Aulas Práticas de Biologia Celular

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INTRODUÇÃO
O estudo da célula teve início com a observação de diferentes formas de vida (animais e vegetais) em microscópios rudimentares a partir do século XVII. Entretanto, a Teoria Celular, que estabeleceu que todos os seres vivos são formados de células e/ou produtos delas, só foi proposta no século XIX. Nas últimas décadas, a Biologia Celular se tornou um campo do conhecimento bastante fascinante devido ao grande avanço das áreas de Bioquímica e Biologia Molecular, que vieram agregar novos conhecimentos à estrutura e funcionamento da célula.
Sendo a célula a unidade de qualquer ser vivo, o entendimento de sua morfologia e de seus processos biológicos propicia a compreensão da sua organização em tecidos e órgãos (Histologia e Anatomia, respectivamente) e das funções emergentes que surgem nos níveis de organização mais elevados (Fisiologia). 
Com essa apostila de aulas práticas de Biologia Celular nós pretendemos iniciar o aluno na observação da morfologia da célula de maneira a relacioná-la com seus aspectos funcionais. Com esse intuito, nós utilizaremos nas aulas práticas material a fresco (culturas de bactérias, suspensões de células eucariontes e material coletado na natureza) e fixado (lâminas permanentes) para que o aluno possa examinar os diferentes tipos celulares e suas estruturas em nível do microscópio fotônico. Nós utilizaremos ainda uma série de fotografias obtidas em microscópio eletrônico de transmissão (eletromicrografias) para que o aluno se familiarize com a ultraestrutura celular. 
Os procedimentos utilizados nas aulas práticas foram adaptados das apostilas de Biologia Celular da UNESP, UFV, UEL e USP.
	
PRÁTICA 1. USO DO MICROSCÓPIO FOTÔNICO
Objetivos da aula:
Identificar e manusear corretamente as peças do microscópio;
Determinar o aumento fornecido pelos diferentes jogos objetiva-ocular;
Iluminar adequadamente diferentes preparações.
Partes Mecânicas do Microscópio Fotônico
PÉ – é a base do aparelho, suportando todas demais peças do microscópio.
BRAÇO – prende-se ao pé e suporta o canhão, a platina, o condensador e a fonte luminosa. 
CANHÃO - é o tubo onde se dispõem as partes óticas de ampliação.
REVÓLVER - é uma peça giratória onde se conectam as objetivas e por onde se faz a mudança instantânea das mesmas.	
PLATINA - é a plataforma onde se coloca a preparação para exame, possuindo uma abertura central por onde há passagem de luz proveniente da fonte. 
“CHARRIOT” - é um dispositivo preso à platina, dotado de movimento ântero-posterior e lateral, destinado a movimentar a preparação.
PARAFUSO MACROMÉTRICO - é um dispositivo destinado a dar grandes e rápidos deslocamentos verticais ao canhão ou à platina (focalização grosseira).
PARAFUSO MICROMÉTRICO - é um dispositivo destinado a dar pequenos e lentos deslocamentos verticais ao canhão ou à platina (focalização fina).
Sistema de Iluminação
	
