COLORAODEGRAM

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Coloração de GRAM 
MICROBIOLOGIA 
 
 
Introdução 
É um método de coloração de bactérias 
desenvolvido pelo médico dinamarquês 
Hans Christian Joachim Gram em 1884. 
Consiste no tratamento sucessivo de um 
esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, 
com os seguintes reagentes: 
Cristal – violeta 
Lugol 
Etanol – acetona 
Fucsina básica 
Finalidade 
 
Essa técnica permite a separação de 
amostras bacterianas em Gram-positivas 
e Gram-negativas 
 
 
Auxilia na determinação da morfologia das 
amostras analisadas. 
 
O método da coloração de Gram é 
baseado na capacidade das paredes 
celulares de bactérias Gram-positivas de 
reterem o corante cristal violeta no 
citoplasma durante um tratamento com 
etanol-acetona enquanto que as paredes 
celulares de bactérias Gram-negativas 
não o fazem. 
Importância clínica 
 Um dos mais importantes métodos de coloração 
utilizados em laboratórios clínicos 
 
 Primeiro passo para a identificação de amostras 
bacterianas 
 
 Muitas das bactérias associadas a infecções são 
prontamente observadas e caracterizadas como Gram – 
positivas ou Gram – negativas 
 
 Isso permite ao clínico monitorar a infecção até que 
dados da cultura estejam disponíveis 
Descrição da técnica 
 O método consiste no tratamento de uma amostra de uma 
cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com 
um corante primário, o cristal violeta, seguido de 
tratamento com um fixador, o lugol. 
 
 Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas 
absorvem de maneira idêntica o corante primário e o 
fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à 
formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, 
em seus citoplasmas. 
 
 
 Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o 
etanol-acetona (1:1). 
 
Gram – positivas: o solvente desidrata as 
espessas paredes celulares e provoca a 
contração dos poros do peptidoglicano, 
tornando-as impermeáveis ao complexo; o 
corante primário é retido e as células 
permanecem coradas. 
 
Gram negativas: O solvente dissolve a 
porção lipídica das membranas externas e 
o complexo cristal violeta-iodo é removido, 
descorando as células. 
 A etapa da descoloração é crítica. 
 
A exposição prolongada ao solvente irá 
provocar a remoção do cristal violeta dos dois 
tipos de bactérias, podendo produzir 
resultados falsos. 
 
A retenção ou não do corante primário é 
dependente das propriedades físicas e 
químicas das paredes celulares bacterianas. 
Em seguida, a amostra é tratada com um 
corante secundário, a fucsina básica. 
 
 
Ao microscópio, as células Gram-positivas 
aparecerão coradas em violeta escuro. 
 
 
As Gram-negativas em vermelho ou rosa 
escuro. 
 
Células de bactérias Gram-positivas, 
velhas, mortas ou com envelopes 
danificados por agentes físicos ou 
químicos, tendem a perder o cristal 
violeta. 
 
Então, uma mesma amostra bacteriana 
pode exibir parte ou todas as células 
coradas como Gram-negativas. 
 
Portanto, o uso de material fresco é 
importante. 
Técnica 
1 – Preparo do esfregaço 
 Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana 
a ser corada em uma gota de sol. salina a 0,85%, sobre 
uma lâmina de microscópio, espalhando a gota 
 
 Procedimento realizado com alça bacteriológica 
flambada 
 
 Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, 
flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um 
bico de Bunsen 
2 - Aplicação do corante primário 
 
Cobrir toda a sua superfície da lâmina 
com o corante cristal violeta. 
 
Deixar em repouso por um minuto. 
 
Descartar o excesso de corante ou 
enxaguar a lâmina com água. 
3 - Aplicação do fixador 
 
Cobrir toda a sua superfície da lâmina 
com lugol. 
 
Deixar em repouso por um minuto. 
 
Descartar o excesso do fixador ou 
enxaguar a lâmina com água. 
4 - Descoloração 
 
Com a lâmina inclinada, despejar algumas 
gotas de álcool-acetona para remover o 
complexo cristal violeta-lugol de células 
Gram-negativas. 
Este procedimento não pode exceder a 
cinco segundos. 
Em seguida, enxaguar a lâmina com água 
para remover excesso de solvente. 
5 - Aplicação do corante secundário 
 
Cobrir toda a sua superfície da lâmina 
com o corante fucsina básica. 
Deixar em repouso por um minuto. 
Enxaguar a lâmina com água e tocar as 
bordas com papel absorvente para 
remoção do excesso de água. 
Após secar, observar a lâmina ao 
microscópio. 
Resumindo... 
Controle de Qualidade 
O CQ aplica-se aos corantes utilizados na 
rotina de coloração e na execução da 
técnica. 
 
Para se certificar dos resultados obtidos, 
pode-se utilizar como controles uma 
bactéria Gram-positiva e uma Gram-
negativa, conhecidas. 
 
Sugere-se utilização de Bacillus subtilis e 
Escherichia coli. 
Bacilos Gram Positivos Bacillus subtilis 
Bacilos Gram Negativos Escherichia coli 
Cocos Gram Positivos Streptococcus oralis 
 Cocos Gram Negativos Neisseria gonorrhoeae