglobulina é sempre menor que 7 mg/dl e o diagnóstico só deve ser confirmado após os 4 anos de idade.
De acordo com os níveis de imunoglobulinas séricas, podemos formular as seguintes hipóteses diagnósticas:
a) IgM e IgG normais e IgA diminuída = deficiência de IgA
b) IgG e IgA normais e IgM diminuída = deficiência de IgM
c) IgG e IgA diminuídas e IgM elevada = síndrome de hiper-IgM
d) IgM, IgG e IgA diminuídas = hipogamaglobulinemia (agamaglobulinemia, hipogamaglobulinemia transitória da infância ou imunodeficiência comum variável).
Para quantificar anticorpos possuímos inúmeras formas no meio laboratorial, no presente relatório falaremos sobre a Imunodifusão Radial, trata-se de uma técnica de difusão de antígeno e anticorpo seguida de precipitação. Ao se adicionar um antígeno solúvel com um anticorpo também solúvel forma-se um agregado antígeno-anticorpo que é insolúvel e sofre precipitação. 
Método realizado em gel de agarose com anti-soros específicos já incorporados ao gel. As amostras são aplicadas em “poços” circulares já feitos no gel. À medida que a difusão ocorre, a reação antígeno-anticorpo forma anéis de precipitação e a concentração de antígeno são proporcionais ao raio do anel de precipitação. Ao medir o diâmetro do círculo de precipitado, utiliza-se com uma tabela contendo os valores de diâmetro relacionados com a concentração de antígeno.
 A técnica permite a comparação simultânea, por exemplo, de vários sistemas antigênicos contra o mesmo sistema de anticorpo de reatividade e especificidade conhecidas, desde que a interação antígeno-anticorpo tenha atingido a zona de equivalência e que esteja em quantidade suficiente para formar turvação ou precipitado visível.
Esta técnica é muito utilizada na pesquisa e diagnóstico de determinadas doenças como a cisticercose. 
As principais desvantagens da imunodifusão radial simples são: 
a)	Método semiquantitativo, 
b)	ser de baixa sensibilidade e;
c)	requer o uso de extratos antigênicos em concentração elevada, da ordem de mg/mL.
Existe uma relação linear entre o quadrado do diâmetro do halo e a concentração do antígeno.
Com o uso de antígeno de concentrações conhecidas pode-se fazer uma curva padrão, permitindo determinar a concentração em amostras desconhecidas. É possível inverter o teste, incorporando antígeno na agarose e colocando-se soro nos orifícios.
	
2 – Objetivos: Quantificação de IGG-IGM-IGA
O objetivo da aula prática foi quantificar IGA-IGG-IGM utilizado para tanto o método de Imuno difusão radial, que consiste em um Agar que nada mais é que um precipitado de algas marinhas em que o antígeno difundido nele ou o ante anticorpo contra determinado antígeno se espalha por difusão proporcionalmente. Quanto maior a distancia menos a concentração de anticorpo.
3 – Materiais
1 Centrifuga;
1Luva de látex;
1 Agulhas;
1 Seringas;
1 Garrote;
2 Tubos seco para coleta de sangue;
1 Agar;
1 Pipeta automática de 20µl
Ponteiras amarelas.
4 – Metodologia
Foi realizada a coleta de sangue de dois colegas conforme instrução do professor, cuidando sempre para que o sangue não coagulasse.
Após colocação de luvas de látex, foi garroteado o braço do colega, sentido através do toque onde está à veia, verificado qual o trajeto da mesma, e feito à assepsia do local.
Então foi retirada a seringa da embalagem com cuidado evitando assim a contaminação e encaixada a agulha que foi introduzida com cuidado na veia para retirada do material biológico, após foi retirada a agulha da seringa e descartada no DESCARPAC, o material biológico foi colocado com cuidado no tubo já devidamente identificado sempre pela borda do tubo e levemente homogeneizado. 
Somente após este procedimento nos dois colegas que os tubos foram para centrífuga para separação do plasma da papa de leucócitos. Como mostamos abaixo:
Para o procedimento de quantificação de anticorpos utilizamos um Agar e com auxílio da pipeta volumétrica foi retirado do tubo 20µl do plasma, e colocado cuidadosamente em cada orifício do Agar uma gota deste plasma, sendo que cada grupo ficou com um orifício onde determina o IGG, um do IGM e outro do IGA. Utilizamos duas placas devidamente marcada, onde a placa dois e os orifícios 1, 5 e 9 eram os que mostravam a concentração sérica dos anticorpos parao determinado trabalho.
Após todos os grupos terem adicionado o material nas placas adicionou-se algodão molhado no centro das placas para manter a umidade do Agar e as mesmas foram para um isopor com gases umedecido permanecendo por 24 horas em temperatura ambiente. 
Somente no outro dia que podemos observar a precipitação do Agar conforme foto abaixo.
Pode-se observar então que na região que marca a concentração sérica de IGM possuímos 5mm de precipitação, onde marca IGG temos 9mm de precipitação e onde temos IGA possuímos 25mm de precipitação.
Guiando-se pela tabela de referencia temos:
IGM 83 visto que temos precipitação de 5mm;
		