FONTE DE LUZ DIRETA - preso à parte inferior do braço, reflete ou projeta a luz para a parte inferior do condensador.
DIAFRAGMA OU ÍRIS - colocado sob o condensador, restringe o diâmetro do feixe luminoso.
Sistema Óptico
LENTE DO CONDENSADOR - é um sistema de captação de luz.
LENTES OBJETIVAS – resolução da imagem 
LENTES OCULARES – ampliação da imagem
Identifique as partes de um Microscópio Fotônico no esquema abaixo (Fonte: Junqueira & Carneiro, 1997).
Procedimentos para Focalização
Primeiramente, verifique se a platina está completamente abaixada;
Verifique também se a objetiva de menor aumento está devidamente encaixada, caso contrário, encaixe-a girando o revólver;
Coloque a preparação para exame (lâmina) sobre a platina, prendendo-a com a presilha do “charriot”, de maneira que a lamínula fique sempre voltada para cima;
Centralize o material a ser observado, utilizando os parafusos do “charriot”;
Levante o condensador completamente;
Levante a platina completamente, utilizando para isso o parafuso macrométrico;
Acenda a luz do microscópio e certifique-se de que o diafragma está aberto;
Olhe através da ocular e vá abaixando a platina lentamente, usando para isso o parafuso macrométrico, até a altura em que você consiga observar o material;
Faça o ajuste fino do foco, utilizando para isso o parafuso micrométrico;
Percorra o campo de observação com o auxílio dos parafusos do “charriot”.
Encaixe as demais objetivas, respeitando-se sempre a ordem crescente de seus aumentos, mantendo sempre o material a ser observado no centro do campo de observação;
Ajuste o foco, após a troca da objetiva, somente com o parafuso micrométrico.
PRÁTICA 2. CÉLULAS PROCARIÓTICAS E EUCARIÓTICAS
Objetivos da aula:
1. Observar diferentes tipos de células;
Comparar tamanhos e formas de diferentes tipos celulares;
Diferenciar a organização dos diferentes tipos celulares.
Células Procarióticas
Coloque sobre uma lâmina uma gota de bactérias não patogênicas, fixe-as passando a lâmina sobre a chama de uma lamparina e core-as, por 5 minutos, com Violeta de Genciana Fenicada. Lave a lâmina rapidamente em água e examine ao microscópio. Desenhe.
2. Células Eucarióticas
 Levedura 
 Faça uma cultura líquida de levedura, dissolvendo uma porção de fermento biológico fresco ou desidratado em um pouco de água destilada. Adicione açúcar comum e deixe descansar por 15 a 20 minutos. Pingue uma gota da suspensão sobre uma lâmina e cubra com lamínula. Retire o excesso de líquido com papel de filtro. Examine ao microscópio e desenhe.
 Mucosa Bucal 
 Raspe a mucosa bucal, com o auxílio de um palito de sorvete, e coloque o material coletado sobre uma gota de soro fisiológico (NaCl 0,9%) entre lâmina e lamínula. Core com uma gota de azul de metileno (corante vital). Retire o excesso de líquido com papel de filtro. Examine ao microscópio e desenhe.
Epiderme de Cebola 
 Retire, com o auxílio de uma pinça, uma fina película da epiderme do bulbo de cebola, coloque-a sobre uma gota de água entre lâmina e lamínula. Retire o excesso de líquido com papel de filtro. Examine ao microscópio e desenhe.
PRÁTICA 3. MEMBRANA PLASMÁTICA
Objetivos da aula:
 1. Mostrar a estrutura e organização dos principais componentes das membranas biológicas - os lipídeos e as proteínas – com enfoque na Membrana Plasmática;
Identificar e localizar o glicocálice da Membrana Plasmática;
Micrografia eletrônica de transmissão da Membrana Plasmática (Fonte: Universidade Federal do Paraná).
Esquema da estrutura molecular da Membrana Plasmática (Fonte: Lodish et al., 2000).
Micrografia eletrônica de transmissão do Glicocálice da Membrana Plasmática de células embrionárias de rata (Fonte: Junqueira e Salles, 1975).
PRÁTICA 4. PERMEABILIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA
Objetivos da aula:
Descrever o efeito de solventes orgânicos sobre a permeabilidade das membranas celulares.
Explicar a atuação do calor sobre a estrutura das membranas e sua seletividade;
Relacionar as mudanças de forma das células com a concentração do meio extracelular e o fenômeno de osmose.
	
 Efeito de solvente orgânico 
Enumere dois tubos de ensaio;
Faça as adições descritas no quadro seguinte, na sequência indicada.
	TUBO
	ÁGUA DESTILADA
	ACETONA 50%
	BETERRABA
	1
	5 ml
	------
	3 cubos
	2
	------
	5 ml
	3 cubos
Observe e explique.
Impermeabilidade 
Enumere dois tubos de ensaio e faça as adições descritas no quadro abaixo, agitando após cada adição. Incube o tubo 2 em banho-maria a 50(C, por 10 minutos. Coloque, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, uma gota da suspensão de levedura do tubo 1 em uma das extremidades de uma lâmina e do tubo 2 na outra extremidade. Observe ao microscópio e desenhe. Explique o que vocêobservou.
	TUBOS
	SUSPENSÃO DE LEVEDO
	VERMELHO CONGO (0,2 %)
	ÁGUA
	1
	2 ml
	3 ml
	----
	2
	2 ml
	3 ml
	----
 Osmose 
Coloque uma gota de água em uma das extremidades de uma lâmina e uma gota de solução salina (NaCl) a 2% na outra extremidade. Retire, com o auxílio de uma pinça, dois fragmentos da epiderme inferior de cebola e coloque-os sobre as gotas e cubra com lamínulas. Observe ao microscópio e desenhe. Explique o que você observou.
PRÁTICA 5. CITOESQUELETO
Objetivos da aula: 
Identificar as diferentes estruturas celulares organizadas pelos elementos do citoesqueleto, indicando sua função;
Reconhecer os elementos do citoesqueleto envolvidos em movimentos celulares;
Caracterizar a organização peculiar de elementos do citoesqueleto na célula muscular.
 Centríolo 
Micrografia eletrônica de transmissão de um Centríolo (Fonte: Apostila UNESP).
Fuso Mitótico 
Micrografia eletrônica de transmissão de uma célula em divisão (Fonte: Lodish et al., 2000)
Transporte Intracelular 
Retire, com o auxílio de uma pinça, alguns pêlos estaminais da flor de Tradescantia e deposite-os sobre uma gota de água. Cubra com uma lamínula e observe ao microscópio. Desenhe
 Cílios 
Observação de lâmina permanente de traquéia de rato.
Micrografia eletrônica de transmissão de cílios. (Fonte: Universidade Federal do Paraná).
 Sarcômero
Micrografia eletrônica de transmissão de músculo esquelético de macaco (Fonte: Junqueira & Salles, 1975).
 Microvilosidades
Micrografia eletrônica de transmissão de microvilosidades intestinais (Fonte: Sobotta, 1997)
PRÁTICA 6. ESPECIALIZAÇÕES DA MEMBRANA PLASMÁTICA
Objetivos da aula:
Identificar e classificar as diferentes especializações da membrana;
Relacionar as especializações da membrana com a função celular.
 Microvilosidades 
Observação da borda em escova em lâmina permanente de intestino delgado de rato.
Micrografia eletrônica de transmissão da parte apical de células do duodeno (Fonte: Apostila da UNESP).
	
 Complexo Juncional 
Micrografia eletrônica de transmissão do complexo juncional entre duas células epiteliais do intestino grosso (Fonte: Junqueira & Carneiro, 1997).
 Desmossomos 
Observação de estruturas de adesão da camada espinhosa em lâmina permanente de pele grossa da pata de rato.
Micrografia eletrônica de transmissão de desmossomos de pele de peixe, (A). Detalhe de um desmossomo de células epidérmicas, (B) (Fonte: Junqueira & Salles, 1975; Alberts et al., 1994).
 A							 B
Micrografia eletrônica de transmissão de um capilar sangüíneo (Fonte: Apostila UNESP).
		
 Hemidesmossomos 
Micrografia eletrônica de transmissão de hemidesmossomos (Fonte: Apostila UNESP).
Junções Comunicantes 
Esquema das junções tipo Fenda -“Gap” - (Fonte: Junqueira & Carneiro, 1999).
PRÁTICA 7. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
Objetivos da aula:
Apresentar a localização e organização estrutural do retículo Endoplasmático Granular e Liso; 
Estabelecer relações espaciais entre esse compartimento celular e as demais organelas.
Retículo Endoplasmático Rugoso 
Observação de lâmina permanente de pâncreas de rato.
Micrografia eletrônica de transmissão de retículo endoplasmático granular (Fonte: Universidade Federal do Paraná).
	 
 Retículo Endoplasmático Liso 
Micrografia eletrônica de transmissão de retículo endoplasmático liso de célula da supra renal humana, (A). Relação retículo endoplasmático granular e liso de célula do fígado de sapo, (B) (Fonte: Comarck, 1996; Junqueira & Salles, 1975).
A				 B
	
PRÁTICA 8. COMPLEXO DE GOLGI
Objetivos da aula:
Apresentar a localização e organização estrutural do Complexo de Golgi;
Estabelecer relações espaciais entre esse compartimento celular e as demais organelas.
Observação de lâmina permanente de epidídimo de rato. 
Micrografia eletrônica de transmissão do Complexo de Golgi. (Fonte: Universidade Federal do Paraná).
Esquema da via de biossíntese e transporte de proteínas no Retículo Endoplasmático e Complexo de Golgi (Fonte: Junqueira & Carneiro, 1999).
	 