		
IGG 2970 visto que temos 9 mm de precipitação;
Os resultados de IgG obtidos do paciente são comparados aos valores de referência para a idade e para a população em estudo, além de levar em conta a metodologia utilizada. Pode estar aumentada em infecções, mieloma IGG, doenças autoimunes, doença hepática crônica, artrite reumatóide, doenças parasitárias e sarcoidose, entre outras. Pode estar diminuida na imunodeficiência congênita ou adquirida, síndromes perdedoras de proteínas, gestação, Macroglobulinemia de Waldestrom e mieloma não secretor de IgG. Quando aumentada no liquor isoladamente, denota a existência de processo inflamatório/infeccioso no SNC, ou ainda a presença de doenças desmielinizantes ou neoplásicas, processos que podem ser secundários ou primários, que serão esclarecidos com a correlação com a dosagem sérica.
IGA possuímos 25mm de precipitação, seguindo a tabela de referencia não possuímos esta medida o que impossibilita conferirmos a quantidade de anticorpos IGA, visto que não temos os valores de referência. Portanto, valores estão bem acima do esperado. Impossibilitando a criação do gráfico.
		Percebendo-se os valores de referência percebemos que está elevada a quantidade de anticorpos IGG na paciente. IGM está dentro da normalidade.
5 – Resultados e Discussões:
Como verificado no Agar observamos a precipitação, que nos levou a definição de quantidade de anticorpos IGG e IGM do paciente. Não soubemos identificar IGA pois tivemos uma precipitação maior do que temos acesso na tabela de referência, com posse desse resultado podemos supor que a o aumento de IGG, que pode estar relacionada a vários fatores, e aconselha-se uma avaliação mais detalhada do caso.
6 – Referências:
http://www.ciencianews.com.br/aulavirt/metodos.pdf
http://www.drashirleydecampos.com.br/noticias/14483
BELLANTI, J.A.- Clinical Immunology. Pediatr. Clin. North Am., 41(4), 1994.
FLEISHER, T.A & TOMAR, R.H. - Introduction to Diagnostic Laboratory immunology. JAMA, 278(22):1823-1834, 1997.
https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/moda/metodos-qualitativos-imunodifusao-dupla-radial/33163
http://www.alvaro.com.br/laboratorio/menu-exames/IGG
Tubo devidamente centrifugado.
�PAGE \* MERGEFORMAT�9�
_1573247889.xls
Gráf1
		4		32
		4.1		36
		4.2		41
		4.3		46
		4.4		51
		4.5		56
		4.6		61
		4.7		66
		4.8		61
		4.9		77
		5		83
D
IGM
Plan1
		D		IGG		IGM		IGA
		4		226		32		44
		4.1		260		36		51
		4.2		295		41		58
		4.3		331		46		66
		4.4		357		51		73
		4.5		405		56		81
		4.6		443		61		89
		4.7		483		66		98
		4.8		523		61		106
		4.9		564		77		114
		5		606		83		123
		5.1		648		88		132
		5.2		692		94		141
		5.3		736		100		150
		5.4		781		106		160
		5.5		1827		112		169
		5.6		874		119		179
		5.7		922		125		189
		5.8		970		131		199
		5.9		1020		138		210
		6		1070		145		220
		6.1		1121		152		231
		6.2		1173		159		242
		6.3		1226		166		253
		6.4		1280		173		264
		6.5		1334		180		275
		6.6
		6.7
		6.8
		6.9
		7
		7.1
		7.2
		7.3
		7.4
		7.5
		7.6
		7.7
		7.8
		7.9
		8		2253		303		467
		8.1		2321		312		481
		8.2		2389		321		486
		8.3		2459		331		510
		8.4		2530		340		525
		8.5		2601		350		540
		8.6		2673		359		555
		8.7		2746		369		570
		8.8		2820		379		586
		8.9		2895		389		601
		9		2970		399		617
Plan1
		
Plan2
		
D
IGM
Plan3
		
		
_1573247123.xls
Gráf1
		8		2253
		8.1		2321
		8.2		2389
		8.3		2459
		8.4		2530
		8.5		2601
		8.6		2673
		8.7		2746
		8.8		2820
		8.9		2895
		9		2970
Plan1
		D		IGG		IGM		IGA
		4		226		32		44
		4.1		260		36		51
		4.2		295		41		58
		4.3		331		46		66
		4.4		357		51		73
		4.5		405		56		81
		4.6		443		61		89
		4.7		483		66		98
		4.8		523		61		106
		4.9		564		77		114
		5		606		83		123
		5.1		648		88		132
		5.2		692		94		141
		5.3		736		100		150
		5.4		781		106		160
		5.5		1827		112		169
		5.6		874		119		179
		5.7		922		125		189
		5.8		970		131		199
		5.9		1020		138		210
		6		1070		145		220
		6.1		1121		152		231
		6.2		1173		159		242
		6.3		1226		166		253
		6.4		1280		173		264
		6.5		1334		180		275
		6.6
		6.7
		6.8
		6.9
		7
		7.1
		7.2
		7.3
		7.4
		7.5
		7.6
		7.7
		7.8
		7.9
		8		2253		303		467
		8.1		2321		312		481
		8.2		2389		321		486
		8.3		2459		331		510
		8.4		2530		340		525
		8.5		2601		350		540
		8.6		2673		359		555
		8.7		2746		369		570
		8.8		2820		379		586
		8.9		2895		389		601
		9		2970		399		617
Plan1
		
D
IGG
Plan2
		
Plan3