PRÁTICA 9. CÉLULAS SECRETORAS
Objetivos da aula:
 Compreender a organização das vesículas de secreção, relacionando-os à função celular;
1. Vesículas 
Glicoproteína 
Observação de lâmina permanente do epitélio de revestimento do intestino de rato. 
Micrografia eletrônica de transmissão de uma célula caliciforme (Fonte: Gartner & Hiatt, 1997).
 Zimógeno 
Observação de lâmina permanente de pâncreas endócrino de rato. 
Micrografia eletrônica de transmissão de célula acinosa do pâncreas (Fonte: Apostila UNESP).
PRÁTICA 10. DIGESTÃO INTRACELULAR
Objetivos da aula:
Apresentar a localização e organização estrutural do Lisossomo;
Estabelecer relações espaciais entre esse compartimento celular e as demais organelas;
Diferenciar as vias de degradação nos lisossomos, reconhecendo todos compartimentos celulares envolvidos nesse processo. 
 Lisossomos
Observação de lâmina permanente de baço de rato.
Micrografia eletrônica de transmissão de célula do córtex da adrenal de camundongo (Fonte: Junqueira & Salles, 1975).
Micrografia eletrônica de transmissão de hepatócito de rato, autofagossomo (A). Micrografia eletrônica de transmissão de célula epitelial do timo de rato, heterofagossomo (B) (Fonte: Sobotta, 1997).
 A					 B
Esquema das vias de degradação nos Lisossomos (Fonte: Sobotta, 1997).
PRÁTICA 11. PEROXISSOMOS 
Objetivos da aula:
Apresentar a localização e organização estrutural do Peroxissomo;
Estabelecer relações espaciais entre esse compartimento celular e as demais organelas;
Promover a degradação da água oxigenada por catálise inorgânica e enzimática (atividade da CATALASE);
Identificar a ocorrência da CATALASE em célula animal e vegetal.
Micrografia eletrônica de transmissão de Peroxissomos (Fonte: Apostila da UNESP).
Atividade da CATALASE sobre a água oxigenada.
Leia todo o roteiro e, antes de executar o procedimento, complete a coluna referente ao conteúdo dos tubos, no quadro seguinte. A coluna RESULTADOS deverá ser preenchida à medida que cada passo for desenvolvido.
	
TUBO 
	
CONTEÚDO
	
RESULTADOS
	1
	
	
	2
	
	
	3
	
	
	4
	
	
	5
	
	
	6
	
	
	7
	
	
	8
	
	
	9
	
	
	10
	
	
Numere 10 tubos de ensaios de 1 a 10;
Coloque 2 ml de água destilada nos tubos 1 e 2 e 2 ml de água oxigenada em todos os demais tubos;
Acrescente aos tubos 1, 2 e 3 uma pequena quantidade (a que couber na ponta de um palito) de dióxido de manganês (Mn02);
Ferva o material do tubo 2 por 3 minutos;
Aguarde até que o conteúdo do tubo 2 atinja a temperatura ambiente e que o Mn02 sedimente;
Retire o excesso de água do tubo 2 com o auxílio de uma pipeta de Pasteur;
Acrescente, ao tubo 2, 2 ml de água oxigenada.
O que você pode concluir pela comparação entre os resultados dos tubos 1 e 3?
Adicione uma pequena quantidade de areia ao tubo 4;
Coloque um cubo de batata no tubo 5;
Coloque um cubo de batata em um tubo de ensaio (extra) com água e deixe ferver por 5 minutos;
Coloque um cubo de batata em um grau, com uma pequena quantidade de areia, e triture-o;
Coloque a batata triturada no tubo 6 e o fervido no tubo 7
O que indica a efervescência notubo 5? 
Justifique as diferenças entre os resultados dos tubos 5 e 7, 5 e 6, 2 e 7?
Qual é a importância de se comparar o resultado do tubo 4 com os resultados dos tubos 5 e 6? 
Acrescente 1 cubo de fígado ao tubo 8;
Acrescente 5 fragmentos de folhas ao tubo 9
Acrescente 1 cubo de carne ao tubo 10.
QUESTÕES
Qual é a enzima responsável pela reação observada nos tubos 5, 6, 8, 9 e 10?
Em que organela ela ocorre?
Qual é a importância para os seres vivos?
Escreva a equação geral da reação catalisada por essa enzima.
		
				
PRÁTICA 12: NÚCLEO
Objetivos da aula:
Apresentar a organização estrutural do núcleo;
Estabelecer relações espaciais entre esse compartimento celular e as demais organelas;
Compreender como a cromatina é empacotada dentro do núcleo para formar os cromossomos;
Aprender um procedimento caseiro de preparo de DNA.
 Estrutura do Núcleo 
Micrografia eletrônica de transmissão de célula do pâncreas de rato (Fonte: Junqueira & Salles, 1975).
Cromatina 
Micrografias eletrônicas de transmissão da cromatina em vários estágios de compactação (Fonte: Alberts et al., 1997; Comarck, 1996).
 Nucléolo 
Micrografia eletrônica de transmissão do nucléolo (Fonte: Sobotta, 1997)
 Preparo de DNA de Cebola 
Cortar meia cebola média em cubinhos pequenos; paralelamente, preparar 250 ml de solução detergente com sal: colocar 50 ml de detergente de cozinha, acrescentar 7,5 g de sal e completar o volume com água de torneira; colocar a meia cebola cortada em um béquer e acrescentar 50 ml da solução detergente; Incubar a 60(C e misturar a solução por, aproximadamente, 15 minutos; Rapidamente, colocar a solução no gelo por alguns minutos; Filtrar a solução em filtro de café, passar 5 ml para um tubo de ensaio e ir acrescentado álcool absoluto lentamente; Observar o que acontece no tubo. Explique.
PRÁTICA 13. DIVISÃO CELULAR
1. Mitose 
Objetivos da aula:
Identificar as diferentes fases da Mitose em lâminas permanentes;
Preparar material para observação das fases da mitose;
Examine lâminas permanentes de raiz de cebola. 
Pegar raízes de cebola, que ficaram previamente em água durante alguns dias, transferir as pontas para frascos de vidro, contendo cerca de 2 dedos de orceína acética a 2%, tomando-se o cuidado para que todas as raízes estejam mergulhadas na solução; Prender o frasco com uma pinça de madeira e aquecê-lo no bico de Bunsen, até a fervura. Retirar do fogo e repetir a fervura três a quatro vezes; despejar a orceína-acética fervida com o material numa placa de Petri, separando então os pedaços de raiz; com o auxílio de uma pinça, colocar duas ou três pontas da raiz numa lâmina, sobre a qual estão uma ou duas gotas de orceína-acética; cobrir o material com lamínula; esmagar com a ponta do estilete. Proceder ao esmagamento do material entre duas folhas de papel de filtro, pressionando firmemente com o polegar, tendo o cuidado de não movimentar a lamínula. Identifique e desenhe as fases da divisão presentes na sua preparação.
II. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, DAVID M, RAFF M, ROBERTS K, PETER W. Molecular Biology of the Cell. New York. Garland Science. 6ª Ed. 2015.
ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., PETER, W. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed. 5ª Ed. 2010.
	
ALBERTS, B., BRAY, D. HOPKIN, K. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: Artmed. 3ª ed. 2011.
CARVALHO, H.F., RECCO-PIMENTEL, S.M. A célula. Barueri: Editora Manole. 3ª ed. 2012.
COOPER, G.M, HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem molecular. Porto Alegre: Artmed. 3ª ed. 2007.
jUNQUEIRA, l.c.u., sALLES, L.M.M. – ULTRA-ESTRUTURA E FUNÇÃO CELULAR. sÃO PAULO, EDGARD BLUCHER; RIO DE JANEIRO, GUANABARA KOOGAN; SÃO PAULO, UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. 1eD. 1975.
LODISH, h., berk, a., kaiser, c.a., krieger, m., bretscher, a., ploegh, h. amon, a. Biologia celular e molecular. Porto Alegre: Artmed.7ª ed, 2014.
Matioli, S.R. Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Editora Holos. 1 Ed. 2001.
MELO, R. C. N. Células & Microscopia: princípios básicos e práticas. Editora UFJF. 1 Ed. 2002. 
Sobotta, J. – Atlas colorido de citologia, histologia e anatomia microscópica humana. rio de janeiro, guanabara koogan. 5ED. 1997.